張 平，石春紅，胡亞英，任麗君，顧芙蓉

（1.上海市松江食品藥品檢驗所，上海 201600；2.上海余天成中藥飲片有限公司，上海 201600；3.上海市松江區(qū)市場監(jiān)督管理局，上海 201600）

中藥飲片是指藥材經(jīng)炮制后可直接用于臨床或制劑生產(chǎn)使用的處方藥品[1]，大多來源于天然植物、動物或礦物，自身帶有大量微生物[2]，其質(zhì)量備受關注。2015年版《中國藥典（一部）》增訂農(nóng)藥殘留、重金屬、黃曲霉等危害性大的理化項目[3]，除了直接入口的中藥提取物、中藥研粉口服用貴細飲片、直接口服及泡服飲片規(guī)定了微生物檢查項目外，作為臨床應用最廣的煎煮類飲片卻未規(guī)定微生物限度標準，也無針對性的檢查方法[4]。因中藥飲片來源的多樣性，以及加工、運輸和貯存的隨意性，使中藥飲片極易受到微生物污染，并影響飲片和其下游中成藥產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性[5-8]?！睹绹幍洌?2版）》（USP 42）[9]、《歐洲藥典（10.0 版）》（EP10.0）[10]和《日本藥典（17 版）》（JP17）[11]均明確收載了使用前經(jīng)沸水處理的中草藥（天然藥物）的微生物限度檢查法和限度標準。2018年2月，國家藥典委員會網(wǎng)站發(fā)布了《關于對＜中國藥典＞2020年版微生物通則草案（一）公開征求意見的通知》[12]（以下簡稱《草案》），并對中藥飲片增加微生物檢驗進行說明[13]。但《＜中國藥典＞2020年版四部通則（草案）》[14]只收載了中藥飲片微生物限度檢查法。2019年8月，國家藥典委員會發(fā)布第二次征求意見的通知，對煎煮類中藥飲片暫不進行微生物限度控制，但應關注風險大的煎煮類中藥飲片。本研究中通過分析50種中藥煎煮類飲片的微生物檢查方法，建立了需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、耐熱菌數(shù)、耐膽鹽革蘭陰性菌[衡釋培養(yǎng)測試（MPN）法]、大腸埃希菌和沙門菌的檢驗方法，并分析微生物污染情況，初步掌握了微生物污染的負載水平，以期為中藥飲片微生物污染水平積累數(shù)據(jù)和限度標準的制訂提供技術支持，為中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)的規(guī)范管理和炮制過程中微生物的控制提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；KS12型生物安全柜（美國Thermo Fisher公司）；BA410E 型顯微鏡（香港 Motic公司）；BD400（E2）型微生物培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；MLS-3781L-PC型高壓蒸汽滅菌鍋（日本Panasonic公司）。

1.2 試藥

中藥飲片均購自上海某中藥飲片有限公司，來源于不同產(chǎn)地，類別涉及植物藥、動物藥和礦物藥，藥用部位涉及根類、莖類、全草類等，共收集50個品種，每個品種3批，共計150批次，詳見表1。每批次樣品量不少于200g，一半用于輻射滅菌后方法適用性試驗，一半用于微生物樣品檢測。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（含氯霉素）、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，均為干粉培養(yǎng)基，購自北京三藥科技開發(fā)公司，按2015年版《中國藥典（四部）》通則[4]要求配制、滅菌，并經(jīng)培養(yǎng)基適用性驗證合格。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色 念 珠 菌 [CMCC（F）98001]、黑 曲 霉 菌 [CMCC（F）98003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]，均為定量質(zhì)控菌，購自浙江泰林生物技術股份有限公司，經(jīng)菌種確認驗收合格。

表1 50種煎煮類中藥飲片信息Tab.1 Information of 50 varieties of Chinese medicine decoction pieces

2 方法與結(jié)果

2.1 計數(shù)方法適用性試驗

計數(shù)方法：根據(jù)《草案》的方法，取供試品25 g，置適量胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，制成1∶10（g/mL）備用液，充分振搖蕩洗（不少于15 min），取其液體作為供試液；用同一稀釋液將供試液10倍系列稀釋。檢查需氧菌總數(shù)計數(shù)（TAMC），將供試液連續(xù)4次10倍梯度稀釋；檢查霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)（TYMC），將供試液連續(xù)3次10倍梯度稀釋；檢查耐熱菌數(shù)，取供試液10 mL，100℃水浴30 min后迅速冷卻，連續(xù)2次10倍梯度稀釋，按TAMC檢查方法測定。

適用性試驗：按2015年版《中國藥典（四部）》通則1105微生物計數(shù)法適用性試驗方法進行驗證。取5種試驗菌（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌），以平皿傾注法、增加稀釋液或培養(yǎng)基體積法、薄膜過濾法依次檢測。按公式[回收率比值=（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/菌液對照組菌落數(shù)]計算回收率。結(jié)果試驗組和相應菌液對照組的菌落數(shù)比值均應在0.5～2.0范圍內(nèi)，可用于需氧菌、霉菌和酵母菌的總數(shù)計數(shù)。

試驗結(jié)果：根據(jù)回收率試驗結(jié)果，調(diào)整檢驗方法。其中，黃連具有抑菌性，采用1∶10的供試品溶液、薄膜過濾法（沖洗量100 mL/膜）測定TAMC，采用1∶100的供試品溶液、平皿傾注法測定TYMC；磁石具有抑菌性，采用1∶100的供試品溶液、平皿傾注法測定TAMC和TYMC；丹參和山楂可抑制需氧菌，采用1∶100的供試品溶液、平皿傾注法測定 TAMC，采用1∶10的供試品溶液、平皿傾注法測定TYMC；其余46個品種均采用1∶10的供試品溶液、平皿傾注法測定TAMC和TYMC。150批次中藥飲片的方法適用性試驗回收率比值均應在0.5～2.0范圍內(nèi)。耐熱菌數(shù)測定參考TAMC計數(shù)方法。

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗

檢查方法：耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌檢查方法采用2015年版《中國藥典（四部）》通則1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法。

適用性試驗：確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時，以大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌；確認沙門菌和大腸埃希菌檢查方法時，分別以沙門菌和大腸埃希菌為試驗菌，以常規(guī)法、增加培養(yǎng)基體積法和薄膜過濾法依次檢測。在規(guī)定的溫度和最短時間下培養(yǎng)，應能檢出所加試驗菌相應的反應特征。

試驗結(jié)果：耐膽鹽革蘭陰性菌檢查，黃連采用1∶10的供試品溶液，取相當于0.1，0.01，0.001 g的供試品預培養(yǎng)物接種至20 mL腸道增菌液中，其余品種均使用10 mL腸道增菌液；沙門菌檢查，馬齒莧、牡丹皮采用200 mL TSB作為增菌液，山楂采用500 mL TSB作為增菌液，其余品種均使用100mLTSB作為增菌液；大腸埃希菌檢查，均采用100mLTSB作為增菌液。按以上方法控制菌的試驗組均應能檢出所加試驗菌相應的反應特征。

2.3 微生物限度檢查結(jié)果

2.3.1 菌落計數(shù)結(jié)果

中藥飲片是非無菌產(chǎn)品，在炮制加工過程中微生物控制措施不嚴格，菌落計數(shù)檢出的概率很高。本試驗中的150批次中藥材飲片中，TAMC檢出率為98.67%，計數(shù)范圍為10～107cfu/g；TYMC檢出率為86.67%，計數(shù)范圍為 10～105cfu/g；耐熱菌計數(shù)檢出率為50.67%，計數(shù)范圍為10～104cfu/g。菌落總數(shù)計數(shù)分布圖見圖1。不同炮制方法對微生物的污染情況也不同，切制的檢出菌落最高，煮制和炒制最少；從藥材類別來看，礦物藥的微生物污染情況最少，植物藥和動物藥次之。菌落總數(shù)分布圖見圖2。

2.3.2 控制菌檢查結(jié)果

A.需氧菌[N 為 lg（cfu/g）]B.霉菌、酵母菌[N 為 lg（cfu/g）]C.耐熱菌[N 為 lg（cfu/g）]D.耐膽鹽革蘭陰性菌[N為lg（MPN/g）]圖1 菌落總數(shù)計數(shù)分布圖A.Aerobic bacteria[N is lg（cfu/g）]B.Mold and yeast[N is lg（cfu/g）]C.Heat-resistant bacteria[N is lg（cfu/g）]D.Bile-tolerant Gram-negative bacteria[N is lg（MPN/g）]Fig.1 Distribution of total bacterial count

A.按炮制方法分類 B.按藥材類別分類圖2 不同炮制方法和藥材類別菌落總數(shù)分布圖A.Classification by processing method B.Classification by varieties of Chinese medicine decoction piecesFig.2 Distribution of total bacterial count of Chinese medicine decoction pieces with different processing methods and varieties

檢測耐膽鹽革蘭陰性菌采用衡釋培養(yǎng)測試（MPN），樣本檢出率為50.67%，大于104MPN/g的樣本率為19.33%，菌落總數(shù)計數(shù)分布圖見圖1 D。與文獻[15-16]報道耐膽鹽革蘭陰性菌的檢出率基本一致，其中全草植物類污染最嚴重，礦物類最不利于耐膽鹽革蘭陰性菌污染。未檢出沙門菌和大腸埃希菌。

2.4 微生物限度標準判定

將150批次中藥飲片微生物的檢驗結(jié)果分別與USP42，EP10.0，JP17中與煎煮類中藥飲片使用方法相同的微生物限度標準（詳見表2）進行比較。按USP42標準評價本試驗中藥煎煮類飲片樣品的不合格率為6.0%，按EP10.0和JP17標準評價均為合格。其中，USP42中耐膽鹽革蘭陰性菌限量的檢測方法與《中國藥典》不同，故未按USP42作評價。

表2 美國、歐洲和日本藥典中草藥（天然藥物）相關微生物限度標準比較Tab.2 Comparison of the related microbial limit standards of Chinese herbal medicine（natural medicine）in USP，EP and JP

3 討論

3.1 輻射滅菌法選擇

因中藥飲片本身微生物負載高，如果樣本不去除本底菌則無法進行方法適用性試驗。比較本實驗室的紫外燈殺菌與上海輻照中心提供的輻射滅菌法，后者滅菌效果更佳[17-19]，能完全殺滅樣本負載的表面微生物，且對有效成分無明顯影響[1]。在輻射過程中，γ射線穿透力強，作用于微生物，直接或間接破壞微生物的核糖核酸、蛋白質(zhì)和酶，從而殺死微生物，起到消毒滅菌作用。與上海輻照中心聯(lián)合試驗，以黃芪和白術（需氧菌負載106cfu/g，霉菌和酵母菌負載 104cfu/g）為試樣，用60Co-γ射線輻射，吸收劑量為10～30 kGy。在15 kGy吸收劑量時能殺滅黃芪和白術負載的所有表面微生物（＜10 cfu/g），為了確保所有樣本能達到無菌狀態(tài)，選擇25 kGy吸收劑量，與2015年版《中國藥典（四部）》通則1421滅菌法中輻射滅菌法一致。因此，確定輻射方案為60Co-γ射線，吸收劑量為25 kGy。

3.2 微生物對炮制方法和藥材類別的選擇特異性

根據(jù)《上海市中藥飲片炮制規(guī)范2018年版》附錄炮制通則[20]，有39種中藥飲片炮制方法。中藥炮制是遵循中醫(yī)藥理論，根據(jù)藥材性質(zhì)，按藥材炮制操作工序，制成一定規(guī)格的飲片。不同的炮制方法對微生物的負載情況也不同，經(jīng)過熱加工處理的炮制方法如煮制、炒制、蒸制能有效降低中藥飲片的細菌類污染，但藥材炮制過程和輔料的引入會使飲片微生物負載更復雜[1]。根據(jù)統(tǒng)計學 t檢驗分析，非熱加工方式切制凈制飲片的微生物負載最高，熱加工方式的煮制、炒制、蒸制飲片次之，熱加工與非熱加工的炮制方式對TAMC與TYMC有顯著差異（P ＜0.05），對耐熱菌無顯著差異（P ＞0.05）。從藥材類別來看，植物藥和動物藥的微生物負載最多，礦物藥次之，植物藥和動物藥的微生物負載分布情況無顯著差異（P＞0.05），動物藥和礦物藥的微生物負載分布情況有顯著差異（P＜0.05）。礦物藥的微生物負載比植物藥和動物藥低，這和微生物在生長過程中受藥材成分的影響有關，不同種類的微生物對藥材種類有選擇特異性[15]。

3.3 耐熱菌檢查項目選定是中藥質(zhì)量安全的關鍵風險控制指標

針對煎煮類中藥飲片的使用特點，建立耐熱菌計數(shù)檢查項目，擬用于評估煎煮類飲片在加熱處理后殘留微生物的情況。耐熱菌測定時加熱溫度和沸水浴時間對檢測數(shù)據(jù)影響大，若加熱溫度不到100℃，耐熱菌的檢出率會呈數(shù)量級增加。因此，必須保持檢測條件一致，用溫度計隨時監(jiān)測沸水浴溫度在100℃，并用秒表控制30 min。根據(jù)檢測結(jié)果，即使經(jīng)過100℃沸水浴30 min，耐熱菌計數(shù)最高可達104cfu/g。

3.4 50種中藥飲片微生物污染情況分析

本試驗中通過購買50種中藥煎煮類飲片考察流通領域樣品的微生物污染情況，與某生產(chǎn)企業(yè)提供的150批次樣品的微生物負載分布情況基本一致（P＞0.05），說明中藥飲片在流通環(huán)節(jié)能保證微生物污染情況與出廠時一致。150批次樣品檢出需氧菌總數(shù)計數(shù)結(jié)果介于10～107cfu/g；霉菌、酵母菌總數(shù)計數(shù)結(jié)果介于10～105cfu/g；耐熱菌數(shù)檢出率為49.5%，計數(shù)結(jié)果介于10～104cfu/g；耐膽鹽革蘭陰性菌檢出率為48.5%；均未檢出大腸埃希菌和沙門菌。以USP42的規(guī)定進行評價，不合格率為6.0%；以EP10.0，JP17的規(guī)定進行評價，全部合格。美國對使用前用沸水處理的植物產(chǎn)品工藝的要求不同，故USP42制訂的標準限度比EP10.0和JP17低了一個數(shù)量級，不作為主要評價依據(jù)。雖然本試驗研究結(jié)果顯示微生物負載水平較高，但檢測數(shù)據(jù)結(jié)果基本滿足國外藥典規(guī)定限度要求。從生產(chǎn)質(zhì)量管理體系上看，我國中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)的整體質(zhì)量管理水平較低，過程控制和風險控制體系目前無法達到國際水平，這也是我國藥典無法推進中藥飲片微生物限度標準規(guī)定的實際原因[2]。

3.5 努力方向

我國中藥飲片品種繁多，《上海市中藥飲片炮制規(guī)范2018年版》收載973種，2015年版《中國藥典（一部）》收載中藥材662種，且微生物污染菌情況復雜。本研究中以中藥飲片的表面微生物為檢查重點，但部分具有抑菌性的品種需采用消除抑菌性的方法才能完成方法適用性驗證。我國中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)大部分缺乏微生物檢驗能力，如果方法驗證工作投放到國家專業(yè)技術機構，會因樣本工作量大而影響標準的推行。因此，建議國家專業(yè)技術機構聯(lián)合中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)進一步開展中藥飲片，特別是煎煮類中藥飲片微生物污染數(shù)據(jù)的積累和微生物危害的風險評估工作，根據(jù)中藥飲片的品種特點制訂相應的個性化標準，這是中藥標準引領國際發(fā)展的關鍵[21]。中藥飲片微生物相關標準的制訂勢在必行，須進一步強化中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)的過程管理控制和微生物檢驗能力的儲備，保障中藥飲片的使用安全。