謝丹，李旖，查銀蓮，何櫻

（惠州市中心人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，廣東 惠州516001）

肺癌是最常見的癌癥死亡原因，占癌癥相關(guān)死亡的24%，診斷后5年生存率僅為15%。約85%肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌[1]。診斷時，大多數(shù)肺癌患者都存在一定程度的肺癌轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后惡化，而血管生成是肺癌進展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[1]。新生血管在癌組織中發(fā)揮營養(yǎng)和分解代謝物的作用，并促使腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此血管生成抑制劑被廣泛用于治療肺癌[2-4]。近年來文獻報道，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是血管生成的有效誘導(dǎo)劑，通過激活其下游信號分子，可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，從而促進血管生成，促進腫瘤進展[5]。

有文獻指出， B 淋巴細(xì)胞瘤2 （B cell lymphoma 2, Bcl-2）小分子抑制劑TW-37 具有抗血管生成活性，其可通過與Bcl-2 結(jié)合，從而抑制Bcl-2 和Bcl-2 家族促凋亡成員的異源二聚化，進而促進線粒體孔形成并誘導(dǎo)釋放細(xì)胞色素c 和啟動細(xì)胞凋亡，最終在體內(nèi)外抑制腫瘤的生長[6-7]。此外，Bcl-2 可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中酸酐酶Ⅸ、VEGF 和p-Akt的表達(dá)，其可通過信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）誘導(dǎo)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF 的表達(dá)，促進血管生成[8-9]，但是其靶分子和抗血管生成的確切機制尚未完全闡明。本研究旨在探討TW-37對肺癌細(xì)胞生長和血管生成的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

21 只BALB/cAnu/nu 小鼠（6～8 周）購自上海華源生物公司。人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC-1）和A549 肺癌細(xì)胞購自美國典型收藏物保藏中心。HMEC-1 細(xì)胞在含2 mmol/L 谷氨酰胺、10 ng/ml 表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor, EGF）、15% FBS 和抗生素（100 u/ml 青霉素，100 μg/ml 鏈霉素）的DEME 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，A549 肺癌細(xì)胞在含10% FBS 和抗生素（100 u/ml 青霉素，100 μg/ml鏈霉素）的RIPM 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞在5%CO2潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑胎牛血清購自浙江擎科生物技術(shù)公司，DEME 培養(yǎng)基、RIPM1640 培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購自美國Invitrogen 公司，TW-37 購自上海百奧萊博生物技術(shù)公司，血管生成檢測試劑盒、Transwell 小室和MTT 檢測試劑盒購自泉州市睿信生物科技有限公司，Caspase-3/7 檢測試劑盒購自美國Millipore 公司，Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自日本TaKaRa 公司，EGF 和VEGF 一抗購自上海Prime Gene 公司，VEGFR2 一抗購自上海百奧萊博生物科技有限公司，HIF-1α 和ERK 一抗購自美國Invitrogen 公司，CD31 抗體購自英國Abcam 公司，Ki67 抗體購自美國Abcam 公司，VEGF 抗體購自美國Santa Cruz 公司。

1.2.2 主要儀器BX51 型顯微鏡購自日本Olympus 公司，F(xiàn)ACSCalibur?型流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司，Applied Biosystems ViiA?7 型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀購自美國ABI 公司。

1.3 方法

1.3.1 雞胚絨毛尿囊膜（CAM）測定將受精卵在37℃、45%濕度下孵育。第7 天緩慢、輕輕地用砂輪磨除頂部蛋殼，并將該區(qū)域剝落，暴露出絨毛尿囊膜。分別用含0 μg/卵、50 μg/卵、100 μg/卵和150 μg/卵的TW-37鹽水浸泡濾紙（0.5 cm×0.5 cm），然后放在CAM 上，用無菌透明膠帶封閉后孵育3 d。每組10 個卵，使用甲醇和丙酮（1∶1）固定后通過顯微鏡拍攝CAM。

1.3.2 血管生成試驗將冷的基質(zhì)膠按50 μl/孔涂在96 孔板上，并在37℃條件下孵育以固化基質(zhì)膠。將HMEC-1 細(xì)胞按5×104個/孔的密度接種到基質(zhì)膠上，使用不同劑量（0 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L）TW-37 處理2 h 后在37℃條件下孵育過夜。將HMEC-1 細(xì)胞接種在含或不含VEGF （100 ng/ml） 和TW-37 （8 μmol/L） 的 生 長因子還原基質(zhì)膠上，孵育12 h。用顯微鏡拍攝并記錄毛細(xì)管生成情況。

1.3.3 細(xì)胞遷移和侵襲測定①細(xì)胞遷移測定：將HMEC-1 細(xì)胞按1.5×105個/孔接種在含不同劑量TW-37（0 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L）的100 μl 無血清培養(yǎng)基中。下腔室包含相同的培養(yǎng)基，含15% FBS。溫育8 h 后，將遷移的細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色，并用棉簽清潔膜的上表面以除去未遷移的細(xì)胞，拍照并記錄遷移的細(xì)胞。②細(xì)胞侵襲測定：將基質(zhì)膠解凍并在無血清冷培養(yǎng)基中稀釋至5 mg/ml，將80 μl 稀釋的基質(zhì)膠添加到上腔室中。在37℃條件下孵育5 h，將凝膠狀的Matrigel 用溫和的無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌。后續(xù)步驟與細(xì)胞遷移測定相同。孵育24 h 后進行固定和染色，拍照并記錄侵襲細(xì)胞。

1.3.4 MTT 增殖測定用8 μmol/L TW-37（TW-37組）或二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）（對照組）處理HMEC-1 細(xì)胞4 h。將細(xì)胞按1×104個/孔的密度接種在96 孔培養(yǎng)板上，室溫孵育24 h，每孔添加50 μl MTT 測試溶液，使用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測量并記錄吸光度值，拍照并記錄增殖細(xì)胞。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)用胰蛋白酶消化TW-37 組和對照組HMEC-1 細(xì)胞。按照試劑盒說明書，使用Muse?Annexin V、Cell Cycle 和Caspase-3/7 試劑盒制備樣品，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.3.6 免疫熒光染色將TW-37 組和對照組HMEC-1 細(xì)胞用4% 多聚甲醛固定15 min，0.3%Triton Ⅹ-100滲透并用5% BSA在PBS中封閉1 h，用鬼筆環(huán)肽染色以可視化F-肌動蛋白絲，細(xì)胞室溫孵育1h，用DAPI 復(fù)染色30 h，在熒光顯微鏡下分析顯微照片。

1.3.7 qRT-PCRTW-37組、對照組HMEC-1細(xì)胞培養(yǎng)6 h、12 h 和24h。采用Trizol 試劑提取培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶從2 μg總RNA中合成互補DNA。使用SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行qRT-PCR 反應(yīng)，qRT-PCR 反應(yīng)條件：95℃變性30 s，然后進行40 個循環(huán)，95℃變性3 s，57℃退火和延伸30 s。實驗重復(fù)3 次，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達(dá)量。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.8 蛋白免疫印跡法用裂解緩沖液溶解HMEC-1 細(xì)胞。蛋白樣品通過SDS-PAGE 凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將印跡與EGF 一抗（1∶500）、VEGF 一抗（1∶500）、HIF-1α 一抗（1∶500）、ERK 一抗（1∶500）在4℃孵育過夜。與辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠二抗（1∶100）室溫孵育2 h 后，使用增強的化學(xué)發(fā)光試劑進行信號檢測，以GAPDH 為內(nèi)參，使用Image J 軟件對數(shù)據(jù)進行量化和歸一化。

1.3.9 異種移植模型與免疫組織化學(xué)染色皮下注射A549 癌細(xì)胞（5×106個/只）到BALB/cAnu/nu 小鼠中，異種移植動物分別經(jīng)尾靜脈注射鹽水或不同劑量的TW-37（0.5 mg/kg 和10.0 mg/kg），1 次/d，每組7 只。治療第27 天，處死小鼠，稱重并拍照。收集并切除腫瘤，4%中性多聚甲醛固定，對羥基苯甲酸酯包埋，切片并進行免疫組織化學(xué)染色。采用CD31 抗體免疫染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞，Ki67 抗體染色確定細(xì)胞增殖，VEGF 抗體染色顯示VEGF 表達(dá)。使用Image Pro Plus 軟件對切片進行半定量圖像分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，方差分析的兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TW-37 抑制血管新生及HMEC-1 細(xì)胞的遷移和侵襲

與對照組相比，TW-37 組以劑量依賴的方式降低微血管密度（見圖1A），削弱HMEC-1 細(xì)胞生成毛細(xì)血管的能力（見圖1B），同時以劑量依賴的方式抑制HMEC-1 細(xì)胞的遷移（見圖1C）和侵襲（見圖1D）。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，對照組細(xì)胞中F-肌動蛋白以線性模式規(guī)則組裝，并基本上以平行的方式穿過；而TW-37 組細(xì)胞中F-肌動蛋白變?yōu)榉稚⑿?，?yīng)力纖維處于混亂狀態(tài)或部分消失，表明TW-37 可引起HMEC-1 細(xì)胞中F-肌動蛋白解聚。見圖2。

圖1 TW-37在體內(nèi)外抑制血管生成及HMEC-1細(xì)胞的遷移和侵襲

圖2 TW-37對F-肌動蛋白分布的影響（×200）

2.2 TW-37抑制VEGF誘導(dǎo)的體外血管生成

與對照組相比，100 ng/ml VEGF可誘導(dǎo)HMEC-1細(xì)胞生成毛細(xì)血管。而再加入TW-37 后，可明顯抑制VEGF 誘導(dǎo)的毛細(xì)血管生成。見圖3。

2.3 TW-37抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

TW-37 組與對照組細(xì)胞凋亡率、增殖率、侵襲情況比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。對照組與TW-37組G1期、S期細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2和圖4～6。

表2 兩組細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及細(xì)胞周期分析 （±s）

表2 兩組細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及細(xì)胞周期分析 （±s）

/（個/Hp）細(xì)胞周期/（個/Hp）G1期S期±0.12 1.00±0.06 1.00±0.08±0.03 2.56±0.28 0.65±0.09 926 8.391 9.103 P 值0.001 0.013 0.024 0.028 0.016

圖4 各組流式細(xì)胞圖

圖5 TW-37抑制細(xì)胞增殖 （×100）

圖6 TW-37抑制細(xì)胞遷移 （×100）

2.4 TW-37抑制VEGF和ERK的激活

對照組與不同時間點TW-37 組的VEGF、ERK蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。對照組和不同時間點TW-37 組的p-VEGF、p-ERK 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與對照組比較，不同時間點TW-37 組的p-VEGF、p-ERK 蛋白相對表達(dá)量較低（P<0.05）。見表3 和圖7。

對照組與不同質(zhì)量濃度TW-37 組的VEGF、ERK 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。對照組與不同質(zhì)量濃度TW-37組的p-VEGF、p-ERK蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與對照組比較，不同質(zhì)量濃度TW-37 組的p-VEGF、p-ERK 蛋白相對表達(dá)量較低（P<0.05）。見表4 和圖8。

表3 對照組與8 μmol/L TW-37組處理不同時間后細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表3 對照組與8 μmol/L TW-37組處理不同時間后細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

注：?與對照組比較，P<0.05。

組別p-VEGF VEGF p-ERK ERK對照組TW-37組6 h 12 h 24 h 0.63±0.08?0.54±0.06?0.39±0.01?0.61±0.07?0.47±0.07?0.45±0.03?0.99±0.11 0.91±0.08 0.86±0.11 0.93±0.12 1.09±0.08 1.12±0.17 F 值P 值1.00±0.12 1.00±0.08 1.00±0.10 1.00±0.09 29.229 0.000 45.717 0.000 1.097 0.374 2.519 0.135

表4 對照組與不同質(zhì)量濃度TW-37組處理12 h后細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表4 對照組與不同質(zhì)量濃度TW-37組處理12 h后細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

注：?與對照組比較，P<0.05。

組別p-VEGF VEGF p-ERK ERK對照組TW-37組4 μmol/L 6 μmol/L 8 μmol/L 0.62±0.04?0.52±0.01?0.41±0.03?0.53±0.02?0.47±0.01?0.39±0.03?0.82±0.03 0.92±0.07 0.79±0.08 1.11±0.09 0.99±0.11 1.26±0.13 F 值P 值1.00±0.15 1.00±0.09 1.00±0.11 1.00±0.09 31.802 0.000 80.222 0.000 4.558 0.053 1.879 0.208

2.5 TW-37下調(diào)VEGF及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

圖7 對照組與TW-37組（8 μmol/L）處理不同時間后細(xì)胞中蛋白的表達(dá)

對照組與TW-37 組HIF-1α、AP-1 及AP-2 的mRNA相對表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），TW-37組低于對照組。見表5和圖9。

圖8 對照組與不同質(zhì)量濃度TW-37組處理12 h后細(xì)胞中蛋白的表達(dá)

圖9 TW-37下調(diào)HMEC-1細(xì)胞中VEGF及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

表5 各組HIF-1α、AP-1及AP-2的mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

表5 各組HIF-1α、AP-1及AP-2的mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

組別HIF-1α AP-1 AP-2對照組TW-37組t 值P 值1.00±0.09 0.37±0.01 12.970 0.000 1.00±0.12 0.42±0.02 11.081 0.000 1.00±0.11 0.61±0.02 8.991 0.009

2.6 TW-37在體內(nèi)阻礙腫瘤生長和血管生成

對照組與TW-37 組（0.5 mg/kg 和10.0 mg/kg）小鼠的腫瘤體積、增殖標(biāo)志物Ki67 和微血管密度標(biāo)志物CD31 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與對照組比較，TW-37 組（0.5 mg/kg 和10.0 mg/kg）腫瘤體積、Ki67 和CD31 均較低（P<0.05）； 與TW-37 組（0.5 mg/kg）比較，TW-37 組（10.0 mg/kg）腫瘤體積、Ki67 和CD31 均較低（P<0.05）。3 組小鼠的VEGF 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表6 和圖10～12。

表6 對照組與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TW-37組小鼠的腫瘤體積、Ki67、CD31、VEGF蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表6 對照組與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TW-37組小鼠的腫瘤體積、Ki67、CD31、VEGF蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

注：?與對照組比較，P<0.05。

組別腫瘤體積/mm3 Ki67 CD31 VEGF對照組TW-37組0.5 mg/kg 10.0 mg/kg F 值P 值600±132 1.00±0.13 1.00±0.09 1.00±0.18 387±72?326±43?53.307 0.000 0.66±0.03?0.24±0.01?51.897 0.000 0.69±0.05?0.37±0.01?184.002 0.000 0.92±0.08 0.98±0.23 1.191 0.311

圖10 各組小鼠背側(cè)接種A549細(xì)胞27 d后的腫瘤

圖11 TW-37在體內(nèi)阻礙腫瘤的生長和血管生成（免疫組織化學(xué)染色×200）

圖12 小鼠腫瘤組織中VEGF的表達(dá)

3 討論

肺癌是最具侵襲性的癌癥之一，預(yù)后很差。流行病學(xué)統(tǒng)計顯示，在中國每年有33 000 例患者死于肺癌[10]。絕大多數(shù)患者出現(xiàn)大轉(zhuǎn)移或微小轉(zhuǎn)移，需要有效的藥物治療。然而，現(xiàn)有的常規(guī)化學(xué)治療與手術(shù)切除難以滿足臨床需求，迫切需要新的治療方法[11-12]。在肺癌轉(zhuǎn)移過程中血管的新生至關(guān)重要，新生血管通過為腫瘤組織供血、供氧及傳輸營養(yǎng)物質(zhì)而在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而干擾血管生成為一種有效的抗腫瘤治療策略[13]。

在腫瘤誘導(dǎo)的血管生成早期，大量的VEGF 從癌細(xì)胞中釋放出來，然后與內(nèi)皮細(xì)胞中的VEGF 2型受體（VEGFR2） 結(jié)合，從而激活下游效應(yīng)因子，促進血管新生。研究指出，生長因子通過與VEGFR2 受體結(jié)合，誘導(dǎo)其磷酸化和二聚化，從而導(dǎo)致下游信號通路激活，促進血管生成[14]。而VEGFR2 的負(fù)調(diào)節(jié)對于抑制血管生成，包括腫瘤新血管生成具有重要意義，被認(rèn)為是限制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的重要靶點，在血管生成中起關(guān)鍵作用[15]。因此，靶向VEGF 及其受體是一種有效的抗腫瘤治療策略。而本研究結(jié)果表明，VEGF 可以促進HMEC-1 細(xì)胞生成毛細(xì)血管，而TW-37 能夠抑制VEGF 誘導(dǎo)的毛細(xì)血管生成。

VEGF 的表達(dá)受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，包括HIF-1α、AP-1、AP-2、SP-1 和STAT3[16]。HIF-1α是一種異型二聚體反式激活因子，是控制VEGF 表達(dá)和分泌的主要轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)涉及血管生成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)[17-18]。HIF-1 由α 和β亞基組成，HIF-1α 是在常氧條件下限制VEGF基因轉(zhuǎn)錄速率的限制性亞基[19-22]。此外，有研究指出，Bcl-2 通過Raf-1/MEKK-1 介導(dǎo)的IKKβ 活化的信號傳導(dǎo)機制激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[22-25]。本研究中蛋白免疫印跡法和qRT-PCR 反應(yīng)結(jié)果顯示，TW-37 能夠通過抑制VEGFR2 和ERK 的磷酸化激活，下調(diào)VEGF 轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α、AP-1 和AP-2 的轉(zhuǎn)錄水平，抑制HIF-1α 蛋白的表達(dá)，進而抑制VEGF 誘導(dǎo)的毛細(xì)血管生成。此外，本研究結(jié)果顯示，TW-37 通過靶向ERK 抑制HIF-1α 的表達(dá)，從而下調(diào)VEGF 水平，抑制HMEC-1 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮其對血管生成的抑制作用，提示ERK/MAPK 信號通路對毛細(xì)血管生成有重要意義。而細(xì)胞增殖實驗顯示，TW-37可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞的克隆形成能力；其次，體內(nèi)實驗結(jié)果進一步表明TW-37 可以抑制腫瘤進展，并抑制血管生成，表現(xiàn)為微血管密度標(biāo)志物CD31 的表達(dá)下調(diào)；最后，對照組與TW-37 組大鼠的VEGF 蛋白相對表達(dá)量無差異，可能是因為TW-37 在體內(nèi)多為抑制內(nèi)皮細(xì)胞的功能，而未影響腫瘤細(xì)胞的功能。

綜上所述，TW-37 可以通過靶向ERK，抑制包括HIF-1α 在內(nèi)的VEGF 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而下調(diào)VEGF 水平，抑制HMEC-1 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮其對血管生成的抑制作用，并誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡，抑制肺癌細(xì)胞的增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。