晏雪梅，楊居崩，聶發(fā)龍，廖 陳，李秀芳

（云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染（URTI）為常見呼吸系統(tǒng)疾病，包括流行性感冒（簡(jiǎn)稱流感）、普通感冒、病毒性咽炎等，URTI向下呼吸道遷延而出現(xiàn)的多種并發(fā)癥是導(dǎo)致URTI患者致殘或致死的重要原因。2018年，KWONG等[1]指出，急性心肌梗死與急性URTI尤其是流感之間關(guān)系密切，患者在確認(rèn)感染流感后的前7 d，急性心肌梗死發(fā)作的概率可增加6倍。一項(xiàng)針對(duì)感染甲型流感（H7N9）幸存病例出院后2年的隨訪調(diào)查顯示，50%的幸存者在感染治愈后的1年內(nèi)仍存在嚴(yán)重的通氣功能障礙[2]。由于80%以上的URTI由病毒感染引起，故接種疫苗和使用抗病毒藥物是臨床對(duì)因治療最有效的手段。目前，臨床常用的URTI抗病毒藥物包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑、脫氧核糖核酸（RNA）聚合酶抑制劑和M2蛋白離子通道抑制劑。神經(jīng)氨酸酶抑制劑由于耐藥率相對(duì)較低，作用特異性較強(qiáng)，可阻礙病毒顆粒的釋放，高效抗病毒。奧司他韋是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合流感病毒表面的神經(jīng)氨酸酶活性，干擾病毒從宿主細(xì)胞釋放，阻礙病毒擴(kuò)散，對(duì)甲型和乙型流感病毒具有較好的抑制作用。UYEKI[3]研究發(fā)現(xiàn)，奧司他韋可降低疾病的嚴(yán)重程度和死亡率。H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等均可由呼吸道進(jìn)入機(jī)體，引發(fā)疾病，覆蓋于呼吸道的黏膜系統(tǒng)成為機(jī)體防御病毒、細(xì)菌等病原微生物經(jīng)口鼻入侵的第一道防線。研究證實(shí)，呼吸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)破壞或功能低下與URTI密切相關(guān)[4]，提高呼吸道黏膜屏障的防御能力是防治URTI的重要途徑。本研究中探討了奧司他韋對(duì)寒冷刺激所致小鼠鼻黏膜免疫屏障功能低下（MNMBD）的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥、儀器與動(dòng)物

試藥：磷酸奧司他韋顆粒（宜昌東陽光長(zhǎng)江藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為0581903053）；Mouse IgA Antibody（美國(guó) Novus Biologicals公司，批號(hào)為 A30）；β -Actin Polyclonal antibody（批號(hào)為 00078629），GAPDH Rabbit Polyclonal antibody（批號(hào)為00044915），均購(gòu)自美國(guó) Proteintech 公司；干擾素λ受體 1（IFNLR1）Antibody（英國(guó)biorbyt公司，批號(hào)為 CB17514）；白細(xì)胞介素10Rβ（IL-10Rβ）Antibody（美國(guó) Santa Cruz公司，批號(hào)為 D1015）；干擾素調(diào)節(jié)因子 9（IRF9）Antibody（美國(guó) Cell Signaling 公司，批 號(hào) 為 288455）；Anti-IL-28A Antibody（批號(hào)為GR24656-5），Anti-黏病毒抗性蛋白 1（Mx-1）Antibody（批號(hào)為GR3190794-16），均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

儀器：Infinite M200 PRO型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；XS125A型分析天平（瑞士普利賽斯公司，精度為十萬分之一）；HITACHI CF16RXⅡ型臺(tái)式低速離心機(jī)（日本Hitachi Koki公司）；PowerPac U 型電泳儀、Mini-Proto型濕轉(zhuǎn)儀，均購(gòu)自美國(guó)伯樂公司；Bio Spectrum型UVP凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Spectrum公司）。

動(dòng)物：SPF級(jí)昆明種小鼠38只，雄性，體質(zhì)量18～20 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK（川）2015-030，合格證號(hào)為 51203500009727。飼養(yǎng)條件為光照12 h、黑暗12 h，溫度18～22℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.2 方法

復(fù)制寒冷刺激致小鼠MNMBD模型[5-6]。

將小鼠隨機(jī)分為正常組（12只）、模型組（12只）、奧司他韋組（14只）。正常組和模型組灌胃蒸餾水，奧司他韋組小鼠提前灌胃奧司他韋，臨用時(shí)按臨床成人等效量的2倍量（40 mg/kg）進(jìn)行配制，每10 g體質(zhì)量0.2 mL灌胃給藥，1次/日，連續(xù)給藥3次。正常組不予任何刺激；模型組和奧司他韋組小鼠均于末次給藥30 min后置-20℃環(huán)境中1 h，再置25℃環(huán)境中30 min，循環(huán)刺激2次，造模后正常給予水和食物。于造模結(jié)束后24 h，過量麻醉，處死小鼠，摘取鼻黏膜，使用免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)鼻黏膜組織中免疫球蛋白 A（IgA）、干擾素 λ（IFN-λ）、IFNLR1、IL-10Rβ、IRF9 和Mx-1蛋白表達(dá)水平。

模型組小鼠鼻黏膜組織中，IgA和IFN-λ蛋白表達(dá)水平與正常組相比，明顯下降，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則判斷為造模成功。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)IgA蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中IgA蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，奧司他韋組小鼠鼻黏膜中IgA蛋白表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.01）。詳見圖 1 A。

2.2 對(duì)IFN-λ蛋白表達(dá)的影響[7]

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中IFN-λ蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，奧司他韋組小鼠鼻黏膜組織中IFN-λ蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。詳見圖1 B。

2.3 對(duì)IFNLR1和IL-10Rβ蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中IFNLR1和IL-10Rβ蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，奧司他韋組小鼠鼻黏膜組織中IFNLR1蛋白表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），IL-10Rβ蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組（P＜0.01）。詳見圖1 C和圖1 D。

2.4 對(duì)IRF9蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中IRF9蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，奧司他韋組小鼠鼻黏膜組織中IRF9蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖1 E。

2.5 對(duì)Mx-1蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中Mx-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，奧司他韋組小鼠鼻黏膜組織中Mx-1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。詳見圖1 F。

3 討論

上呼吸道與外界直接相通，覆蓋于除鼻前庭外鼻腔結(jié)構(gòu)的鼻黏膜，始終暴露于病原菌、共生菌和環(huán)境化學(xué)物質(zhì)等各種物質(zhì)中，由鼻黏膜激發(fā)的免疫效應(yīng)對(duì)于防御病原體經(jīng)鼻進(jìn)入機(jī)體至關(guān)重要。研究表明，鼻黏膜屏障結(jié)構(gòu)遭到破壞或功能低下可為病原微生物的入侵和定植創(chuàng)造條件，是上呼吸道感染發(fā)生的重要原因之一[8-9]。分泌型免疫球蛋白A（sIgA）是黏膜免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，在機(jī)體第一線屏障中起重要作用，可防止病原體進(jìn)入黏膜上皮，保護(hù)黏膜表面免受病原體和致病菌的侵害[10-11]。本研究結(jié)果顯示，MNMBD模型小鼠鼻黏膜組織中IgA蛋白表達(dá)明顯下降，給予奧司他韋后可顯著促進(jìn)小鼠鼻黏膜組織中的IgA蛋白表達(dá)，提示其可提高小鼠鼻黏膜免疫屏障功能。

注：與正常組比較，**P＜0.01，*P ＜0.05；與模型組比較，##P ＜0.01，#P ＜0.05。A.Ig A B.IFN-λ C.IFNLR1 D.IL-10Rβ E.IRF9 F.Mx-1圖1 奧司他韋對(duì)MNMBD模型小鼠鼻黏膜組織中免疫屏障功能的影響Note：Compared with those in the normal group，**P ＜ 0.01，*P ＜ 0.05；compared with those in the model group，##P ＜ 0.01，#P ＜ 0.05.A.IgA B.IFN-λ C.IFNLR1 D.IL-10Rβ E.IRF9 F.Mx-1Fig.1 Effect of Oseltamivir on the immune barrier function in the nasal mucosa tissues of MNMBD model mice

IFN-λ是近15年才發(fā)現(xiàn)的特異性產(chǎn)生于黏膜組織的免疫效應(yīng)分子，在抗病毒和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，具有參與維持上呼吸道黏膜免疫屏障功能的重要作用，可通過誘導(dǎo)抗病毒蛋白的表達(dá)防止病毒侵襲，維持黏膜屏障功能的完整性。有研究顯示，寒冷刺激可使IFN-β誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)下降[12]。本研究結(jié)果顯示，反復(fù)的寒冷刺激可降低小鼠鼻黏膜IFN-λ蛋白表達(dá)。IFN-λ的受體為IFNLR1和IL-10Rβ的異源二聚體，IFN-λ與其受體結(jié)合，啟動(dòng)Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK-STAT）信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是將細(xì)胞因子刺激信號(hào)經(jīng)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部的重要途徑，IFN刺激基因的激活在細(xì)胞內(nèi)建立抗病毒狀態(tài)，促使抗病毒蛋白因子如2′，5′-寡聚腺苷酸合成酶（OAS）、核糖核酸依賴性蛋白酶（PKR）和Mx-1的釋放，抑制病毒復(fù)制，發(fā)揮抗病毒作用[13]?？梢?，IFN-λ并非直接抑制或殺死病毒，而是通過啟動(dòng)相關(guān)抗病毒基因的表達(dá)，促使多種抗病毒蛋白的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗病毒作用[14-15]。Mx-1是關(guān)鍵的抗病毒效應(yīng)因子[16-19]，Mx-1蛋白是IFN-λ關(guān)鍵的抗病毒效應(yīng)蛋白[20-21]，是控制多種病毒的天然免疫系統(tǒng)的高度有效的抗病毒限制因子，可阻止病毒在細(xì)胞內(nèi)的傳播及復(fù)制。本研究結(jié)果顯示，寒冷刺激后，小鼠組織中IgA，IFN-λ，IFNLR1，IL-10Rβ，IRF9，Mx-1 蛋白表達(dá)水平均下降?？梢?，寒冷刺激造成了小鼠鼻黏膜免疫屏障下降，這或許是受涼后易發(fā)生URTI的原因之一。給予奧司他韋干預(yù)后，可明顯提高小鼠鼻黏膜 IgA，IFN-λ，IFNLR1，IL-10Rβ，IRF9，Mx-1 蛋白表達(dá)水平?？梢姡瑠W司他韋可提高寒冷刺激所致小鼠鼻黏膜免疫屏障的功能，作用機(jī)制與激活了小鼠鼻黏膜組織中IFN-λ相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。