董 倩 葉旭文 楊 靜 王文明 趙亞琴 楊斌盛

(山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006)

中心蛋白是首次在單細(xì)胞綠藻中發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的鈣離子結(jié)合蛋白，屬于鈣調(diào)蛋白家族[1]。它廣泛存在于真核生物中，如酵母[2]、無脊椎動物[3]、高等植物[4]、哺乳動物[5]等，是很多生物的中心體重要組成部分，在細(xì)胞分裂過程中起著重要作用。中心蛋白含有4個EF-手結(jié)構(gòu)域，每個EF-手結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合一個鈣離子。當(dāng)?shù)鞍捉Y(jié)合鈣離子后，蛋白構(gòu)象變得更加開放，疏水區(qū)暴露，有利于蛋白和靶肽之間的結(jié)合[6]。Tb3+具有與Ca2+相似的配位化學(xué)性質(zhì)，但是其與蛋白質(zhì)結(jié)合后出現(xiàn)明顯的熒光敏化。因此常常被用作Ca2+結(jié)合蛋白的離子探針[7]。

八肋游仆蟲中心蛋白由168個氨基酸殘基組成，其分子量約為20 kD。本實驗室使用Tb3+熒光探針、蛋白質(zhì)片段等多種方法研究表明，生理條件下每個蛋白質(zhì)分子可結(jié)合4個Ca2+，Tb3+與Ca2+占據(jù)相同的結(jié)合位點，Ⅲ、Ⅳ位點屬于蛋白和金屬離子結(jié)合的高親和位點；蛋白與金屬離子結(jié)合后使得蛋白質(zhì)從封閉狀態(tài)到開放狀態(tài)，從而導(dǎo)致疏水表面暴露，蛋白質(zhì)聚集；八肋游仆蟲中心蛋白的N端在金屬離子介導(dǎo)的聚集過程中扮演了重要的角色[8]，而與靶肽的結(jié)合完全發(fā)生于C端[9]；中心蛋白還可以參與核苷酸切除修復(fù)[10]。

鹽酸氯丙嗪(CPZ)是一種吩噻嗪類臨床藥物[11]，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。它主要作為抗組胺藥和安定劑使用，是一種具有多種作用的通用型抗精神病藥。其一個重要特征是可以在不損傷人的大腦意識的情況下控制過度興奮和狂躁，改變精神病患者的異常行為。小劑量的CPZ也可以緩解嘔吐,對于鎮(zhèn)定、降溫和抗休克效果明顯。此外，在生物醫(yī)學(xué)研究中CPZ常被用作為鈣調(diào)蛋白抑制劑[12]，可以與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，從而抑制鈣調(diào)蛋白的功能。本實驗室曾報道另一種吩噻嗪類臨床藥物——三氟拉嗪與八肋游仆蟲中心蛋白N端半分子的結(jié)合及對蛋白質(zhì)功能的影響[13]。本文報道CPZ與八肋游仆蟲中心蛋白C端半分子的結(jié)合及對蛋白質(zhì)功能的影響，深入了解其在分子水平上的相互作用，有助于理解藥物結(jié)合的熱力學(xué)和機制，可以為醫(yī)學(xué)研究做出一定的貢獻。

圖1 鹽酸氯丙嗪的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of chlorpromazine

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

GST親和層析柱材料(Glutathione SepharoseTM 4 Fast Flow)來自GE Healthcare，N-2-羥乙基哌嗪-N'-乙磺酸(Hepes分析純)、CPZ均來自Sigma公司，氯化鉀(＞99%)、Tris(＞99.9%)、甘氨酸(＞99.5%)、Acrylamide(＞99.9%)、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、bis-acrylamide(純度大于 99.0%)均來自上海生工，乙二胺四乙酸鈉(EDTA)來自索萊寶，過硫酸銨(分析純)來自北京化工廠。

所用儀器有：Eppendorf移液槍、THZ-C搖床(江蘇太倉實驗設(shè)備廠)、KS-600超聲波粉碎機(寧波儀器廠)、TGL-16臺式高速冷凍離心機(湖南儀器總廠)、F-2700型熒光光譜儀(日本Hitachi公司)、F-2700型熒光分光光度計(日本Hitachi公司)、Chirascan圓二色光譜儀(Applied Photophysics有限公司)、Malvern ITC200等溫滴定微量熱儀、Cary Varian Eclipse紫外分光光譜儀、METTLER TOLEDO Five easy plus pH計、DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳和DYY-10C型雙穩(wěn)時電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 儲備液的配制

Tb3+儲備液的配制參照文獻[14]進行。

CPZ溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.177 7 g的CPZ加入1 mL的 Hepes溶液(10 mmol·L-1，pH=7.4)中，攪拌均勻至溶解，配制成0.5 mmol·L-1的CPZ溶液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

pBR322 DNA儲備液的配制：在無菌環(huán)境下用移液槍取一定量的pBR322 DNA(濃度為0.5 μg·μL-1)，用無菌水稀釋至所需濃度，并將其分裝儲備于-20℃下。

1.2.2 熒光光譜分析

CPZ和apoC-EoCen作用的熒光通過熒光光譜儀測定[15]。隔3 min掃描1次，記錄保存相關(guān)數(shù)據(jù)。同樣可以測定Tb3+的敏化熒光光譜。

1.2.3 等溫滴定量熱分析

apoC-EoCen與CPZ結(jié)合的熱力學(xué)常數(shù)通過等溫量熱分析得到，實驗在30℃下進行[16]。apoCEoCen 濃度為 0.08 mmol·L-1，CPZ 濃度為 4 mmol·L-1，分別將其置于樣品池及注射器中。

1.2.4 CD色譜的測定

通過Biologic Mos型CD光譜儀測定圓二色光譜(CD)，掃描范圍為190～260 nm，樣品均溶解于Hepes緩沖溶液(10 mmol·L-1，pH=7.4)中[17]。所有實驗均在室溫下進行，掃描3次取平均值，扣除稀釋效應(yīng)。

1.2.5 共振光散射測定

共振光散射(RLS)通過掃描同步熒光光譜實現(xiàn)。設(shè)定激發(fā)波長為250 nm，掃描范圍為250～600 nm，電壓為400 V,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm。取1 mL apoC-EoCen和不同濃度的CPZ混合溶液于1 cm的比色皿中，apoC-EoCen 濃度為10 μmol·L-1，然后加入 1 mmol·L-1的 Tb3+，每次加 2 μL，隔 3 min 掃描 1次，最終結(jié)果為3次掃描結(jié)果的平均值。

1.2.6 apoC-EoCen的磷酸化修飾

將 apoC-EoCen(0.1 mmol·L-1)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA，0.1 mmol·L-1)、Mg2+(0.132 mol·L-1)、ATPNa2(1.01 mmol·L-1)均溶解于 Hepes緩沖溶液(10 mmol·L-1，pH=7.4)中，分別加入 0、5、10、30、50倍的CPZ，置于恒溫水浴(30 ℃)反應(yīng)10 h，得到磷酸化蛋白(P-apoC-EoCen)。利用PD-10脫鹽柱將多余的金屬離子和ATP等洗脫。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測蛋白的電遷移率[18]。

1.2.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳

將提前制備好的apoC-EoCen和XPC混合樣品放置于4℃過夜反應(yīng)，apoC-EoCen的電遷移率在室溫下用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳時間約3 h完成，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色,然后用乙醇或冰乙酸脫色后在紫外可見透射反射儀中觀察。

1.2.8 瓊脂糖凝膠電泳分析

pBR322 DNA、apoC-EoCen和CPZ按一定比例混合，在4℃反應(yīng)約3 h，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗研究apoC-EoCen、CPZ和pBR322 DNA三者之間的相互作用。實驗結(jié)果置于紫外可見透射反射儀下進行觀察[13]。

1.2.9 分子對接

apoC-HsCen 2與apoC-EoCen的序列同源性高達(dá)71.8%，與鈣調(diào)蛋白的同源性也在50%以上[19]。如此高的同源性使得它們之間的生物功能基本相似，因此我們選擇apoC-HsCen 2(PDB∶2GGM)的結(jié)構(gòu)作為模板,利用自動對接軟件Discovery Studio 3.0(DS)對小分子CPZ與C端半分子之間的結(jié)合位點和結(jié)合模式進行模擬，找到最優(yōu)結(jié)合位點，即能量最低位點[20]。這種研究方法的優(yōu)點在于在實驗基礎(chǔ)上可以直觀地看到兩者之間的結(jié)合狀態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 CPZ與apoC-EoCen的結(jié)合

2.1.1 熒光光譜

圖 2A 是在 pH=7.4、10 mmol·L-1Hepes緩沖條件下，用CPZ滴定apoC-EoCen的熒光光譜。從圖2A可以看出，308 nm處是apoC-EoCen的最大熒光發(fā)射峰。隨著CPZ滴加到apoC-EoCen溶液中，可以看到位于308 nm處的C端半分子蛋白熒光強度逐漸下降，而在355和452 nm處出現(xiàn)了CPZ的2個特征熒光峰，并在335 nm處出現(xiàn)了等熒光點。表明CPZ與apoC-EoCen結(jié)合生成了復(fù)合物。

將apoC-EoCen在308 nm處的熒光強度對cCPZ/capoC-EoCen作圖，得到圖2B。從圖2B可以看出，apoCEoCen在308 nm處的熒光強度隨著cCPZ/capoC-EoCen的增大而逐漸減小。利用CPZ與apoC-EoCen反應(yīng)形成apoC-EoCen-CPZ復(fù)合物的平衡方程，可將熒光強度與反應(yīng)表觀結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)建立式1所示方程：

圖 2 (A)CPZ(2.5 mmol·L-1)的加入對apoC-EoCen(10 μmol·L-1,1 mL)熒光光譜的影響;(B)隨 cCPZ/capoC-EoCen變化的熒光強度(308 nm)滴定曲線,以及CPZ滴定apoC-EoCen的擬合曲線Fig.2 (A)Fluorescence spectra produced by addition of CPZ(2.5 mmol·L-1)to 1 mL apoC-EoCen(10 μmol·L-1);(B)Titration curve of fluorescent intensity at 308 nm against concentration ratio of CPZ and apoC-EoCen

其中F0為apoC-EoCen在308 nm處的初始熒光強度；F為任一滴定點的熒光強度；F∞為CPZ與apoCEoCen完全結(jié)合后apoC-EoCen在308 nm處的熒光強度；K為CPZ與apoC-EoCen結(jié)合的條件結(jié)合常數(shù)；n為apoC-EoCen的CPZ結(jié)合位點數(shù)；cCPZ,f為任一滴定點時CPZ的游離濃度。根據(jù)文獻[21]，使用CPZ的總濃度代替CPZ的游離濃度，由式1用lg[(F0-F)/(FF∞)]對 lgcCPZ,f作圖可得近似的K和n(圖 2B，Inset)。CPZ與apoC-EoCen的結(jié)合比為1∶1，結(jié)合常數(shù)為(1.91±0.04)×104L·mol-1(Supporting information)。

2.1.2 等溫滴定量熱分析

為了進一步研究CPZ和apoC-EoCen之間的相互作用，我們選用等溫量熱滴定進行分析。圖3為室溫下在 Hepes緩沖溶液(10 mmol·L-1，pH=7.4)中CPZ滴定apoC-EoCen的等溫量熱滴定曲線。通過單位點結(jié)合模型擬合，獲得結(jié)合常數(shù)為(1.12±0.15)×104L·mol-1，apoC-EoCen有1個CPZ的結(jié)合位點，與前面的熒光滴定結(jié)果一致。熱力學(xué)參數(shù)列于表1，可以看出熵是正數(shù)、焓是負(fù)數(shù)、吉布斯自由能是負(fù)數(shù)，表明CPZ和apoC-EoCen反應(yīng)的過程是焓熵共同驅(qū)動的自發(fā)放熱反應(yīng)，它們之間反應(yīng)的主要作用力是靜電作用[22]。

2.1.3 CD光譜分析

在室溫、pH=7.4、10 mmol·L-1Hepes緩沖溶液下測得的apoC-EoCen和apoC-EoCen-CPZ復(fù)合物的遠(yuǎn)紫外圓二色譜如圖4所示。由圖4可見，apoC-EoCen的CD光譜在208和222 nm附近出現(xiàn)了2個負(fù)吸收峰，這是中心蛋白由α螺旋結(jié)構(gòu)組成的2個特征峰。加入10倍的CPZ并形成apoC-EoCen-CPZ復(fù)合物后，2個峰的負(fù)吸收減少，中心蛋白的α螺旋含量降低了約40%，說明鈣調(diào)蛋白抑制劑CPZ的結(jié)合，對中心蛋白的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致α螺旋部分解旋，橢圓率降低。

圖3 25 ℃下CPZ(3 mmol·L-1)對apoC-EoCen(0.08 mmol·L-1)的等溫量熱滴定曲線Fig.3 Calorimetric titration curve of CPZ(3 mmol·L-1)to apoC-EoCen(0.08 mmol·L-1)at 25 ℃

圖4 apoC-EoCen和apoC-EoCen-CPZ復(fù)合物在水中的遠(yuǎn)紫外CD光譜Fig.4 Far-UV CD spectra of apoC-EoCen and apoCEoCen-CPZ complex in aqueous solution

表1 25℃下通過ITC和熒光光譜測量CPZ與apoC-EoCen結(jié)合的熱力學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Thermodynamics data of CPZ binding with apoC-EoCen measured by ITC and fluorescence spectrometry at 25℃

2.1.4 CPZ與apoC-EoCen之間的福斯特共振能量轉(zhuǎn)移及分子模擬

根據(jù)福斯特非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[23]，能量供體和受體發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的條件有2個：一是供體的熒光發(fā)射光譜和受體的紫外吸收光譜存在著一定的重疊；二是供體和受體之間的距離r＜7 nm，二者不可缺一。圖5A為室溫下在290～355 nm范圍內(nèi)供體apoC-EoCen的熒光發(fā)射光譜和受體CPZ的紫外吸收光譜的光譜重疊。由此計算得到光譜重疊積分J為 2.69×10-15cm6，已知K2=2/3，n=1.336，Φ=0.14[24]，由此得到福斯特臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0為2 nm，能量轉(zhuǎn)移效率E=0.91，進一步計算得到能量供體apoCEoCen的168位酪氨酸殘基和受體CPZ之間的距離r為 1.36 nm(Supporting information)。0.5R0＜r＜1.5R0，證明蛋白供體和CPZ之間發(fā)生了無輻射能量轉(zhuǎn)移。

在實驗測定的基礎(chǔ)上，通過自動對接軟件Discovery Studio 3.0可以更加直觀地看到CPZ與apoCEoCen之間的結(jié)合位點以及結(jié)合模式。圖5B是最小結(jié)合能為-36.88 kJ·mol-1時對應(yīng)的結(jié)構(gòu)。如圖5B所示，CPZ的吩噻嗪環(huán)和第4個EF-hand結(jié)構(gòu)域的F螺旋上的168位酪氨酸殘基芳環(huán)之間的距離是1.38 nm，與福斯特能量轉(zhuǎn)移得到的結(jié)果吻合。仔細(xì)分析CPZ與apoC-EoCen之間結(jié)合的驅(qū)動力可知其分為2種：(1)靜電作用，質(zhì)子化的吩噻嗪與去質(zhì)子化的E144間的作用。(2)疏水作用，CPZ與F109、L122、M141、I142、F145、I153、I161、T165、M162、S166間的作用。除F109和L122分別位于第3個EF-hand結(jié)構(gòu)域的E和Fα-螺旋之外，其它10個氨基酸殘基均位于第4個EF-hand結(jié)構(gòu)域，其中9個氨基酸殘基分別位于第4個EF-hand結(jié)構(gòu)域的E和Fα-螺旋，I153是唯一位于loop區(qū)的氨基酸殘基。

圖5 (A)apoC-EoCen熒光光譜(a)和CPZ吸收光譜的重疊(b);(B)apoC-EoCen和CPZ的分子對接圖Fig.5 (A)Overlap of apoC-EoCen fluorescence spectrum(a)and CPZ absorption spectrum(b);(B)Molecular docking between apoC-EoCen and CPZ

2.2 CPZ對apoC-EoCen功能的抑制

2.2.1 對Tb3+結(jié)合的影響

八肋游仆蟲中心蛋白不含色氨酸殘基，含有4個酪氨酸殘基Y46、Y72、Y79和Y168，分別位于第Ⅰ、Ⅱ結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)的末端。因此，當(dāng)Tb3+與蛋白質(zhì)結(jié)合時，占據(jù)Ⅲ和Ⅳ結(jié)合位點(高親和位點)的Tb3+出現(xiàn)弱熒光敏化，而占據(jù)Ⅰ和Ⅱ結(jié)合位點(低親和位點)的Tb3+出現(xiàn)強熒光敏化[25]。由此得出八肋游仆蟲中心蛋白的4個金屬離子結(jié)合部位是不等價的，結(jié)合順序為Ⅳ≈Ⅲ＞Ⅰ、Ⅱ[26]。C端半分子的酪氨酸殘基只有1個，當(dāng)用Tb3+滴定時仍可觀測到在490、545、590和620 nm附近出現(xiàn)的Tb3+特征峰(圖6A)?？梢?，隨著 Tb3+的不斷加入，其在 490、545、590 和620 nm處的特征峰熒光強度逐漸增大，直至不變。這表明Tb3+與apoC-EoCen結(jié)合后發(fā)生了Y168殘基與結(jié)合Tb3+間的非輻射能量轉(zhuǎn)移。將545 nm處的熒光強度對cTb3+/capoC-EoCen作圖(圖 6C 曲線 a)，可以看出，cTb3+/capoC-EoCen＜1.0時，Tb3+在545 nm處熒光強度隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而線性地增加；在cTb3+/capoC-EoCen為1.0～2.0范圍內(nèi)，盡管Tb3+在545 nm處熒光強度仍隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而線性地增加，但增加幅度明顯減少；當(dāng)cTb3+/capoC-EoCen＞2.0時，Tb3+在545 nm處熒光強度不再隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而增加。表明Tb3+和apoC-EoCen以2∶1的結(jié)合比結(jié)合。在Ⅲ和Ⅳ結(jié)構(gòu)域分別引入色氨酸殘基的研究表明，Tb3+優(yōu)先占據(jù)蛋白質(zhì)的第Ⅳ結(jié)合位點[27]，即結(jié)合于第Ⅳ結(jié)合位點的Tb3+出現(xiàn)強熒光敏化，而結(jié)合于第Ⅲ結(jié)合位點的Tb3+出現(xiàn)弱熒光敏化。圖6B是在10倍CPZ存在的條件下，用Tb3+滴定apoC-EoCen的熒光光譜。同樣將545 nm處的熒光強度對cTb3+/capoC-EoCen作圖(圖6C曲線b)。由該曲線可得，當(dāng)cTb3+/capoC-EoCen＜1.0 時，Tb3+在545 nm處熒光強度隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而線性地增加；當(dāng)cTb3+/capoC-EoCen＞1.0時，Tb3+在545 nm處熒光強度不再隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而增加。表明Tb3+和apoC-EoCen-CPZ以1∶1的結(jié)合比結(jié)合，即CPZ與apoC-EoCen的結(jié)合導(dǎo)致Tb3+的1個結(jié)合部位被破壞。由圖6C曲線b的斜率及圖5B分子對接的CPZ作用部位可推斷，CPZ與apoC-EoCen的結(jié)合導(dǎo)致其第Ⅳ結(jié)合部位喪失Tb3+結(jié)合能力。

根據(jù)式1擬合圖6C的Tb3+熒光敏化數(shù)據(jù)可得，在10 mmol·L-1Hepes、pH=7.4的條件下，Tb3+與apoC-EoCen的結(jié)合位點數(shù)n為2.04±0.25，條件結(jié)合常數(shù)K為1.70×1016L2·mol-2；而Tb3+與apoC-EoCen-CPZ的結(jié)合位點數(shù)n為1.09±0.06，條件結(jié)合常數(shù)K為2.00×108L·mol-1(Supporting information)，與Ⅲ和Ⅳ結(jié)構(gòu)域分別引入色氨酸殘基后所測得的結(jié)合常數(shù)吻合[28]。

圖6D是10 mmol·L-1Hepes、pH=7.4條件下Tb2-apoC-EoCen和Tb-apoC-EoCen-CPZ的CD光譜。可以看出，在10倍CPZ的存在下，位于208和220 nm處蛋白質(zhì)的2個負(fù)吸收峰減少近40%，即CPZ的結(jié)合使蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，α螺旋含量降低。

2.2.2 CPZ對apoC-EoCen聚集的影響

圖6 在CPZ不存在(A)和存在(B)的情況下Tb3+敏化的熒光光譜;(C)在CPZ不存在(a)和存在(b)的情況下,Tb3+在545 nm處的熒光強度與cTb3+/capoC-EoCen的關(guān)系;(D)Tb2-apoC-EoCen和Tb-apoC-EoCen-CPZ的遠(yuǎn)紫外CD光譜Fig.6 Tb3+sensitized fluorescence spectra in the absence(A)and presence(B)of CPZ;(C)Fluorescence intensity of Tb3+at 545 nm as a function ofcTb3+/capoC-EoCenin the absence(a)and presence(b)of CPZ;(D)Far-UV CD spectra of Tb2-apoC-EoCen and Tb-apoC-EoCen-CPZ

中心蛋白的生物功能之一是金屬離子結(jié)合誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集[29]。盡管其聚集驅(qū)動力主要集中在N端，但是C端也有一定的聚集能力[30]。圖7A是在室溫、pH=7.4、10 mmol·L-1Hepes緩沖溶液時，用Tb3+滴定apoC-EoCen的RLS光譜?？梢姡S著Tb3+的不斷加入，280 nm處的RLS強度逐漸增強。增大到某一點時，基本保持穩(wěn)定。將280 nm處的RLS強度對cTb3+/capoC-EoCen作圖(圖7B曲線a)，可以發(fā)現(xiàn)類似于圖6的Tb3+敏化熒光滴定，Tb3+和apoC-EoCen以2∶1的結(jié)合比結(jié)合。由Tb3+滴定apoC-EoCen-CPZ的RLS光譜可得其滴定曲線如圖7B曲線b所示，即Tb3+與apoC-EoCen-CPZ的結(jié)合比為1∶1。根據(jù)式1擬合圖7B的Tb3+誘導(dǎo)RLS數(shù)據(jù)可得，在10 mmol·L-1Hepes、pH=7.4的條件下，Tb3+與apoC-EoCen的結(jié)合位點數(shù)n為1.95±0.10，條件結(jié)合常數(shù)K為1.15×1016L2·mol-2；而 Tb3+與 apoC-EoCen-CPZ 的結(jié)合位點數(shù)n為 1.00±0.06，條件結(jié)合常數(shù)K為 2.14×108L·mol-1(Supporting information)，與Tb3+敏化熒光所得結(jié)果一致。

圖7 (A)Tb3+滴定apoC-EoCen的RLS光譜;(B)在CPZ比例不同(cCPZ/capoC-EoCen=0(a),10(b))的情況下,RLS光譜在280 nm處的強度與cTb3+/capoC-EoCen的關(guān)系Fig.7 (A)RLS spectra of apoC-EoCen titrated with Tb3+;(B)RLS intensity at 280 nm as a function of cTb3+/capoC-EoCenin the presence of different proportions of CPZ：cCPZ/capoC-EoCen=0(a),10(b)

2.2.3 CPZ對apoC-EoCen類核酸酶活性的抑制

2.2.3.1 apoC-EoCen的類核酸酶活性

pBR322 DNA質(zhì)粒是一種超螺旋型（Ⅰ）核酸大分子，能夠被一些具有切割活性的小分子、蛋白等切割成切口型（Ⅱ）以及線型（Ⅲ）。它們具有不同的遷移速率，其大小順序一般為超螺旋型＞線型＞缺刻型。圖8A為不同濃度的apoC-EoCen對pBR322 DNA切割的凝膠電泳圖。1～10號泳道為pBR322 DNA，2～10號泳道為分別加入2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25 μmol·L-1apoC-EoCen后的pBR322 DNA。從圖8A中可以看出，最初DNA只有超螺旋一種形式，隨著apoC-EoCen濃度的增大，線型和缺刻型條帶逐漸變亮，而超螺旋DNA條帶慢慢變暗，即DNA逐漸由超螺旋狀態(tài)變?yōu)榫€型和缺刻型，直到超螺旋型完全消失。將圖8A中3種不同形式的DNA進行黑度掃描并對apoC-EoCen濃度作圖得到圖8B。從圖8B可以看出，當(dāng) apoC-EoCen 終濃度為 25 μmol·L-1時，pBR322 DNA完全由Ⅰ型轉(zhuǎn)變?yōu)棰蚝廷笮?。即apoC-EoCen像apoN-EoCen[31]一樣有類核酸酶活性。

2.2.3.2 不同濃度CPZ對apoC-EoCen類核酸酶活性的影響

圖9A是不同濃度CPZ對apoC-EoCen類核酸酶活性的影響。其中1～10號泳道為相同濃度的pBR322 DNA，2～10號泳道為加入終濃度為25 μmol·L-1的apoC-EoCen，3～10號泳道為含有不同濃度CPZ的apoC-EoCen類核酸酶活性，cCPZ/capoC-EoCen分別為5、10、15、20、25、30、40、50。由圖中可見，隨著CPZ濃度的增大，線型和切口型pBR322 DNA條帶逐漸由亮變暗，直到消失；而超螺旋型pBR322 DNA逐漸出現(xiàn)，其條帶逐漸變亮。說明CPZ和apoCEoCen的結(jié)合抑制了apoC-EoCen的類核酸酶活性，阻礙了其對pBR322 DNA的切割，使得pBR322 DNA保存為最初的超螺旋形式。將圖9A中3種不同形式的pBR322 DNA進行黑度掃描并對cCPZ/capoC-EoCen作圖得到圖9B。從圖9B可以看出，開始蛋白將DNA切割成Ⅱ和Ⅲ型DNA，隨著CPZ濃度的增大，Ⅱ和Ⅲ型DNA均逐漸減少，Ⅰ型DNA逐漸增加；當(dāng)加入20倍的CPZ時，Ⅲ型DNA基本消失；當(dāng)加入50倍CPZ時，僅剩下Ⅰ型DNA。

圖8 (A)apoC-EoCen切割pBR322 DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖;(B)不同構(gòu)型DNA的比例與apoC-EoCen濃度的關(guān)系Fig.8 (A)Agarose gel electrophoresis for pBR322 DNA cutting with different concentrations of apoC-EoCen;(B)Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and apoC-EoCen concentration

圖9 (A)CPZ對apoC-EoCen裂解DNA影響的瓊脂糖凝膠電泳圖;(B)不同構(gòu)型DNA的比例隨cCPZ/capoC-EoCen變化的曲線Fig.9 (A)Agarose gel electrophoresis for effect with different proportions of CPZ on apoC-EoCen cleavaging DNA;(B)Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and cCPZ/capoC-EoCen

2.2.4 CPZ對apoC-EoCen與靶肽結(jié)合的抑制

XPC是以人著色性干皮病C組蛋白中覆蓋中心蛋白結(jié)合序列的多肽，它參與許多細(xì)胞內(nèi)生物分子反應(yīng)。在 pH=7.4、10 mmol·L-1Hepes緩沖條件下，XPC和apoC-EoCen可形成1∶1的復(fù)合物。圖10A是CPZ對apoC-EoCen-XPC復(fù)合物影響的天然凝膠電泳圖。其中1號泳道為apoC-EoCen，2號泳道為apoC-EoCen-XPC，3～10號泳道是cCPZ/capoC-EoCen分別為5、10、20、30、40、50、100、200時的apoC-EoCen-XPC。由圖10A可見，隨著CPZ濃度的增加，apoC-EoCen-XPC復(fù)合物逐漸減少，直到復(fù)合物全部消失，而apoC-EoCen條帶逐漸從無到有。這表明CPZ的結(jié)合抑制了apoC-EoCen-XPC復(fù)合物的形成。將圖10A中蛋白及其復(fù)合物進行黑度掃描并對cCPZ/capoC-EoCen作圖(圖 10B)，其中曲線 a為 apoC-EoCen 隨CPZ濃度的變化，曲線b為apoC-EoCen-XPC隨CPZ濃度的變化。從圖10B可以看出，隨著CPZ濃度的增大，曲線a呈上升趨勢，曲線b呈下降趨勢，CPZ抑制了蛋白和XPC的結(jié)合，使得復(fù)合物含量逐漸下降。當(dāng)加入50倍的CPZ時，apoC-EoCen和apoCEoCen-XPC復(fù)合物含量基本各占一半。

圖10 (A)不同比例的CPZ加入apoC-EoCen和XPC中的天然凝膠電泳圖;(B)apoC-EoCen(a)和apoC-EoCen-XPC(b)隨cCPZ/capoC-EoCen的變化;(C)遠(yuǎn)紫外CD光譜中CPZ對apoC-EoCen與XPC復(fù)合物的影響(a：apoC-EoCen;b：apoC-EoCen-XPC復(fù)合物;c：apoC-EoCen-XPC與CPZ共存);(D)apoC-EoCen與XPC或CPZ結(jié)合的緞帶模型Fig.10 (A)Non-denaturing gel electrophoresis diagram for effect of adding CPZ with different proportions to apoC-EoCen combined with XPC;(B)apoC-EoCen(a)and apoC-EoCen-XPC(b)changes with cCPZ/capoC-EoCen;(C)Far-UV CD spectra for effect of CPZ on apoC-EoCen binding to XPC(a：apoC-EoCen;b：apoC-EoCen-XPC complex;c：apoC-EoCen-XPC combined with CPZ);(D)Cartoon ribbon model structure of apoC-EoCen combined with XPC and CPZ

中心蛋白C端結(jié)構(gòu)域是其靶蛋白結(jié)合功能區(qū)，許多靶肽如蜂毒素[32]、XPC[33]在溶液中處于隨機卷曲態(tài)，當(dāng)與中心蛋白結(jié)合后便形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。圖10C譜線a是apoC-EoCen的遠(yuǎn)紫外CD光譜，可見在208和220 nm處出現(xiàn)蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰；當(dāng)apoC-EoCen與XPC結(jié)合形成apoC-EoCen-XPC復(fù)合物后，位于208和220nm處的2個特征負(fù)峰明顯增大(譜線 b)，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加；CPZ 與 apoCEoCen結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少；圖10C譜線c是apoC-EoCen-XPC中加入10倍CPZ后的遠(yuǎn)紫外CD光譜，可知apoC-EoCen的α螺旋含量減少約25%。這些結(jié)果表明CPZ的結(jié)合抑制了apoC-EoCen和XPC形成復(fù)合物。

圖10D是apoC-EoCen和CPZ結(jié)合能量最低結(jié)構(gòu)與apoC-EoCen-XPC晶體結(jié)構(gòu)(PDB∶2GGM)的疊加圖。由圖10D可見，CPZ與XPC的N端占據(jù)apoCEoCen的同一結(jié)合部位，尤其是存在XPC的色氨酸殘基與apoC-EoCen間的疏水作用。因此，CPZ與apoC-EoCen-XPC的結(jié)合可看作配體的置換反應(yīng)，CPZ將蛋白質(zhì)結(jié)合的XPC置換。由此，可根據(jù)apoCEoCen-XPC的結(jié)合常數(shù)計算得到CPZ與apoC-EoCen間的結(jié)合常數(shù)為5.52×104L·mol-1(Supporting information)，與其它方法所得數(shù)據(jù)吻合。

2.2.5 CPZ對apoC-EoCen磷酸化的抑制

蛋白質(zhì)磷酸化是重要的生物化學(xué)反應(yīng)過程，通過蛋白激酶的催化將ATP上的γ-磷酰基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)底物的絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)或酪氨酸(Tyr)殘基上來實現(xiàn)中心蛋白的磷酸化[34]。根據(jù)我們實驗室之前的研究，蛋白激酶A(PKA)在apoC-EoCen上的磷酸化位點是Ser-166(KQTS)[35]。CPZ作為鈣調(diào)蛋白抑制劑，通過聚丙烯凝膠電泳實驗可以研究其是否對磷酸化蛋白質(zhì)有影響。如圖11所示，apoC-EoCen終濃度為 100 μmol·L-1，1～6號泳道加 apoC-EoCen，2～6號泳道加磷酸化溶液混合物(Mg2+與ATP及PKA)，3～6號泳道加不同濃度的CPZ，cCPZ/capoC-EoCen=5、10、30、50。蛋白質(zhì)經(jīng)過磷酸化后條帶下移，當(dāng)加入5倍和10倍的CPZ時，P-apoC-EoCen條帶沒有發(fā)生明顯變化，當(dāng)加入30倍CPZ時，P-apoC-EoCen完全轉(zhuǎn)化為apoC-EoCen。說明CPZ的結(jié)合抑制了磷酸化蛋白質(zhì)的形成，阻礙了蛋白質(zhì)的磷酸化。

圖11 CPZ對apoC-EoCen磷酸化影響的聚丙烯凝膠電泳圖Fig.11 Polypropylene gel electrophoresis diagram for effect of CPZ on apoC-Eocen phosphorylation

3 結(jié) 論

通過光譜分析、電泳、等溫量熱滴定、Tb3+熒光探針和分子對接等方法，在pH=7.4、10 mmol·L-1Hepes條件下，研究了鈣調(diào)蛋白抑制劑CPZ與apoCEoCen的相互作用。結(jié)果表明，CPZ與apoC-EoCen以1∶1結(jié)合比與apoC-EoCen的4個α-螺旋間的疏水區(qū)結(jié)合而形成復(fù)合物，條件結(jié)合常數(shù)約為104L·mol-1；apoC-EoCen具有類核酸酶活性，可將pBR322 DNA切割為切口型（Ⅱ）、線型（Ⅲ）DNA，而CPZ抑制了apoC-EoCen的類核酸酶活性；CPZ與apoC-EoCen的結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)第Ⅳ結(jié)構(gòu)域的金屬離子結(jié)合能力喪失，進而抑制金屬離子結(jié)合誘導(dǎo)的聚集；CPZ通過疏水作用占據(jù)apoC-EoCen的靶肽結(jié)合部位而抑制其與XPC的結(jié)合；CPZ還抑制PKA對apoC-EoCen的磷酸化。多種實驗手段證明，CPZ是一種良好的中心蛋白生物功能阻斷劑，在以后的醫(yī)學(xué)研究中有著良好的應(yīng)用前景。

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