宋德芳，李 恒

（武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所，湖北 武漢 430075）

摻偽染色是中藥材和飲片存在的主要質(zhì)量問題之一。不法生產(chǎn)企業(yè)為了提高藥材的品相，以次充好，以假充真，常對藥材進(jìn)行非法染色，以獲取暴利。藥材和飲片非法染色劑多為人工合成色素，其中偶氮類人工合成色素具有致癌、致突變毒性。因此，非法染色的假劣藥材（飲片）或由其投料生產(chǎn)的中成藥可能存在安全隱患。紅花、西紅花、朱砂、五味子、血竭、蒲黃等易染色品種及由其投料生產(chǎn)的中成藥多見中藥非法染色，其檢測方法主要有光譜法、色譜法、質(zhì)譜法及各種聯(lián)用技術(shù)，光譜法主要適用于快速檢測，色譜法、質(zhì)譜法主要適用于實驗室定性及定量檢測。在此，綜述了近年來常見中藥非法染色品種、非法染色劑及非法染色檢測方法，為高通量、強(qiáng)專屬性、普適性染色檢測方法的研究提供依據(jù)。

1 常見染色品種及染色劑

非法染色研究主要集中在紅花[1-4]、西紅花[4-6]、朱砂[4-7]、血竭[4，6]、五味子[8]、丹參[3，8-9]、大黃[3，8]、蒲黃[3-4，10]、延胡索[3-4，6，11]、關(guān)黃柏[12]、黃連[4]、菟絲子[13]、烏梅[3-4，14]、何首烏[3]、人工牛黃[15]等易染色品種及由其投料生產(chǎn)的中成藥，如千金止帶丸[2]、跌打丸[16]、蛤蚧定喘丸[17]、天王補(bǔ)心丸[18]等。常用染色劑有黃色系（金胺O、檸檬黃、日落黃、皂黃、金橙Ⅱ等）、紅色系（酸性紅73，胭脂紅，偶氮玉紅，赤蘚紅，莧菜紅，808猩紅，蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ，新品紅等）等合成色素。中藥常見染色品種及其常見染色劑見表1。

2 非法染色檢測方法

2.1 光譜法

2.1.1 拉曼光譜法

表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)（SERS）在色素快檢技術(shù)領(lǐng)域有較多的應(yīng)用。中藥染色檢測多采用表面噴有銀溶膠的薄層板或用浸泡法制備的銀膠紙作為SERS的基底，將乙醇或乙醇-水溶液濕潤的藥材（飲片）按壓或擦拭在表面噴有銀溶膠的薄層板上或銀膠紙上，對按壓或擦拭區(qū)域進(jìn)行SERS檢測，此方法快速、簡單、靈敏、無損，可滿足現(xiàn)場快檢的需求。張彬彬等[19]利用薄層色譜-SERS成功檢測經(jīng)金胺O、新品紅、檸檬黃和胭脂紅4種常見染料染色的西紅花藥材。李丹等[20]利用紙基-SERS成功檢測經(jīng)甲基紅、堿性品紅、金胺O和對氨基偶氮苯4種常見染料染色的紅花藥材。張國慶等[21]采用紙基-SERS成功檢測經(jīng)低濃度酸性紅、赤蘚紅染色的南五味子。

表1 中藥常見染色品種及常見染色劑Tab.1 Synthetic pigments and its varieties frequently used in herbal medicines

SERS法為染色中藥材的鑒別及中藥材質(zhì)量監(jiān)督提供了一種新的快速、可靠的分析方法。潤濕劑的濃度、銀溶膠的噴灑時間和噴灑量是薄層色譜-SERS需考察優(yōu)化的重點；銀溶膠的濃縮倍數(shù)、銀膠紙的SERS增強(qiáng)效果及穩(wěn)定性是紙基-SERS需考察的因素。

另外，顯微聚焦拉曼技術(shù)也用于中藥染色檢測，如李慶等[22]利用顯微拉曼技術(shù)快速、無損傷鑒別區(qū)分丹參表面染色物，但尚不能確定為哪種染色物質(zhì)。顯微聚焦拉曼技術(shù)具有快速、不損傷樣品、環(huán)境友好的特點，可為中藥材特別是貴細(xì)中藥材染色物的快速、無損傷判斷提供參考。

2.1.2 近紅外光譜法

近紅外光譜（NIRS）技術(shù)是近年來用于中藥鑒定的光譜分析技術(shù)之一，除具有無損、快速的優(yōu)點外，還可用于定量檢測。NIRS技術(shù)多與主成分分析、偏最小二乘回歸等分析方法聯(lián)合使用，以實現(xiàn)非法染色的快速檢測。劉攀顏等[1]的研究顯示，NIRS法鑒別紅花與染色紅花的結(jié)果與性狀鑒別和高效液相色譜法鑒別的結(jié)果一致，建立的NIRS方法可快速、準(zhǔn)確地檢測出染色紅花，且能測定染料的含量；77份染色紅花中均檢出檸檬黃、胭脂紅、日落黃，表明購于成都荷花池中藥材專業(yè)市場的染色紅花主要添加了上述染料。

2.2 色譜法

2.2.1 薄層色譜（TLC）法

TLC法操作簡單、快速、成本低，適用于非法染色的快速篩查。中藥非法染色薄層色譜篩查，多根據(jù)色素的溶解性質(zhì)采用不同的展開體系。李啟艷等[23]采用TLC法快速篩查中藥中的29種非法添加色素，以石油醚（60～90℃）-丙酮 -乙酸乙酯（100∶3∶4，V/V/V）為展開劑展開脂溶性色素，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水 -水（1∶3∶3∶1∶1，V/V/V/V/V）為展開劑展開水溶性色素，在可見光下檢視，各色素分離效果較好，Rf值均在理想范圍內(nèi)。

對于基質(zhì)復(fù)雜、需進(jìn)行多組分篩查的樣品，可采用二次展開，使各個目標(biāo)色素達(dá)到較好的分離。如于亞男等[9]采用TLC法二次展開的同時鑒別丹參中非法添加的9種黃色合成色素，結(jié)果10批丹參樣品中有1批檢出金橙Ⅱ，2批樣品檢出金胺O。對于常規(guī)染色定性篩查，TLC法不失為一種經(jīng)典實用的初篩方法。

2.2.2 液相色譜法

液相色譜法在中藥非法染色檢測中應(yīng)用較普遍，通過比較樣品和對照品的保留時間、紫外可見吸收光譜的一致性進(jìn)行判斷。樣品提取溶劑根據(jù)色素的極性和酸堿性而異，提取溶劑多采用低濃度或高濃度乙醇、70%甲醇或甲醇、乙腈-甲醇混合溶液、含酸或含堿的甲醇（乙醇或乙腈）溶液，流動相多采用甲醇/乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液。

李啟艷等[5]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法同時測定-中藥材中非法添加的20種常用紅色及橙色系人工合成色素，于市售西紅花、朱砂樣品中檢出酸性橙Ⅱ及808猩紅。

胡立立等[24]建立了同時測定丹參中9種黃色合成色素的HPLC法，10批丹參藥材中1批檢出檸檬黃和日落黃，1批檢出金胺O。

任榮軍等[25]建立了陰離子交換固相萃取-高效液相色譜法快速測定中成藥中10種合成色素的方法，樣品用70%乙醇超聲提取，經(jīng)陰離子交換固相萃取去除大部分基質(zhì)干擾，可用于中成藥中莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅、酸性紅73、新品紅、羅丹明B、蘇丹紅Ⅰ、808猩紅、蘇丹紅Ⅳ10種合成色素的檢測。

此外，超高效液相色譜-二極管陣列檢測器（UPLC-DAD）技術(shù)的引入，極大地縮短了分析時間，提高了分離效能。羅鐳等[11]采用UPLC-DAD法同時測定延胡索和紅花中28種人工合成色素，2批延胡索檢出金胺O。與常規(guī)HPLC法相比，UPLC法分離效率更高，分析時間更短，溶劑用量更少，且峰型尖銳，理論板數(shù)高。

2.2.3 其他

康帥等[15]將中藥傳統(tǒng)性狀鑒定與體式顯微和光學(xué)顯微技術(shù)相結(jié)合，鑒定并報道了一種新發(fā)現(xiàn)的牛黃偽品，采用HPLC-DAD法和高效液相色譜 -質(zhì)譜（HPLC-MS）法進(jìn)行確證。結(jié)果表明，牛黃與該偽品在層紋的斷面特征及顆粒狀團(tuán)塊的顯微特征2個方面均有差異。偽品主要以淀粉和色素混合制作而成，摻有金胺O、皂黃、金橙Ⅱ、檸檬黃、胭脂紅5種染色物。

2.3 質(zhì)譜法及聯(lián)用技術(shù)

2.3.1 基于選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）、多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)

該方法將UPLC的高速、高分離度與串聯(lián)四級桿質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度相結(jié)合，具有通用性強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高、便捷、省時的優(yōu)點。

朱日然等[6]建立了UPLC-MS/MS法，同時測定中藥材及飲片中可能添加的29種合成著色劑；采用SRM模式用于定量分析，測定30批市售紅花、血竭、朱砂、延胡索等樣品，結(jié)果血竭中檢出蘇丹Ⅰ、蘇丹Ⅳ，朱砂中檢出蘇丹Ⅰ、蘇丹Ⅱ、胭脂紅、堿性橙21，藏紅花中檢出胭脂紅、日落黃、橙黃G，延胡索中檢出金胺O。

鄧欣等[26]采用基于MRM的正、負(fù)離子切換采集模式檢測30種人工色素及其中的3對同分異構(gòu)體，實現(xiàn)了理想的分離和定性定量分析。

徐昱婷等[27]采用UPLC-電噴霧電離（ESI）-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式，建立了在4 min內(nèi)快速篩選并確證中藥材（飲片）中非法添加的6種水溶性紅色素（日落黃、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、新品紅、酸性紅73）的通用方法。

此外，藥用輔料的非法染色也有報道。趙海云等[28]建立了藥用明膠空心膠囊樣品中22種合成色素的超高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜定量分析方法，146批次樣品中，檸檬黃與亮藍(lán)檢出率均較高，有15批次樣品檢出禁用的合成色素堅牢綠。雖然明膠空心膠囊作為藥用輔料可加入著色劑，但目前尚無藥用級著色劑的品種、限量要求和相關(guān)法定檢測標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)引起重視。

2.3.2 基于一級、二級掃描模式的質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

目標(biāo)化合物的定性鑒定，基于與對照品保留時間窗口（RTW）、特征離子的精確質(zhì)量和二級碎片（MS2）離子等信息進(jìn)行比對，該方法高效、準(zhǔn)確，適用于一般中藥材的非法染色色素快速篩查定性。

胡青等[29]基于快速液相-四級桿串聯(lián)高分辨飛行時間質(zhì)譜（UHPLC-QTOF）技術(shù)，建立了中藥非法染色的50種色素高通量定性檢測方法。脂溶性色素和堿性色素為正離子采集模式，酸性色素為負(fù)離子采集模式。宜采用空白基質(zhì)加標(biāo)進(jìn)行平行對照，以避免假陰性。

茍琰等[4]對胭脂紅等38種已有或可能的染色摻假物質(zhì)分別依次進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）、QTOF分析，結(jié)合MassHunterPCDL軟件建立數(shù)據(jù)庫，建立了通過軟件自動篩選出可疑染色摻假物質(zhì)的非法染色篩查方法，快速篩查驗證了200余批紅花、西紅花、血竭等20種中藥材及飲片的摻假物質(zhì)，對于各種藥材及飲片基本實現(xiàn)通用，有效識別了補(bǔ)充檢驗方法未收載的染色摻假物質(zhì)，驗證了快速篩查方法的可行性。該質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫有開放性的特點，可不斷更新和完善，以應(yīng)對未來更加復(fù)雜的染色行為。

2.3.3 電噴霧高效離子遷移譜法及聯(lián)用技術(shù)

電噴霧高效離子遷移譜法（ESI-HPIMS）通過比較樣品與對照品遷移時間的一致性，判斷樣品中是否有色素的非法染色。李拓等[30]采用固相萃取-電噴霧高效離子遷移譜法，建立了快速檢測紅花中檸檬黃、日落黃、金橙Ⅱ、誘惑紅并進(jìn)行定量測定的方法。焦建東等[31]采用離子遷移譜技術(shù)，建立中藥材中金胺O、莧菜紅、日落黃非法染色的快速檢測方法。

3 小結(jié)

中藥非法染色色素品種在不斷變化，現(xiàn)有補(bǔ)充檢驗方法已不能完全滿足日常監(jiān)督檢驗的需求。中藥非法染色問題日益突出，主要體現(xiàn)在以下3個方向：1）染色中藥品種的多樣性。中藥材、中藥飲片及由其投料生產(chǎn)的中成藥都可能成為非法染色的對象。2）染色劑種類的多樣性。市面上中藥非法染色劑的種類繁多、成分復(fù)雜，主要為黃色系、紅色系、黑色系等人工合成色素，尤以黃色系、紅色系染色劑最常見。3）非法染色手段的復(fù)雜性。新的染色劑種類和手段層出不窮，繼國家相關(guān)檢驗標(biāo)準(zhǔn)公布后，中藥非法染色出現(xiàn)了新的變化，出現(xiàn)規(guī)避標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定色素品種、多種色素配色染色等趨勢，給市場監(jiān)管及日常監(jiān)督檢驗帶來了極大挑戰(zhàn)。

為了應(yīng)對復(fù)雜的中藥非法染色檢測需求，建立普適性、高通量、靈敏、準(zhǔn)確的中藥非法染色檢測方法非常必要。由于色素極性、酸堿性的不同，難以在一個體系完成分離分析。有專家建議結(jié)合近年來染色研究實際經(jīng)驗和大數(shù)據(jù)，整合、優(yōu)化資源，建立染色色素數(shù)據(jù)庫，同時按可能添加色素的色系進(jìn)行分組，建立以TLC法、HPLC法和液質(zhì)聯(lián)用法相結(jié)合的通用檢測方法[2]。既可提高檢測效率，又可避免重復(fù)研究造成的資源浪費；同時該數(shù)據(jù)庫可不斷更新完善，及時添加新發(fā)現(xiàn)的色素，能更好地應(yīng)對復(fù)雜的非法染色手段，為有效打擊染色摻偽行為，加強(qiáng)服務(wù)監(jiān)管和保障民生用藥安全提供技術(shù)支持。