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        Fibulin-2在結(jié)直腸癌中的表達=及其對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響

        2021-02-24 01:32:54趙志煌陳豪燕
        胃腸病學 2021年5期
        關鍵詞:小室質(zhì)粒培養(yǎng)基

        趙志煌 洪 潔 陳豪燕 鐘 鳴

        上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院普外科1(200127) 消化內(nèi)科2

        結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是一種常見的消化道惡性腫瘤,據(jù)最新全球癌癥估算數(shù)據(jù),2020年全球約有193萬例新發(fā)CRC病例和93萬例CRC相關死亡病例,分居全球癌癥發(fā)病和死因的第三位(10.0%)和第二位(9.4%)[1]。我國CRC總體發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分居第三和第五位,且呈逐年上升趨勢[2-3]。目前,CRC相關死亡的主要原因仍為腫瘤轉(zhuǎn)移,因轉(zhuǎn)移死亡的人數(shù)分別占初診和確診人數(shù)的25%和50%[4-6]。對于CRC轉(zhuǎn)移患者,手術切除仍為最佳治療方案,但術后復發(fā)現(xiàn)象常見[7]。因此,對CRC轉(zhuǎn)移機制及其早期診斷分子標志物的研究顯得尤為重要。

        Fibulin蛋白家族是一類廣泛表達于各類組織的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)蛋白,其表達改變在腫瘤進展,尤其是侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[8-12],但具體作用機制尚未完全明確。本課題組的前期篩選研究發(fā)現(xiàn),ECM功能在轉(zhuǎn)移性CRC中有高度富集,同樣提示了ECM在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用。同時,本課題組還發(fā)現(xiàn),fibulin-2(FBLN2)高表達的CRC患者無病生存期(disease free survival, DFS)較FBLN2低表達者明顯縮短?;贔BLN2可能參與CRC侵襲、轉(zhuǎn)移的假設,本研究分析了FBLN2在CRC中的表達情況,并探討其對CRC侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響和可能的作用機制,以期為CRC轉(zhuǎn)移的早期診斷和治療提供新靶點。

        材料與方法

        一、細胞株和主要試劑

        人CRC細胞株HCT116、HT29、RKO、DLD-1、SW480、SW1116、LOVO、SW620以及人正常結(jié)直腸黏膜細胞株FHC均購自美國模式菌種收集中心(ATCC)細胞庫。

        DharmaFECTTM轉(zhuǎn)染試劑(GE Healthcare);FBLN2 siRNA和對照siRNA(siRNA-ctrl)序列見表1(上海吉瑪制藥技術有限公司);FBLN2過表達質(zhì)粒FBLN2-pcDNA3.1和對照質(zhì)粒ctrl-pcDNA3.1(吉凱基因);CCK-8細胞增殖毒性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所);Transwell小室(Millipore?, Merck KGaA);BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)(BD Biosciences);RNAiso Plus總RNA提取試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱreal-time PCR試劑盒(Takara Bio Inc.);PCR引物[金斯瑞生物科技(南京)有限公司];兔GAPDH、FBLN2多克隆抗體(Abcam plc.);兔上皮鈣黏著蛋白(E-cadherin, CDH1)、神經(jīng)鈣黏著蛋白(N-cadherin, CDH2)、鋅指家族轉(zhuǎn)錄抑制因子1(Snail family transcriptional repressor 1, Snai1)、鋅指家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2(Snail family transcriptional repressor 2, Snai2/SLUG)、波形蛋白(vimentin, VIM)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1)單克隆抗體(Cell Signaling Tech-nology, Inc.)。

        表1 FBLN2 siRNA和對照siRNA序列

        二、方法

        1. 公共數(shù)據(jù)庫分析:從Sequence Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫中提取PRJNA218851數(shù)據(jù)集,該數(shù)據(jù)集包括18例CRC患者的正常結(jié)腸黏膜、CRC原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶共54個樣本的RNA序列數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫信息提取采用R3.6.1軟件,以篩選與CRC轉(zhuǎn)移相關的基因。

        從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫中提取COAD(colon adenocarcinoma)隊列和READ(rectum adenocarcinoma)隊列中625例CRC組織芯片數(shù)據(jù),分析FBLN2在CRC組織與正常結(jié)直腸組織中的表達差異。根據(jù)FBLN2在CRC組織中表達量的中位數(shù),將625例CRC病例分為FBLN2高表達組和低表達組。同時提取上述CRC病例的臨床病理信息,包括初次病理診斷年齡、性別、美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC) TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等以及預后信息,分析FBLN2表達與患者臨床病理特征和預后的相關性。組織芯片信息采用R3.6.1軟件提取。

        除SRA、TCGA數(shù)據(jù)庫外,本研究使用的公共數(shù)據(jù)庫還包括基因型-組織表達數(shù)據(jù)庫(Genotype-Tissue Expression, GTEx; http://gtexportal.org/home/)和高通量基因表達數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus, GEO; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)GSE39582數(shù)據(jù)集。GTEx系對來自人體多個組織和器官的樣本同時進行轉(zhuǎn)錄組測序和基因型分析所構建的組織特異性基因表達和調(diào)控數(shù)據(jù)庫。

        Metascape(http://metascape.org/)是一個功能強大的基因功能注釋分析工具,整合了GO、KEGG、UniProt等多個權威功能數(shù)據(jù)庫,可在線將當前主要的生物信息學分析方法應用于批量基因和蛋白質(zhì)的分析中,以實現(xiàn)對基因和蛋白質(zhì)功能的認知。

        基因表達譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA; http://gepia2.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫可基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)提供快速且可自定義的功能,包括差異表達分析、生存分析、相似基因檢測等,用于分析FBLN2在CRC組織中的異常表達及其與預后的相關性。

        2. 臨床組織樣本收集和信息采集:臨床CRC組織樣本來源于在上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院普外科接受外科手術治療的CRC患者,于癌組織中央非壞死區(qū)域取材(癌旁組織標本于距癌組織邊緣1~3 cm處腸黏膜取材),由2名高年資消化病理醫(yī)師診斷為CRC。采集患者臨床病理信息。樣本收集和信息采集符合醫(yī)院倫理委員會要求。

        3. CRC細胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染實驗:CRC細胞使用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A完全培養(yǎng)基或RPMI-1640完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,每2 d換液一次,每3 d長至80%左右傳代。細胞生長至指數(shù)生長期時,以(2~3)×105/孔接種于 6 孔板,用于后續(xù)實驗。

        細胞于6孔板中培養(yǎng)24 h,待細胞貼壁狀態(tài)穩(wěn)定后,參照轉(zhuǎn)染試劑說明,以siRNA-ctrl、FBLN2 siRNA轉(zhuǎn)染LOVO、SW620細胞,以對照質(zhì)粒ctrl-pcDNA3.1、FBLN2過表達質(zhì)粒FBLN2-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染HCT116、HT29細胞,并將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)6 h后將培養(yǎng)基換回完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后提取總RNA,72 h后提取總蛋白,用于后續(xù)實驗。

        4. CCK-8實驗:分別于轉(zhuǎn)染siRNAs或質(zhì)粒后的第0、1、2、3、4、5天消化LOVO細胞或HCT116細胞,重懸、計數(shù),每孔加入100 μL含10% CCK-8試劑的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基,37 ℃孵育2 h,使用酶標儀測定450 nm波長處吸光度值(A值)。

        5. 克隆形成實驗:將LOVO、HCT116細胞以800~1 000/孔接種于6 孔板,按上述方法轉(zhuǎn)染siRNAs或質(zhì)粒,靜置于37 ℃培養(yǎng)箱中。每天觀察細胞生長情況,每3 d換液一次,7~10 d后棄去培養(yǎng)基,固定染色后拍照,觀察、計數(shù)克隆形成大小和數(shù)量。

        6. Transwell細胞侵襲實驗:轉(zhuǎn)染siRNAs的LOVO、SW620細胞和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HCT116、HT29細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后消化,以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸。將Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板中,鋪入40 μL Matrigel;4~6 h后在小室下層加入600 μL含 20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,上層加入200 μL上述細胞懸液。繼續(xù)培養(yǎng)48~72 h后取出小室,固定染色,光學顯微鏡下觀察、拍照。隨機選取3個視野(放大 40 倍),計數(shù)穿過小室的細胞數(shù),結(jié)果取均值。

        7. Transwell細胞遷移實驗:LOVO、SW620、HCT116、HT29細胞處理方式同細胞侵襲實驗。將Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板中,在小室下層加入1.2 mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,上層加入200 μL轉(zhuǎn)染siRNAs或質(zhì)粒后的上述細胞懸液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出小室,固定染色,光學顯微鏡下觀察、拍照。隨機選取3個視野(放大40 倍),計數(shù)穿過小室的細胞數(shù),結(jié)果取均值。

        8. 細胞劃痕實驗:轉(zhuǎn)染siRNAs的LOVO細胞和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HCT116細胞培養(yǎng)6 h后換回完全培養(yǎng)基繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中,待細胞長至80%左右,以200 μL槍頭在每個孔中劃一條直線,同時更換為不含血清培養(yǎng)基,分別于0 h、12 h、24 h在高倍顯微鏡下觀察劃痕生長情況并拍照。每一時間點隨機選取3個視野,ImageJ軟件測量劃痕寬度,結(jié)果取均值。

        9. Real-time PCR:以PBS洗滌FHC細胞、8株CRC細胞株以及轉(zhuǎn)染siRNAs或質(zhì)粒的LOVO、SW620、HCT116、HT29細胞各2次,同時將32對-80 ℃凍存的CRC組織和癌旁組織標本研磨成勻漿。參照試劑說明書,以RNAiso Plus提取細胞或組織總RNA,利用NanoDrop軟件測定RNA濃度。分別取1 μg上述 RNA,使用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(反應體系20 μL,反應條件:37 ℃ 15 min; 85 ℃ 5 s; 4 ℃循環(huán)),以之為模板,使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ real-time PCR試劑盒,在Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR系統(tǒng)中行real-time PCR擴增(反應條件:95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s; 60 ℃ 30 s,40個循環(huán)),引物序列見表2。2- △△ CT法計算目的基因相對表達量,每組實驗設3個復孔。

        表2 Real-time PCR引物序列

        10. 蛋白質(zhì)印跡法:6孔板中的細胞以PBS洗滌3次,冰上裂解,收集細胞裂解液,離心后吸取上清液,BCA法蛋白定量。配制10% SDS-PAGE,蛋白上樣,70 V電泳30 min,125 V 電泳60 min,100 V PVDF膜轉(zhuǎn)膜120 min。室溫牛血清蛋白搖床封閉 2 h,分別加入各一抗(FBLN2: 1∶500稀釋,其他均為1∶1 000稀釋)和內(nèi)參GAPDH抗體(1∶1 000稀釋),4 ℃冰箱孵育過夜,隔日搖床充分洗滌后,加入HRP標記的羊抗兔 IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h,充分洗滌后加入ECL發(fā)光液,曝光,數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描圖像。

        11. 免疫組化染色:制備259例臨床CRC組織的石蠟組織芯片,脫蠟、水化、檸檬酸鹽微波抗原修復、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,山羊血清封閉,滴加FBLN2抗體(1∶200稀釋),4 ℃冰箱過夜,隔日滴加酶標羊抗兔IgG,滴加顯色劑、核染、水洗、封片。高倍成像顯微鏡下以圖像采集軟件采集圖像,由2名病理醫(yī)師判讀并評分。免疫反應評分(immuno-reactive score, IRS):染色面積0~25%、25%~50%、50%~75%、>75%分別計1、2、3、4分,染色強度弱(淺棕色)、中等(棕黃色)、強(深棕色)分別計1、2、3分,總分為染色面積與染色強度得分的乘積。IRS評分分級:1級,1、2分;2級,3、4分;3級,6、8分;4 級:9、12分。IRS 1、2級判定為FBLN2低表達,3、4級判定為FBLN2高表達。

        三、統(tǒng)計學分析

        結(jié) 果

        一、SRA數(shù)據(jù)庫中與CRC轉(zhuǎn)移相關的基因篩選和通路富集分析

        比較SRA數(shù)據(jù)庫PRJNA218851數(shù)據(jù)集中18對匹配的CRC原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中的基因表達數(shù)據(jù),以log2(fold change)>2 (P<0.05)為標準,篩選出313個在轉(zhuǎn)移灶中表達顯著上調(diào)的基因;將上調(diào)基因列表上傳至Metascape進行在線分析,富集得到的最顯著的前2個通路均與ECM有關(圖1A)。經(jīng)查閱ECM與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關系的文獻,本課題組將研究目標鎖定于fibulin蛋白家族。

        利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的625例CRC組織芯片數(shù)據(jù),以GEPIA網(wǎng)絡分析工具分析fibulin蛋白家族成員與CRC患者的DFS是否相關,結(jié)果顯示僅FBLN2高表達組DFS明顯短于低表達組,差異有統(tǒng)計學意義(圖1B),提示FBLN2可能在CRC中發(fā)揮作用。故本研究將FBLN2作為研究對象。

        A:Metascape功能富集分析(數(shù)據(jù)來源:SRA數(shù)據(jù)庫);B:FBLN2表達與CRC預后分析(數(shù)據(jù)來源:TCGA數(shù)據(jù)庫)

        二、FBLN2在CRC組織中的表達及其與腫瘤進展、轉(zhuǎn)移和預后的關系

        首先利用GEPIA網(wǎng)絡分析工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫COAD、READ隊列和GTEx數(shù)據(jù)庫中正常結(jié)直腸組織的基因表達數(shù)據(jù),結(jié)果顯示CRC組織中的FBLN2表達明顯低于正常組織,差異有統(tǒng)計學意義(圖2A)。對32對臨床CRC標本中FBLN2表達的檢測驗證了FBLN2在癌組織中的表達明顯低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(圖2B)。對TCGA數(shù)據(jù)庫中625例CRC組織的基因表達數(shù)據(jù)與臨床病理信息進行相關性分析,發(fā)現(xiàn)T分期為T3-4期的患者FBLN2表達明顯高于T1-2期患者,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N1-2期者FBLN2表達明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0期)者,N2期患者FBLN2表達升高更為顯著(圖2C)。對GEO數(shù)據(jù)庫GSE39582數(shù)據(jù)集中566例CRC組織基因表達數(shù)據(jù)與臨床病理信息的相關性分析結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果趨勢相同(圖2D)。上述結(jié)果表明,F(xiàn)BLN2在CRC組織中的表達較正常組織降低,但在局部進展期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC組織中表達升高,提示FBLN2可能在CRC進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

        為進一步驗證FBLN2與CRC的相關性,對259例臨床CRC組織制成的組織芯片進行FBLN2免疫組化染色(圖2E),結(jié)果顯示FBLN2 IRS高分者的比例隨TNM分期的增高而增高(圖2F)。FBLN2表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移相關;與FBLN2低表達組(IRS<6分)相比,F(xiàn)BLN2高表達組(IRS≥6分)TNM Ⅲ、Ⅳ期患者更多,且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移(表3、圖2F、2G)。比較FBLN2高表達組與低表達組的總生存率,結(jié)果顯示前者明顯短于后者,差異有統(tǒng)計學意義(圖2H),與對TCGA數(shù)據(jù)的分析結(jié)果一致,提示FBLN2表達與CRC患者的預后相關。

        表3 CRC患者FBLN2 IRS評分與臨床病理特征的關系

        組間比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;ns:P>0.05

        三、FBLN2在CRC細胞株中的表達情況以及敲低、過表達效率

        通過比較FBLN2在8株常用CRC細胞株和正常結(jié)直腸黏膜細胞株FHC中的表達,發(fā)現(xiàn)FBLN2在CRC細胞株中的表達均顯著降低,但同時也發(fā)現(xiàn)在具有高轉(zhuǎn)移性的LOVO和SW620細胞中,F(xiàn)BLN2表達較其他CRC細胞株明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(圖3A)。予LOVO、SW620細胞轉(zhuǎn)染FBLN2 siRNA,F(xiàn)BLN2表達顯著降低(圖3B);予FBLN2表達較低的HCT116、HT29細胞轉(zhuǎn)染FBLN2-pcDNA3.1,F(xiàn)BLN2表達顯著升高(圖3C)。

        組間比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;ns:P>0.05

        四、FBLN2對CRC細胞增殖、克隆形成能力的影響

        選擇FBLN2表達較高的LOVO、SW620細胞和FBLN2表達較低的HCT116、HT29細胞進行此部分實驗。CCK-8實驗顯示,轉(zhuǎn)染FBLN2 siRNA的LOVO細胞與轉(zhuǎn)染siRNA-ctrl者相比增殖能力無明顯差異(圖4A);轉(zhuǎn)染FBLN2-pcDNA3.1質(zhì)粒的HCT116細胞與轉(zhuǎn)染ctrl-pcDNA3.1質(zhì)粒者相比增殖能力也無明顯差異(圖4B)??寺⌒纬蓪嶒炌瑯语@示,在LOVO細胞中敲低FBLN2表達后,克隆形成數(shù)量未見明顯減少(圖4C);在HCT116細胞中過表達FBLN2后,克隆形成數(shù)量也未見明顯增多(圖4D)。上述結(jié)果表明,F(xiàn)BLN2對CRC細胞的增殖、隆形成能力無明顯影響。

        組間比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;ns:P>0.05

        五、FBLN2對CRC細胞侵襲、遷移能力的影響

        Transwell細胞侵襲和遷移實驗顯示,與轉(zhuǎn)染siRNA-ctrl者相比,轉(zhuǎn)染FBLN2 siRNA的LOVO、SW620細胞在細胞侵襲和遷移實驗中穿過Transwell小室的細胞數(shù)量均明顯減少(圖5A、5B);與之相反,轉(zhuǎn)染FBLN2-pcDNA3.1的HCT116、HT29細胞與轉(zhuǎn)染ctrl-pcDNA3.1者相比,穿過Transwell小室的細胞數(shù)量均明顯增多(圖5C、5D)。細胞劃痕實驗同樣顯示,敲低FBLN2表達的LOVO細胞劃痕愈合速度明顯減慢(圖5E),而過表達FBLN2的HCT116細胞劃痕愈合速度明顯加快(圖5F)。上述結(jié)果表明,F(xiàn)BLN2可增強CRC細胞的侵襲、遷移能力。

        A、C:Transwell細胞侵襲實驗(鋪Matrigel基底膜基質(zhì));B、D:Transwell細胞遷移實驗(不鋪基底膜基質(zhì));E、F:細胞劃痕實驗

        六、FBLN2下游信號通路的分析和驗證

        為進一步探究FBLN2影響CRC侵襲、轉(zhuǎn)移的機制,利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的625例CRC基因表達數(shù)據(jù),對FBLN2高表達組與低表達組間的差異表達基因進行基因集富集分析,包括HALLMARK基因集和KEGG基因集,富集分數(shù)(ES)最高的是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)通路(圖6),由此推測FBLN2可能通過激活EMT通路促進CRC侵襲、轉(zhuǎn)移。

        數(shù)據(jù)來源:TCGA數(shù)據(jù)庫COADREAD隊列,F(xiàn)BLN2低表達組312例,F(xiàn)BLN2高表達組312例

        為驗證FBLN2表達與EMT通路的相關性,予LOVO、SW620細胞分別轉(zhuǎn)染siRNA-ctrl和FBLN2 siRNA,結(jié)果顯示敲低FBLN2表達后,EMT通路關鍵分子CDH2、Snai1、Snai2/SLUG、VIM表達明顯降低,CDH1、ZO-1表達明顯升高(圖7A)。對TCGA數(shù)據(jù)庫CRC基因表達數(shù)據(jù)中的FBLN2表達與EMT通路分子表達行相關性分析,發(fā)現(xiàn)FBLN2與CDH2、Snai1、VIM表達均呈顯著正相關(圖7B),進一步驗證了FBLN2與EMT通路間的相關性,提示FBLN2促進 CRC侵襲、轉(zhuǎn)移可能與激活EMT通路有關。

        組間比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;ns:P>0.05

        討 論

        我國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,CRC的發(fā)病率和死亡率在主要癌癥中均居前列且呈逐年上升趨勢[2-3]。目前CRC患者死亡的主要原因仍為腫瘤轉(zhuǎn)移[4-6],但尚缺乏足夠的能有效預測轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子標志物。文獻資料顯示,近50%的CRC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移,約25%的患者確診時即合并肝轉(zhuǎn)移[5]。未經(jīng)治療的肝轉(zhuǎn)移患者中位生存期僅為6.9個月,轉(zhuǎn)移灶無法手術切除者5年生存率低于5%,而肝轉(zhuǎn)移灶完全切除者的中位生存期為35個月,5年生存率為30%~57%[13-16]。因此,及時篩查并發(fā)現(xiàn)發(fā)生轉(zhuǎn)移的CRC患者并予綜合治療對于改善其預后至關重要。針對CRC轉(zhuǎn)移進行早期篩查,以及尋找有效的轉(zhuǎn)移預測分子標志物成為近年來CRC防治研究的重點之一。

        ECM系指細胞周圍由多種大分子組成的復雜網(wǎng)絡結(jié)構,對于生理狀態(tài)下細胞外穩(wěn)態(tài)的維持以及腫瘤細胞的侵襲、播散均起有重要作用。本研究通過對公共數(shù)據(jù)庫CRC基因表達數(shù)據(jù)的生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)ECM蛋白FBLN2可能是促進CRC轉(zhuǎn)移的關鍵分子,其在CRC細胞和組織中均呈低表達,但在轉(zhuǎn)移性CRC中,其表達明顯高于非轉(zhuǎn)移性CRC,且對公共數(shù)據(jù)庫和臨床組織芯片數(shù)據(jù)的分析均顯示FBLN2表達隨CRC進展、轉(zhuǎn)移以及臨床分期的升高而升高,并與不良預后相關,提示FBLN2可能是在CRC進展后期和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用的關鍵分子。同時,細胞實驗中敲低FBLN2表達并不影響CRC細胞的增殖和克隆形成能力,但可顯著降低其侵襲和遷移能力,推測FBLN2在CRC腫瘤形成和維持腫瘤細胞增殖性方面的作用較弱,但隨著病情的進展,其表達激活可發(fā)揮促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。

        腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程,包括ECM降解、腫瘤細胞間的黏附性降低、腫瘤細胞與血管內(nèi)皮間的黏附性增強以及腫瘤微環(huán)境改變等[17-19]。EMT系指上皮細胞在某些細胞因子的作用下失去上皮特征而獲得間質(zhì)特征的過程,間質(zhì)特性的獲得可使腫瘤細胞更具運動性和侵襲性[20]。研究表明,EMT與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、免疫逃逸等惡性行為均具有密切聯(lián)系,是大部分類型的惡性腫瘤惡性演進過程中的重要環(huán)節(jié)[20-24]。EMT的發(fā)生與特定微環(huán)境密切相關,腫瘤微環(huán)境中存在大量基質(zhì)細胞、ECM蛋白、信號分子等,在EMT的發(fā)生中起有關鍵作用[25-26]。既往研究[9]發(fā)現(xiàn),fibulin蛋白家族成員FBLN5通過啟動和增強EMT參與了乳腺癌的發(fā)生和進展過程,由此推測FBLN2也可能參與了EMT的發(fā)生。

        本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中CRC病例基因表達譜的分析發(fā)現(xiàn)受FBLN2表達改變影響最顯著的通路為EMT通路,提示FBLN2可能通過激活EMT通路增強CRC細胞的侵襲、遷移能力,從而促進CRC轉(zhuǎn)移,并在細胞水平驗證了FBLN2與EMT通路重要分子標志物之間的相關性,F(xiàn)BLN2參與EMT的具體機制有待進一步探究。

        綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)FBLN2可能通過激活EMT通路促進CRC侵襲、轉(zhuǎn)移,與腫瘤臨床分期和預后密切相關。FBLN2在CRC中低表達但在腫瘤轉(zhuǎn)移時表達增高的特點,使之可能成為CRC轉(zhuǎn)移早期篩查的分子標志物,對CRC轉(zhuǎn)移的監(jiān)測和預后判斷具有潛在應用價值。后續(xù)擬針對FBLN2可能的上游激活信號分子、FBLN2激活EMT通路的具體機制及其是否可作為CRC轉(zhuǎn)移治療的靶點作進一步研究。

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