任 瑩，李大剛，王 虎，劉 靜，張宗鵬△

（1.安徽省太和縣中醫(yī)院，安徽 阜陽 236600；2.天津藥物研究院有限公司，天津 300193）

熱毒寧口服液是省級名中醫(yī)丁超主任醫(yī)師根據(jù)中 醫(yī)理論制訂的臨床經(jīng)驗(yàn)方，用于治療風(fēng)溫肺熱病風(fēng)邪犯肺證，療效顯著[1]。其由金銀花、連翹、大青葉等6味藥材組方，具有清熱解毒、調(diào)和營衛(wèi)、辛涼透表、益氣和胃功效，主治高熱煩躁、高熱抽搐、頭痛身痛、急性咽炎、扁桃體炎、流感肺炎等。方中連翹為君藥，清熱解毒，消腫散結(jié)，疏散風(fēng)熱?，F(xiàn)代藥理研究表明，連翹苷具有顯著的抑菌和抗炎活性[2-3]，能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生的炎性反應(yīng)[4]，通過抑制肝細(xì)胞的凋亡在酒精性肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[5]，故優(yōu)選連翹飲片的含量成分連翹苷作為質(zhì)量控制指標(biāo)。本研究中對處方各藥味進(jìn)行了定性鑒別，建立了熱毒寧口服液中金銀花、大青葉、柴胡、甘草的薄層鑒別方法及測定連翹苷含量的高效液相色譜（HPLC）法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-40D型高效液相色譜儀（PDA極管陣列檢測器，株式會社島津研究所）；Ultimate3000型高效液相色譜儀（紫外檢測器，賽默飛世爾科技有限公司）；XSE105DU型分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為十萬分之一）；KQ-300DE型超聲清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；ZF-2型三用紫外分析儀（上海安亭電子儀器廠）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號為110753-201817，純度為96.8%），靛玉紅對照品（批號為110717-201805，純度為99.6%），柴胡對照藥材（批號為120992-201509），連翹苷對照品（批號為 110821-201816，純度為95.1% ），甘草對照藥材（批號為 120904-201620），均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈、甲醇均為色譜純（美國天地有限公司）；水為超純水，其余試劑為分析純；熱毒寧口服液（太和縣中醫(yī)院醫(yī)院制劑，批號分別為20042001，20042201，20042401）；缺味陰性樣品由實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜定性鑒別

金銀花[6-9]：取樣品溶液 1 mL，加乙醇 2 mL[7]544，搖勻，作為供試品溶液。按樣品制備工藝制備缺金銀花的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺金銀花的陰性對照品溶液。另取綠原酸對照品，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述溶液各1～2 μL，點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸（8 ∶1 ∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與綠原酸對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

大青葉[10-11]：取樣品溶液20 mL，加乙醚提取2次，每次20 mL，保存水液，待用，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。再按樣品制備工藝制備缺大青葉的陰性樣品，按前述方法平行制備缺大青葉的陰性對照品溶液。取靛玉紅對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷 -乙酸乙酯（3∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

1.對照品溶液 2.陰性對照品溶液 3-5.供試品溶液 6.對照藥材溶液A.金銀花 B.大青葉 C.柴胡 D.甘草圖1 薄層色譜圖1.reference solution 2.negative reference solution 3-5.test solution 6.reference material solutionA.Flos Lonicerae B.Folium Isatidis C.Radix Bupleuri D.Radix GlycyrrhizaeFig.1 TLC chromatograms

柴胡[12]：取上述大青葉鑒別項(xiàng)下的水液，用水飽和正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液40 mL清洗1次，棄去氨試液，再以正丁醇飽和水洗2次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。再按樣品制備工藝制備缺柴胡的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺柴胡的陰性對照品溶液。取柴胡對照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，超聲處理（功率為 300 W，頻率為 40 kHz）10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為對照藥材溶液。分別吸取上述溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯 -乙醇 -水（12∶2∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，60℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。甘草：取樣品溶液30 mL，加乙醚提取2次，每次30 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。再按樣品制備工藝制備缺甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺甘草的陰性對照品溶液。取甘草對照藥材1 g，加甲醇80 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，加水40mL使溶解，用乙酸乙酯提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。分別吸取上述對照藥材溶液 5 μL，供試品溶液、陰性對照品溶液各 10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15 ∶1 ∶1 ∶2，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1 D。

2.2 高效液相色譜法測定連翹苷含量

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：島津 WondaCract ODS-2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -水（30 ∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：277 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按連翹苷峰計不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

取連翹苷對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為每1 mL含26 μg的溶液，即得對照品溶液。精密量取樣品溶液2 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取濾液，即得供試品溶液。按熱毒寧口服液的制備工藝制備缺連翹的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備缺連翹的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：精密吸取2.2.2項(xiàng)下溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果供試品溶液中的連翹苷峰分離度良好，陰性對照品溶液色譜中未見連翹苷干擾峰。詳見圖2。

A.供試品溶液 B.對照品溶液 C.陰性對照品溶液圖2 高效液相色譜圖A.Test solution B.Reference solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取質(zhì)量濃度為0.442 mg/mL的對照品溶液，用甲醇逐級稀釋成0.221 0，0.044 2，0.026 52，0.013 26，0.006 63 mg/mL 系列質(zhì)量濃度的連翹苷對照品溶液，精密吸取上述對照品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以連翹苷的峰面積（X）為橫坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=1.350 4 × 10-7X-0.000 929 25，r=0.999 99（n=5）。結(jié)果表明，連翹苷質(zhì)量濃度在0.00663～0.22100mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為26.52 μg/mL的同一對照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果連翹苷峰面積的RSD為0.96%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為20042401）6份，依法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定。結(jié)果連翹苷峰面積的RSD為1.80%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號為20042401），依法制備供試品溶液，于配制后 0，2，4，8，12，24 h 時分別精密進(jìn)樣10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果連翹苷峰面積的 RSD為1.90%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量為0.6636mg/mL的樣品9份，各1 mL，平行 3份，3個水平，按75%，100%，125%濃度分別加入連翹苷對照品，依法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，每批次平行制備2份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果批號為20042001，20042201，20042401的樣品中連翹苷含量分別為 0.579 3，0.554 6，0.651 1 mg/mL（n=2）。

3 討論

3.1 薄層鑒別

金銀花素有中藥中的抗生素之美譽(yù)[13]，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效，用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金銀花提取物及其所含的化學(xué)成分具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝、抗腫瘤等多種藥理活性[14]。常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用金銀花口服液，可顯著改善新型冠狀病毒肺炎患者發(fā)熱、乏力、咳嗽的癥狀，減輕肺部病變，改善呼吸功能，對病毒核酸轉(zhuǎn)陰也顯示出良好的改善趨勢[15]。方中大青葉有良好的抗病毒活性，對甲型流感病毒、乙型腦炎病毒、腮腺炎病毒等均有很好的抑制作用[16]；柴胡性涼，味苦，入肝膽經(jīng)，用于治療寒熱往來、胸滿肋痛、口苦耳聾等證，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、降溫、鎮(zhèn)咳、抗炎、保肝、抗腫瘤、降血壓、抑制由組胺和5-羥色胺引起的血管通透性增加等作用[17]；甘草性平，味甘，補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，具有增強(qiáng)免疫及抗炎作用[18-19]。

表1 連翹苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of recovery tests of phillyrin（n=9）

3.2 色譜條件優(yōu)化

熱毒寧口服液中連翹苷的含量測定依據(jù)2015年版《中國藥典（一部）》[7]170和文獻(xiàn)[20-22]中連翹的含量測定方法，適當(dāng)調(diào)整，最終確定了測定連翹苷含量的色譜條件。首先，進(jìn)行全波長掃描，取連翹苷對照品溶液注入高效液相色譜儀（PDA檢測器）檢測，記錄連翹苷的色譜圖，結(jié)合參考文獻(xiàn)，將檢測波長定為277 nm。并在此基礎(chǔ)上對柱溫（25，30，35 ℃）、流速（0.9，1.0，1.1 mL/min）、色譜柱（大連依利特、賽默飛、島津）、不同比例流動相進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示該方法用于測定熱毒寧口服液中連翹苷的含量耐用性好。

3.3 方法評價

本研究中建立的熱毒寧口服液中金銀花、柴胡、大青葉、甘草的薄層鑒別方法和測定連翹苷含量的高效液相色譜法，專屬性、耐用性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性均較好，可為熱毒寧口服液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。