孔文娜 周 宓 林海霞 王任小

(1.上海大學(xué)理學(xué)院, 上海 200444;2.中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200032)

蛋白質(zhì)是生命體的重要組成部分, 是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者和執(zhí)行者.人類基因組由20 000～30 000 個(gè)可編碼超過(guò)50 萬(wàn)種不同蛋白質(zhì)的基因組成[1].隨著人類基因組計(jì)劃的完成,旨在研究全基因組水平上所有蛋白質(zhì)的表達(dá)、結(jié)構(gòu)以及功能[2]的蛋白質(zhì)組學(xué)已然成為后基因時(shí)代的研究熱點(diǎn).據(jù)估計(jì), 超過(guò)80%的蛋白質(zhì)并不是孤立存在, 而是與其他蛋白質(zhì)通過(guò)相互作用形成穩(wěn)定或瞬時(shí)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)[3].蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interactions,PPIs)是分子生物學(xué)中最重要的現(xiàn)象之一, 幾乎在所有的生命過(guò)程如細(xì)胞通訊、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答和基因轉(zhuǎn)錄中, 都起著核心作用.通過(guò)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用, 可以探究蛋白質(zhì)在生命過(guò)程中的作用以及發(fā)揮功能的機(jī)制, 更好地理解生命過(guò)程.因此, 對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究, 已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[4].

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是生物分子網(wǎng)絡(luò)中的基本組成元件, 但是異常的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用很有可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展.因此, 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)也成為新興的一類藥物靶點(diǎn), 例如G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)、核激素受體、離子通道和酶等[5].癌癥、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病等均有以靶向蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究, 如細(xì)胞色素c-細(xì)胞色素c 氧化酶[6]、PD-1-PD-L1[7]、APE1-Ref-1[8]、MDM2—p53[9]等.因此, 研究PPIs 為開(kāi)發(fā)治療疾病的新藥提供了更多機(jī)會(huì)[10].

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展, 用于表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法相繼提出。比較傳統(tǒng)的技術(shù)方法有熒光偏振、核磁共振、酵母雙雜交和免疫共沉淀等.近年來(lái)新發(fā)展的方法包括生物膜干涉技術(shù)、微量熱泳動(dòng)(microscale thermophoresis, MST)技術(shù)、AlphaScreen 和蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析技術(shù)等.表1 中總結(jié)了9 種基于生物物理和生物化學(xué)原理, 并被廣泛用于表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及近年來(lái)發(fā)展的新檢測(cè)方法.

表1 蛋白質(zhì)相互作用方法的比較分析Table 1 Comparisons of methods for protein-protein interaction

1 基于生物物理原理的檢測(cè)方法

1.1 表面等離子共振

表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR)是一種基于物質(zhì)間相互作用所導(dǎo)致芯片表面質(zhì)量變化而產(chǎn)生的一種光學(xué)現(xiàn)象。目前, SPR 生物傳感器已經(jīng)廣泛用于研究生物分子間的相互作用, 可以對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)、無(wú)標(biāo)記檢測(cè).SPR 的原理(見(jiàn)圖1(a))是先將一種蛋白質(zhì)分子通過(guò)共價(jià)結(jié)合或親和捕獲的方式固定在生物芯片表面, 再將待測(cè)分析物注入并流經(jīng)芯片表面, 蛋白質(zhì)分子間的結(jié)合會(huì)引起芯片表面質(zhì)量增加, 從而導(dǎo)致表面折射率按同比例增強(qiáng), 蛋白分子間反應(yīng)的變化即被觀察到, 這種變化用反應(yīng)單位(reaction unit,RU)來(lái)衡量.傳感器表面與待研究蛋白質(zhì)之間的界面是傳感器系統(tǒng)的重要組成部分, 一般購(gòu)買(mǎi)商業(yè)芯片, 其中包括通過(guò)氨基偶聯(lián)的CM5 芯片、用于固定His 標(biāo)簽蛋白的NTA 芯片和用于固定生物素化蛋白的SA 芯片.

圖1 表征PPIs 的生物物理方法示意圖Fig.1 Schematic diagrams of biophysics methods used to represent PPIs

與熒光或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)相比, SPR 技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn): ①測(cè)量基于折射率的變化, 分析物不需要任何標(biāo)記, 可直接檢測(cè); ②測(cè)量可以實(shí)時(shí)進(jìn)行, 研究人員能及時(shí)獲得動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和熱力學(xué)數(shù)據(jù); ③作為一種多功能技術(shù), 能夠檢測(cè)各種分子量的蛋白質(zhì).基于以上特點(diǎn), SPR 已成為研究生物分子間相互作用的有力工具[11].以MDM2-p53 的相互作用為例, Wu等[12]采用雙通道SPR 傳感器測(cè)定在肉瘤組織提取的游離態(tài)和與p53 結(jié)合的MDM2 的水平, 為了獲得更高的靈敏度和特異性, 使用MDM2 特異單克隆抗體(2A10)識(shí)別游離態(tài)和與p53 結(jié)合的MDM2, 發(fā)現(xiàn)由肉瘤組織提取的游離態(tài)和總MDM2(游離和結(jié)合形式組合)蛋白質(zhì)的濃度比正常組織提取的高, 并且與p53 結(jié)合的MDM2蛋白質(zhì)僅占總MDM2 濃度的一小部分.但是, SPR 技術(shù)的缺點(diǎn)是難以區(qū)分實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的非特異性吸附, 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響.

傳統(tǒng)的SPR 技術(shù)限于低通量研究, 因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)SPR 生物傳感器僅在單個(gè)傳感器芯片上包含3～4 個(gè)流動(dòng)池.如今隨著技術(shù)的革新, 表面等離子共振成像(surface plasmon resonance imaging, SPRI) 正在向高通量篩選(high-throughput screening, HTS)發(fā)展.結(jié)合蛋白質(zhì)陣列技術(shù)和電荷耦合器件(charge-coupled device, CCD)相機(jī), 并根據(jù)反射光的強(qiáng)度制作圖像,SPRI 已經(jīng)發(fā)展到能同時(shí)處理成千上萬(wàn)個(gè)樣本[10,13].

1.2 生物膜干涉

生物膜干涉(biolayer interferometry, BLI)是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種基于光干涉量度法的檢測(cè)技術(shù), 可用于實(shí)時(shí)、快速、以非標(biāo)記方式分析生物分子之間的相互作用.BLI 技術(shù)(見(jiàn)圖1(b))將相互作用的生物分子之一通過(guò)氨基偶聯(lián)、生物素/鏈霉親和素、組氨酸標(biāo)簽/鎳離子螯合劑等方式固定于光纖制成的生物傳感器末端, 形成生物膜層.當(dāng)一束可見(jiàn)光垂直入射生物膜層時(shí), 光在生物膜層的兩個(gè)界面反射后形成一束能被光譜儀檢測(cè)到的干涉光譜.當(dāng)固定分子與溶液中的分析物發(fā)生相互作用時(shí), 生物膜層厚度發(fā)生變化, 通過(guò)檢測(cè)干涉現(xiàn)象的相位移動(dòng),從而能夠分析結(jié)合到傳感器上的分子數(shù)量的變化[14-15].

BLI 技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛, 可以檢測(cè)生物分子之間是否存在特異性結(jié)合.研究人員已將BLI 技術(shù)廣泛用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究, 如Pogoutse等[16]利用BLI 技術(shù)測(cè)定兩組蛋白質(zhì)相互作用對(duì)Mms2/Ubc13、鐵轉(zhuǎn)蛋白/TbpB 間的結(jié)合常數(shù).該工作采用了鏈霉親和素固定的方式, 目標(biāo)蛋白在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)生物素?；^(guò)程, 隨后以細(xì)胞裂解液取代純化的蛋白, 通過(guò)BLI 測(cè)得結(jié)合常數(shù), 既經(jīng)濟(jì)又省時(shí).

BLI 技術(shù)具備實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、非標(biāo)記、高通量、快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn), 可檢測(cè)親和力為10?10～10?4mol/L 的相互作用, 并且可提供結(jié)合的親和力KD值及動(dòng)力學(xué)信息.相比表面等離子共振的微流控系統(tǒng), BLI 技術(shù)侵入即讀的檢測(cè)手法更為簡(jiǎn)便, 且實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受樣品折射率影響,但是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意分析物是否與生物膜層存在非特異結(jié)合.另外, 樣品緩沖液中所包含的部分去垢劑可能形成非均勻膠束, 從而引起生物膜層非均勻性厚度變化, 對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響[15].

1.3 微量熱泳動(dòng)

MST 技術(shù)可以檢測(cè)分子在微觀溫度梯度場(chǎng)中的定向運(yùn)動(dòng), 因此也被稱之為熱泳動(dòng).定向運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象對(duì)由結(jié)合引起的分子大小、電荷、構(gòu)象或水化層的細(xì)微變化十分敏感, 因而可以用來(lái)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用[17].MST 技術(shù)示意圖見(jiàn)圖1(c).實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 對(duì)相互作用的蛋白質(zhì)分子其中之一進(jìn)行熒光標(biāo)記, 以溶液形式均勻分布于毛細(xì)管中.隨后, 毛細(xì)管在紅外激光照射下形成局部溫度梯度, 標(biāo)記分子因熱泳動(dòng)作用力而遠(yuǎn)離加熱區(qū)域, 經(jīng)歷溫度躍遷(T-jump)后達(dá)到穩(wěn)定態(tài).在關(guān)閉激光后, 標(biāo)記分子經(jīng)歷逆向溫度躍遷和反向擴(kuò)散后, 恢復(fù)到均勻分布的狀態(tài)[18-20].上述這一過(guò)程會(huì)受到由結(jié)合引起的分子大小、電荷或水化層變化的影響,因而通過(guò)逐步滴定與標(biāo)記分子相互作用的蛋白質(zhì), MST 技術(shù)可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的解離常數(shù)[21-22].

MST 技術(shù)可以很容易地測(cè)量蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程, 目前越來(lái)越多地應(yīng)用于與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用的研究中, 從而揭示疾病發(fā)生的分子機(jī)制.例如, 纖毛結(jié)構(gòu)或者長(zhǎng)度的失調(diào)會(huì)引發(fā)疾病.纖毛的前體微管蛋白(tubulin)在纖毛內(nèi)運(yùn)輸與兩個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)IFT74 和IFT81有關(guān).Bhogaraju等[23]利用MST 技術(shù)研究人類重組IFT81、IFT74 與牛的αβ-tubulin 之間的偶聯(lián)特征, 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IFT74/81 復(fù)合物比單獨(dú)IFT81 與tubulin 的結(jié)合力大大增強(qiáng), 證明了與tubulin 相偶聯(lián)的模塊是由IFT74/81 復(fù)合物組成, 而不是單獨(dú)的IFT81.

MST 技術(shù)相比與其他體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)在于: ①樣品無(wú)需固定處理; ②樣品用量少,可對(duì)μL 級(jí)的溶液進(jìn)行檢測(cè); ③對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量沒(méi)有限制; ④可以進(jìn)行快速檢測(cè), 結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)可在10 min 內(nèi)完成測(cè)定; ⑤可以測(cè)定pmol/L 級(jí)的親和活性.此外, MST 技術(shù)可以對(duì)復(fù)雜的生物體系如細(xì)胞裂解液、血漿等進(jìn)行測(cè)定[24].通常, MST 技術(shù)需要熒光團(tuán)標(biāo)記蛋白質(zhì)分子.

2 基于生物化學(xué)原理的檢測(cè)方法

2.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 是指熒光供體在受到激發(fā)光激發(fā)后不發(fā)射出光子而將激發(fā)的能量轉(zhuǎn)移到熒光受體上的現(xiàn)象(見(jiàn)圖2(a))[25].在對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究中, 分子間FRET 僅在熒光供體和受體相距非常近即形成復(fù)合物時(shí)發(fā)生.因此, 要產(chǎn)生FRET 現(xiàn)象需要滿足3 個(gè)條件: ①供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜有重疊; ②熒光供體和受體之間的距離在10 nmol/L 范圍內(nèi); ③供體與受體之間遷移偶極子的方向平行.目前, 廣泛用于供體與受體標(biāo)記的熒光染料來(lái)自于綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的變異體, 包括青色熒光蛋白-黃色熒光蛋白(cyan fluorescent protein-yellow fluorescent protein, CFP-YFP)[26]、藍(lán)色熒光蛋白-GFP(blue fluorescent protein-GFP, BFP-GFP)[27]、CyPet-Ypet[28]、MiCy-mKO[29]、CrFP-YFP[30]等.隨著對(duì)FRET 方法的優(yōu)化, 該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于體外測(cè)定結(jié)合活性并篩選蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用抑制劑[10,31].蛋白被小型泛素樣修飾物(small ubiquitin-like modifier, SUMO)修飾是真核生物界的重要修飾途徑.SUMO可以組裝成聚合鏈, 與包含兩個(gè)SUMO 相互作用基序(SUMO-interaction motif, SIM)的受體蛋白質(zhì)相結(jié)合, 從而對(duì)受體蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾.Kost等[32]設(shè)計(jì)了一種FRET 傳感器, 用于測(cè)定SUMO 線型二聚體與包含SIM 蛋白質(zhì)的結(jié)合,利用馬來(lái)酰亞胺和銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將合成受體和供體的染料偶聯(lián)到SUMO 亞基上, 在多個(gè)SIM 配體存在的情況下監(jiān)測(cè)FRET 變化.因此,開(kāi)發(fā)FRET 傳感器對(duì)于研究SUMO-SIM的相互作用具有非常重要的價(jià)值.

圖2 表征PPIs 的生物化學(xué)方法示意圖Fig.2 Schematic diagram of biochemical methods used to represent PPIs

結(jié)合顯微成像技術(shù)的FRET 可對(duì)活細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)蛋白質(zhì)分子間相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察和定量測(cè)定, 具有非常高的時(shí)空分辨率.然而, 由于FRET 顯微鏡依賴于從蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中收集熒光信號(hào), 因此它具有一些缺點(diǎn), 包括自發(fā)熒光、檢測(cè)器噪聲、光學(xué)噪聲干擾等.FRET技術(shù)也可與流式細(xì)胞儀聯(lián)用.Mahajan等[33]利用FRET 與流式細(xì)胞儀相結(jié)合, 研究酵母細(xì)胞中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用, 在短時(shí)間內(nèi)分析大量細(xì)胞, 在統(tǒng)計(jì)學(xué)上產(chǎn)生比顯微鏡技術(shù)更強(qiáng)大的結(jié)果.

2.2 AlphaScreen 技術(shù)

AlphaScreen 技術(shù)及AlphaLISA 技術(shù)都是利用作為供體和受體的微珠來(lái)檢測(cè)生物分子間的相互作用.這一方法(見(jiàn)圖2(b))的關(guān)鍵組分為直徑為250～350 nm, 并分別被不同官能團(tuán)包裹的供體微珠和受體微珠, 它們分別作為光敏劑和化學(xué)發(fā)光單元.在PPIs 的研究中, 在波長(zhǎng)為680 nm 的激光照射下, 兩個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)的相互作用會(huì)將供體微珠和受體微珠拉近, 其中供體微珠上的光敏劑將周?chē)h(huán)境中的氧氣激發(fā)為活潑的單線態(tài)氧, 單線態(tài)氧擴(kuò)散至受體微珠, 并與受體微珠上的化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng), 進(jìn)一步激活了受體微珠上的熒光基團(tuán), 使之發(fā)出520～620 nm 的熒光, 從而被檢測(cè)[34-35].

AlphaScreen 技術(shù)可應(yīng)用于復(fù)雜的蛋白質(zhì)之間的相互作用, 包括配體與GPCR 結(jié)合[36]、激酶與底物結(jié)合[37]、生長(zhǎng)因子與受體的結(jié)合[38]以及轉(zhuǎn)錄因子同激活子或抑制子[39]之間的相互作用等.分選蛋白(sorting nexin, SNX) 在真核生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能調(diào)節(jié)上具有重要的作用,Sierecki等[40]利用AlphaScreen 方法研究了含有BAR 結(jié)構(gòu)域的分選蛋白(SNX-BAR)家族中的PPIs 與蛋白質(zhì)同源二聚和異源二聚現(xiàn)象之間的聯(lián)系, 檢測(cè)了144 對(duì)可能存在的PPIs, 最終發(fā)現(xiàn)9 種SNX-BAR 蛋白質(zhì)間相互作用對(duì)同源二聚現(xiàn)象有重要調(diào)節(jié)作用, 7 種蛋白質(zhì)相互作用對(duì)與異源二聚現(xiàn)象有重要聯(lián)系.

AlphaScreen 是一種多功能且靈敏度高的技術(shù), 可進(jìn)行高通量篩選[41].相比于其他技術(shù),AlphaScreen 具有以下優(yōu)勢(shì): ①對(duì)比能量傳輸距離為10 nm 的FRET 技術(shù), AlphaScreen 為200 nm, 可以研究更大范圍的分析物, 如全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)或免疫復(fù)合物; ②具有更大的親和力檢測(cè)范圍,KD值范圍可以從pmol/L 到mmol/L.但是, 每種類型的微珠都有一定的容量, 過(guò)量的靶蛋白會(huì)使供體微珠或受體微珠過(guò)飽和并抑制它們的結(jié)合, 導(dǎo)致信號(hào)減弱.因此, 事先進(jìn)行交叉滴定分析來(lái)確定合適的蛋白濃度對(duì)于AlphaScreen 方法是必不可少的.

2.3 蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析

蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析(protein-fragment complementation assay, PCA)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的重要策略之一, 可以在體內(nèi)外動(dòng)態(tài)地觀察活細(xì)胞、器官, 甚至個(gè)體水平蛋白質(zhì)間的相互作用[42], 也可以實(shí)時(shí)定量動(dòng)態(tài)反映復(fù)合物的組裝與解離過(guò)程.PCA 技術(shù)的原理(見(jiàn)圖2(c))是將某個(gè)功能蛋白質(zhì)切成兩段, 分別與兩種興趣蛋白質(zhì)相連形成兩個(gè)融合蛋白質(zhì), 若兩個(gè)興趣蛋白質(zhì)存在相互作用使得兩個(gè)功能蛋白質(zhì)片段相互靠近, 互補(bǔ)并重建功能蛋白質(zhì)的活性, 通過(guò)檢測(cè)功能蛋白質(zhì)的活性進(jìn)而判斷興趣蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系.在PCA 體系中功能蛋白質(zhì)的兩個(gè)片段相互融合即形成報(bào)告蛋白.目前,PCA 所使用的報(bào)告蛋白包括二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)[43]、β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)[44]、GFP[45]和熒光素酶[46]等.PCA 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是具有高靈敏度、可定量檢測(cè)、可進(jìn)行高通量篩選, 缺點(diǎn)是融合蛋白的使用有可能會(huì)改變興趣蛋白的折疊和結(jié)構(gòu).

基于DHFR 的PCA 方法的原理是DHFR 可以催化二氫葉酸還原成四氫葉酸, 四氫葉酸對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖至關(guān)重要, 缺失會(huì)致死, 因此DHFR 成為極佳的報(bào)告蛋白(report protein)應(yīng)用于PCA 的研究.這種簡(jiǎn)單的生存選擇測(cè)定法被廣泛用作大規(guī)模分析的系統(tǒng)方法.Rochette等[47]利用DHFR-PCA 的方法研究酵母全局組織的PPIs 網(wǎng)絡(luò)對(duì)于環(huán)境擾動(dòng)的響應(yīng),高通量篩選了正常狀態(tài)和藥物誘導(dǎo)DNA 損傷兩種情況下的1 000 多種PPIs, 最終發(fā)現(xiàn)156 種PPIs 在對(duì)DNA 損傷響應(yīng)的調(diào)節(jié)中具有重要作用.

基于熒光蛋白質(zhì)的PCA 方法也稱為雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescent complimentary, BiFC), 由于發(fā)色團(tuán)的形成不可逆, 該方法更有利于捕獲蛋白質(zhì)間的弱相互作用, 并且能夠在高空間分辨率的條件下直接觀察到生物體和各種細(xì)胞類型的任何亞細(xì)胞區(qū)室中的PPIs.新發(fā)展的GFP 三裂法, 可以最大程度避免傳統(tǒng)分裂GFP 方法中遇到的聚集和折疊干擾問(wèn)題[48].但是與其他報(bào)告蛋白相比, 基于熒光蛋白的PCA 不適用于定量化研究,僅能作為定性研究.BiFC 技術(shù)最大的缺陷是對(duì)溫度敏感, 當(dāng)溫度高時(shí), 片段間不易互補(bǔ)形成完整的熒光蛋白.

2.4 親和層析

親和層析(affinity chromatography, AC)一般指親和色譜.親和色譜法是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究方法, 它是基于蛋白質(zhì)分子之間高度特異性相互作用將特定蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離純化出來(lái)[10].這種方法極大地提高了蛋白質(zhì)純化效率, 為蛋白質(zhì)-蛋白相互作用研究提供技術(shù)平臺(tái).親和色譜法包括拉下法、串聯(lián)親和純化和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)法等.

(1) 拉下(pull-down)法.拉下法是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)大技術(shù)之一, 原理是將GST 融合的誘餌蛋白質(zhì)固定在谷胱甘肽固相載體上, 用以捕獲與之相互作用的目標(biāo)蛋白質(zhì),然后洗脫結(jié)合物并通過(guò)SDS-PAGE 電泳分析鑒定(見(jiàn)圖2(d)).拉下法可用于研究可疑或未知的PPI.Luo等[49]對(duì)拉下法進(jìn)行改進(jìn), 提出一步胰蛋白酶裂解洗脫法來(lái)研究鳥(niǎo)苷三磷酸酶(GTPase)Rab31 與EEA1 間的相互作用, 有效地減少假陽(yáng)性和假陰性現(xiàn)象.Schulte等[50]研究了一種SINBAD 微型拉下法用于檢測(cè)PPI, 通過(guò)熒光顯微鏡觀察單個(gè)親和層析磁珠表面親和標(biāo)記的興趣蛋白質(zhì)與不同顏色量子點(diǎn)標(biāo)記的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合, 這種方法可以同時(shí)分析多組PPIs, 減少實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間和材料.

(2) 串聯(lián)親和純化(tandem affinity purification, TAP)法.TAP 法采用兩步親和純化(見(jiàn)圖2(e)), 能夠快速研究在生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)的相互作用.TAP 法可以提高特異性, 有效減少非特異性結(jié)合, 大大降低結(jié)果的假陽(yáng)性率.例如, 鼠傷寒沙門(mén)氏菌通過(guò)三型分泌系統(tǒng)(type 3 secretion system, T3SS)向宿主傳遞效應(yīng)蛋白質(zhì)SopA, 刺激腸上皮引發(fā)炎癥反應(yīng).Kamanova等[51]在SopA 上融合表達(dá)GST 和flag 兩個(gè)標(biāo)簽, 通過(guò)TAP 體外純化, 質(zhì)譜分析鑒定, 確定與SopA 相互作用的兩個(gè)E3 泛素連接酶TRIM56 和TRIM65.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),SopA 與這兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合后, 通過(guò)兩個(gè)先天免疫受體MDA5 和RIG-Ⅰ來(lái)刺激宿主的免疫信號(hào).這一研究揭示了沙門(mén)氏菌可以通過(guò)直接作用于宿主先天免疫信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的沙門(mén)氏菌作用機(jī)制.但是, TAP 法不容易檢測(cè)到弱的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用.

(3) Co-IP 法.免疫共沉淀法被廣泛應(yīng)用于PPIs 的研究中, 是確定生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)PPI 的有效方法.其原理是以抗原抗體之間的專一性為基礎(chǔ), 將蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀在固相載體上, 再通過(guò)蛋白質(zhì)變性分離, 檢測(cè)結(jié)合蛋白質(zhì), 進(jìn)而證明蛋白質(zhì)間的相互作用(見(jiàn)圖2(f)).Co-IP 方法研究自然狀態(tài)下的PPI, 避免人為干擾, 可信度高, 但不易檢測(cè)親和力較弱的PPIs.Fedosejevs等[52]利用該技術(shù)研究在蓖麻油籽中SUS 與RGP 間的相互作用, 使用抗體蔗糖合酶1(sucrose synthase-1, RcSUS 1)免疫沉淀蛋白質(zhì)復(fù)合物RcSUS 1 和RcRGP 1, 通過(guò)鑒定確定RcSUS 1 與RcRGP 1 間存在明顯相互作用, 進(jìn)而證明了在植物的發(fā)育種子和根中SUS與RGP 通過(guò)相互作用, 促進(jìn)源自蔗糖的UDP-葡萄糖用于半纖維素和糖蛋白的生物合成, 為SUS-RGP 代謝物提供證據(jù).這一結(jié)果有助于更好理解種子中碳代謝和光合產(chǎn)物的分配, 在代謝工程中具有潛在應(yīng)用價(jià)值.

3 結(jié)束語(yǔ)

近年來(lái)表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn), 并向高靈敏度、高通量的方向發(fā)展.根據(jù)研究目標(biāo)的不同以及蛋白質(zhì)自身的特點(diǎn), 選擇合理的檢測(cè)方法十分重要.若要定性表征蛋白質(zhì)分子間是否存在相互作用, 可以選擇傳統(tǒng)的拉下法、TAP、Co-IP 等方法進(jìn)行檢測(cè); 若要定量測(cè)量蛋白質(zhì)分子間的相互作用, 可以選擇MST, SPR, PLI 等方法進(jìn)行檢測(cè);若要進(jìn)行高通量的研究, 可以選擇FRET, AlphaScreen, PCA 等方法進(jìn)行檢測(cè).所有方法都有其自身的局限性, 可能在檢測(cè)中出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果.因此, 應(yīng)該使用基于不同原理的技術(shù)方法相互驗(yàn)證, 以獲得更為可靠的結(jié)果.同時(shí), 不同技術(shù)方法的聯(lián)用可彌補(bǔ)單種技術(shù)的不足.例如, 借助質(zhì)譜的高靈敏度、高通量的優(yōu)勢(shì), 親和層析可以與質(zhì)譜(mass spectroscopy,MS)聯(lián)用(即AP-MS)鑒定與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì), 以獲得更完整的信息.隨著技術(shù)方法的持續(xù)進(jìn)步, 在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域?qū)?huì)更廣泛地應(yīng)用上述技術(shù).預(yù)計(jì)檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)將向高通量方向發(fā)展, 并將會(huì)產(chǎn)生大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù), 因此需要發(fā)展更強(qiáng)大的生物信息處理工具將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成有用的信息.