王金林，王萬良,張忭忭,2，譚大明

(1.西藏自治區(qū)農牧科學院水產科學研究所，西藏 拉薩 850000；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 楊浦區(qū) 200000；3.西藏自治區(qū)農牧科學院農業(yè)資源與環(huán)境研究所，西藏 拉薩 850000)

亞東鮭(Salmontrutta)，俗稱花點魚，隸屬于鮭形目、鮭科、鮭屬，由英國人于19世紀引進西藏亞東縣，距今約有150多年歷史，現(xiàn)已成為一個地方性養(yǎng)殖品種，國內僅分布于西藏日喀則市亞東縣亞東河[1-4].該魚因肉質細嫩、營養(yǎng)豐富而深受消費者喜愛，2014年被農業(yè)部批準為國家農產品地理標志產品[5].近些年，由于人類過度干攏，造成部分河流生境片段化和破碎化[6]，導致西藏土著魚類自然資源量急劇減少.亞東鮭于1992年被列為西藏二級重點水生野生保護動物.近年當地相關部門開展了人工增殖放流工作，對亞東鮭種質資源保護與種群維系起到了一定作用[7].目前有關亞東鮭的研究報道主要集中在繁殖生物學[8]、分子生物學[9-12]、養(yǎng)殖生物學[13-15]、生理生化及飼料營養(yǎng)[16-17]等方面.但由于亞東鮭引種時間較長，種質資源退化現(xiàn)象十分嚴重，為了在資源調查及人工大規(guī)模選育操作過程中降低死亡率，開展麻醉試驗對其資源保護與產業(yè)化發(fā)展具有十分重要的意義.

在水產養(yǎng)殖領域使用麻醉劑的主要目的是保持麻醉對象相對安靜，減少應激損傷.其作用機理是通過抑制魚的中樞和周圍神經系統(tǒng)沖動，使麻醉對象暫時失去知覺，當麻醉藥物通過新陳代謝排除后又可復蘇，并能恢復正常生理活動[18].MS-222和丁香酚是水產養(yǎng)殖中常用的魚用麻醉劑，目前已成功應用于中華鱘(Acipensersinensis)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)等魚類[19].MS-222俗稱魚安定，化學名稱為間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，白色粉末狀，易溶于水，具有見效快、復蘇時間短、安全性高、對處理過的水產動物及人體接觸無害等特點，在全世界被廣泛應用；丁香酚是一種植物香料，其分子式為C10H12O2，淡黃色微稠液體，具有強烈的丁香氣味，可溶于乙醇等非極性溶劑，廣泛存在于丁香油、樟腦油和肉桂葉油等芳香油中，其優(yōu)點是成本較低、毒性小[20-21].本文通過MS-222和丁香酚對亞東鮭魚種進行麻醉效果比較試驗，分析了不同水溫和空氣暴露時間對亞東鮭魚麻醉效果的影響，明確適宜的麻醉劑和安全使用濃度，以期為亞東鮭采樣、人工生產選育和增殖放流標記等提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2020年10月在西藏雅魯藏布江魚類資源繁育基地實驗室進行，選擇體色正常、體表完整、體格健壯、活力強的人工繁育魚種，平均體質量為(143.2±7.44)g.試驗水源為地下水，經沉淀、曝氣、紫外殺菌后流入圓形玻璃缸中(直徑1 m，水深0.5 m)暫養(yǎng)，溶解氧質量濃度7.5 mg/L，pH 7.6，水溫(12±0.5)℃，試驗開始前48 h禁止投喂.

1.2 試驗裝置及藥品

試驗容器為0.4 m×0.2 m×0.5 m亞克力材質魚缸，連續(xù)曝氣供氧，保持溶解氧質量濃度≥7 mg/L.MS-222(杭州動物藥品廠)：白色粉末，易溶于水，使用時直接稱量(精確至0.000 1g).丁香酚(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)：相對分子量為164.2，純度≥99%，淡黃色液體.參照郝長杰等[22]方法，使用時與乙醇按體積比1∶5溶于乙醇后再溶于水.

1.3 麻醉和復蘇過程分期及預試驗設置

參照劉長林等[23]劃分標準，結合預試驗結果對亞東鮭麻醉和復蘇過程進行分期.麻醉階段分為A0～A6共7個階段，包括正常期(未使用麻醉劑魚體狀態(tài))，復蘇階段劃分為R1～R4共4個階段，具體劃分標準見表1.當魚體失去平衡，腹面朝上，相對靜止不動，鰓蓋張合降低但連續(xù)，即判斷為麻醉期(A4)；當魚體能夠正常游泳，恢復對外界刺激反應，將魚體側置后緩緩恢復平衡，即判斷為魚已復蘇(R3).

表1 亞東鮭麻醉和復蘇過程分期及主要行為特征

1.4 MS-222和丁香酚對亞東鮭魚種麻醉及復蘇時間的確定

根據預試驗對亞東鮭麻醉及復蘇進行分析，參考麻醉藥物使用劑量，設置MS-222濃度梯度為100、110、120、130、140、150、160 mg/L 7個梯度組，丁香酚濃度梯度為50、60、70、80、90、100、110 mg/L 7個梯度組.試驗開始前將魚放在容器中適應10 min，每組放魚30尾，各設3個平行，每個平行10尾.放入麻醉劑后迅速攪拌水體，仔細觀察魚體麻醉狀態(tài)，一旦達到A6期，及時撈出，并迅速放入提前曝氣增氧的備用容器中自然復蘇，準確記錄麻醉和復蘇時間，并統(tǒng)計24 h成活率.試驗期間水溫(12±0.5)℃.

1.5 不同水溫條件下MS-222和丁香酚對亞東鮭魚種的麻醉效果

根據1.3和1.4的試驗結果，設置水溫(8±0.5)、(10±0.5)、(12±0.5)、(14±0.5)、(16±0.5) ℃.將魚放入容器后，低溫采用冰塊降溫，每小時降低1 ℃，高溫采用加熱棒調控，每小時升溫1 ℃，達到溫度標準后適應0.5 h后開始試驗.參考李偉業(yè)等[23]確定最適麻醉藥物效果劑量，選擇130 mg/L MS-222和60 mg/L丁香酚進行麻醉效果試驗，每組放魚30尾，各設3個平行，每個平行10尾，準確記錄麻醉(A6) 和復蘇時間(R4)，并記錄24 h成活率.

1.6 不同空氣暴露時間MS-222和丁香酚對亞東鮭魚種的麻醉效果

根據1.3和1.4的試驗結果，選擇130 mg/L MS-222和60 mg/L丁香酚進行麻醉效果試驗.設置空氣暴露時間為0、5、10、15、20、25 min，每組放魚30尾，各設3個平行，每個平行10尾，水溫12 ℃，麻醉至A6后快速撈出，用濕潤的毛巾包裹，僅頭部暴露在空氣中，準確記錄復蘇時間和24 h成活率.

1.7 數據處理

所有數據采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，用Duncan法進行顯著性分析和多重比較，并用Excel 2010軟件作圖.

2 結果與分析

2.1 亞東鮭預試驗麻醉效果

MS-222為10、25、40 mg/L時，麻醉最終狀態(tài)分別達到輕度鎮(zhèn)定期(A1)、深度鎮(zhèn)定期(A2)、麻醉期(A4)；MS-222為55～85 mg/L時，麻醉最終狀態(tài)均能達到延髓麻醉期(A6)，且麻醉時間呈遞減趨勢，復蘇時間呈遞增趨勢，24 h成活率為100%.丁香酚為5、10 mg/L時，麻醉最終狀態(tài)分別達到輕度麻醉期(A3)、麻醉期(A4)；丁香酚為15～40 mg/L時，麻醉最終狀態(tài)均能達到延髓麻醉期(A6)，且麻醉時間呈遞減趨勢，復蘇時間呈遞增趨勢，24 h成活率為100%(表2).

表2 MS-222和丁香酚預試驗麻醉效果分期統(tǒng)計表

2.2 MS-222和丁香酚對亞東鮭魚種麻醉效果的有效濃度

MS-222對亞東鮭的有效麻醉濃度如圖1所示.在水溫(12±0.5)℃條件下，隨著MS-222質量濃度升高，亞東鮭魚種麻醉時間逐漸縮短，100 mg/L的麻醉時間較長，且各質量濃度之間差異顯著(P<0.05)，麻醉時間與質量濃度最佳擬合關系式為：y=-0.65x2- 44.99x+360.87，R2=0.988 7；復蘇時間隨著質量濃度升高逐漸遞增，100 mg/L復蘇時間最短，與110、120 mg/L之間差異不顯著(P>0.05)，但顯著低于其他各組(P<0.05)，140、150、160 mg/L之間差異顯著(P<0.05)，24 h復蘇率均為100%，復蘇時間與質量濃度最佳擬合關系式為：y=11.69x2-36.80x+179.79，R2=0.982 7.

丁香酚對亞東鮭有效麻醉濃度如圖2所示.在水溫(12±0.5) ℃條件下，隨著丁香酚質量濃度升高，亞東鮭魚種麻醉時間逐漸縮短，50 mg/L麻醉時間較長，且各質量濃度之間差異顯著(P<0.05)，麻醉時間與質量濃度最佳擬合關系式為：y=0.97x2-30.32x+213.27，R2= 0.989 4；復蘇時間隨著質量濃度升高依次遞增，110 mg/L復蘇時間較長，各組之間差異顯著(P<0.05)，24 h復蘇率均為100%，復蘇時間與質量濃度最佳擬合關系式為：y=-2.58x2+90.07x+381.13，R2=0.980 3.

圖1 不同濃度MS-222對亞東鮭(Salmon trutta)麻醉時間和復蘇時間的影響Figure 1 Effects of different concentrations of MS-222 on anesthesia time and resuscitation time of S.trutta

2.3 不同水溫對MS-222和丁香酚麻醉效果的影響

不同水溫對MS-222麻醉效果的影響如圖3所示.隨著水溫的升高，麻醉時間依次遞減，8 ℃麻醉時間較長，16 ℃麻醉時間相對較短，各組之間差異顯著(P<0.05)；復蘇時間隨著水溫的升高依次遞減，8 ℃復蘇時間較長，16 ℃復蘇時間相對較短，各組之間差異顯著(P<0.05).

不同水溫對丁香酚麻醉效果的影響如圖4所示.隨著水溫的升高，麻醉時間依次遞減，8 ℃麻醉時間較長，16 ℃麻醉時間相對較短，各組之間差異顯著(P<0.05)；復蘇時間隨著水溫的升高依次遞減，8、10 ℃復蘇時間差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)，12、14、16 ℃各組之間差異顯著(P<0.05).

圖2 不同濃度丁香酚對亞東鮭(Salmon trutta)麻醉時間和復蘇時間的影響Figure 2 Effects of different concentrations of clove oil on anesthesia time and resuscitation time of S.trutta

圖3 不同水溫條件下MS-222對亞東鮭(Salmon trutta)麻醉效果的影響Figure 3 Effect of MS-222 on anesthetic efficacy of Salmon trutta at different water temperature

圖4 不同水溫條件下丁香酚對亞東鮭(Salmon trutta)麻醉效果的影響Figure 4 Effect of clove oil on anesthetic efficacy of Salmon trutta at different water temperature

2.4 空氣暴露時間對MS-222和丁香酚麻醉效果的影響

隨著空氣暴露時間增加，MS-222對亞東鮭魚種麻醉后復蘇時間依次遞增，各組之間差異顯著(P<0.05)，在0～20 min內，復蘇成活率為100%；當空氣暴露時間達到25 min時，成活率僅為66.7%(圖5).隨著空氣暴露時間增加，丁香酚對亞東鮭魚種麻醉后復蘇時間呈先降低后遞增變化趨勢，且各組之間差異顯著(P<0.05)，在0～15 min內，復蘇成活率為100%；當空氣暴露時間達到20、25 min時，成活率分別下降至60.0%、20%(圖6).

圖5 不同空氣暴露時間條件下MS-222對亞東鮭(Salmon trutta)麻醉效果的影響Figure 5 Effects of MS-222 on anesthetic efficacy of Salmon trutta at different air exposure time

圖6 不同空氣暴露時間條件下丁香酚對亞東鮭(Salmon trutta)麻醉效果的影響Figure 6 Effects of clove oil on anesthetic efficacy of Salmon trutta at different air exposure time

3 討論

3.1 MS-222和丁香酚對亞東鮭的麻醉效果

目前常用的魚用麻醉劑有30多種，包括MS-222、丁香酚、2-苯氧乙醇和硫酸喹哪啶等[23].在漁業(yè)生產和科學實驗研究過程中，可以根據不同目的進行不同程度麻醉腦部感覺中樞系統(tǒng)，使魚類降低新陳代謝或失去反射動作，從而減少應激活動和呼吸代謝，以此提升其成活率[25-26].通常魚類種類、個體大小及水質差異均對麻醉效果產生一定影響.

一般處于深度鎮(zhèn)靜期狀態(tài)下的魚體對外界反應能力很弱，有利于生產運輸.本試驗結果發(fā)現(xiàn)，MS-222質量濃度在0～25 mg/L時，亞東鮭魚體處于深度鎮(zhèn)定期范圍內；而丁香酚質量濃度在5 mg/L時，亞東鮭魚體進入輕度麻醉期；可見與MS-222相比，亞東鮭對丁香酚極為敏感，這與王文豪等[27]在大口黑鱸幼魚模擬運輸試驗中的麻醉效果相似.另外，MS-222和丁香酚均能在短時間內使亞東鮭快速進入麻醉狀態(tài)，抑制其活動能力，降低應激反應；且隨著MS-222和丁香酚濃度增加，亞東鮭魚種麻醉時間縮短，復蘇時間延長，表明相同條件下麻醉劑劑量越大，魚體麻醉程度越深，入麻時間越短，復蘇時間越長，這與大多數學者研究結果一致[24].

有學者認為，魚類最適麻醉質量濃度為3 min內完全麻醉，5 min內恢復自然狀態(tài)[24].按照此標準，郝長杰等[22]麻醉試驗結果表明，MS-222質量濃度為120～140 mg/L、丁香酚質量濃度為60～70 mg/L時，對暗紋東方鲀(Takifuguobscurus) 幼魚具有最適的麻醉效果；而王文豪等[27]報道MS-222和丁香酚對大口黑鱸(Micropterussalmoides) 幼魚的理想麻醉質量濃度分別為70、16 mg/L.本試驗結果顯示，MS-222對亞東鮭魚種的最適麻醉質量濃度為130～140 mg/L，而丁香酚在60～110 mg/L范圍內均能在180 s內麻醉，但復蘇時間均超過300 s，無法達到最適麻醉狀態(tài)，這表明魚的種類差異導致麻醉效果不同，大口黑鱸對MS-222和丁香酚極為敏感，所以其麻醉的質量濃度遠低于亞東鮭和暗紋東方鲀；另外，用丁香酚麻醉亞東鮭后復蘇時間比暗紋東方鲀要長很多，可能是由于暗紋東方鲀長期在海水中生存造成生活習性不同所致，但具體原因有待進一步研究.因此，建議應根據不同魚類選用適宜的麻醉劑，并建立相應的魚類麻醉劑使用標準，引導麻醉劑的安全使用和管理，促進水產養(yǎng)殖產業(yè)健康發(fā)展和漁業(yè)資源的有效保護.

3.2 水溫對MS-222和丁香酚麻醉效果的影響

魚類屬于變溫動物，一般情況下隨著水溫升高，魚體新陳代謝增強，呼吸頻率加快，耗氧量增加，機體酶活性升高[28].有研究結果表明，隨著水溫下降，魚體入麻時間縮短，麻醉效果隨水溫的降低而增加，低溫本身對魚體具有麻醉作用[29-30].本試驗結果顯示，隨著水溫降低，MS-222和丁香酚的麻醉時間和復蘇時間延長，與上述報道結果不一致，主要原因是亞東鮭屬于冷水性魚類，最適生存水溫為13～18 ℃，在一定范圍內水溫越低，亞東鮭新陳代謝降低，單位時間內機體攝入麻醉劑劑量減少，從而導致相同濃度MS-222和丁香酚對其麻醉時間延長；另外，通過觀察，高水溫中復蘇后的亞東鮭魚種活動力比低水溫中的強，可能原因是隨著水溫上升，亞東鮭機體酶活性增強，顯著提升了肝臟降解麻醉劑能力，從而復蘇時間相應縮短.因此，水溫對魚體麻醉及復蘇效果不僅與麻醉劑種類有關，且與魚的生活習性及最適生存水溫有關，其作用機制還有待進一步深入研究.

3.3 空氣暴露時間對深度麻醉亞東鮭魚種復蘇時間的影響

已有研究報道，適宜質量濃度麻醉劑延髓麻醉魚體后，在空氣中暴露一段時間，不會造成魚類死亡，仍能保持較高的成活率[31]，這對魚體離水操作具有十分重要的意義.劉艷超等[32]、王萬良等[33]開展了在空氣暴露不同時間，MS-222和丁香酚對異齒裂腹魚(Schizothoraxoconnori) 麻醉效果試驗，結果顯示在空氣中暴露0～15 min，大規(guī)格異齒裂腹魚復蘇時間各組之間差異不顯著，而小規(guī)格各組之間差異顯著；采用丁香酚深度麻醉后，隨著空氣中暴露時間延長，復蘇時間呈現(xiàn)遞增趨勢，且在0～35 min內成活率仍能保持100%.

本試驗結果表明，經MS-222脊髓麻醉期后，隨著空氣暴露時間延長，亞東鮭魚種復蘇時間遞增，且在0～20 min成活率為100%，各組之間差異顯著，到25 min后成活率降低，這與上述小規(guī)格異齒裂腹魚的試驗結果相似；而經丁香酚進行延髓麻醉期后，隨著空氣暴露時間延長，亞東鮭復蘇時間呈先降低后遞增變化趨勢，各組之間差異顯著，且在0～15 min復蘇成活率為100%；當空氣暴露時間達到20、25 min時，成活率分別為60.0%和20%，與上述試驗結果差異較大，其主要原因可能是二者體皮膚系統(tǒng)代謝功能存在差異，加之麻醉劑效果分期不同，從而導致亞東鮭空氣暴露后復蘇時間縮短.由此可知，在資源調查、離水采樣及增殖放流標記時，MS-222比丁香酚具有更好的麻醉效果.

4 小結

與丁香酚相比，MS-222對亞東鮭魚種麻醉效果較好，能夠達到最適麻醉要求標準，建議生產實踐中選擇使用MS-222淺麻質量濃度25 mg/L、深麻質量濃度為130 mg/L，麻醉適宜水溫12～16 ℃，空氣暴露時間小于20 min.