李卓恒，盧來春

（1.重慶市醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶 401331；2.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044）

糖尿?。―M）是以高血糖為特征的代謝性疾病，全球發(fā)病率、死亡率逐年上升[1-2]。糖尿病腎?。―N）又稱糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的重要病因[3-6]。DN治療方法主要包括降糖、調(diào)脂、抗炎及抗氧化治療等[7]。中醫(yī)能通過個(gè)體化給藥辨證施治，效果顯著[8]，從中藥中尋找治療DN的藥物是近幾年的研究熱點(diǎn)。牛蒡子是菊科植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果實(shí)，具有疏散風(fēng)熱、解毒消腫功效，其主要活性成分牛蒡子苷是其中含量最高的木脂素成分[9]。現(xiàn)代研究表明，牛蒡子及其提取物對(duì)慢性腎病、糖尿病、高血脂有顯著改善作用[10-12]。本研究中探討了牛蒡子苷對(duì)DN模型小鼠的改善作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：BC-2800Vet型全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；XSZ-HS7型生物顯微鏡（重慶重光實(shí)業(yè)有限公司）；EL204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為0.000 1 g）；5417R型臺(tái)式低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；紫外分光光度儀（上海欣茂有限責(zé)任公司）；GB型羅氏血糖儀（德國(guó)羅氏公司）。

試藥：鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為572201）；牛蒡子苷（實(shí)驗(yàn)室自制，純度 ＞ 99.8% ）；超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號(hào)為 YX-051633M），丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號(hào)為YX-130401M），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號(hào)為YX-071908M），總抗氧化能力（T-AOC）酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號(hào)為YX-200118M），脂質(zhì)過氧化物（LPO）酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號(hào)為 YX-121615M），均購(gòu)自上海優(yōu)選生物科技有限公司。

動(dòng)物：健康雄性 C57BL/6J小鼠 90只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)特色醫(yī)療中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（渝）2012-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證為No.11401300072698。飼養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)特色醫(yī)療中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（渝）2012-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用均符合中國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。動(dòng)物房溫度18～22℃，相對(duì)濕度50% ～60%，明暗（12 h/12 h）交替，用小鼠全價(jià)飼料喂養(yǎng)。

1.2 方法

溶液制備：稱取 1 g STZ，加入 10 mL 0.1 mol/L pH4.2的枸櫞酸緩沖液中，即得1%STZ溶液。稱取適量牛蒡子苷，加入0.25%羧甲基纖維素鈉中，分別配成質(zhì)量濃度為8，16，32mg/mL的溶液，即得牛蒡子苷溶液。

動(dòng)物造模及模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)：小鼠連續(xù)給予高脂、高糖飼料14 d后，禁食不禁飲12 h，腹腔注射質(zhì)量濃度為70 mg/mL的STZ溶液。注射72 h后，于小鼠尾部采血，檢測(cè)空腹血糖，連續(xù)3 d血糖≥8 mmol/mL為造模成功[13]；與正常小鼠比較，造模后小鼠血清中肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）升高，即為腎病模型成功。同時(shí)滿足上述2個(gè)判斷標(biāo)準(zhǔn)，即為DN造模成功。

動(dòng)物分組及給藥：取10只2月齡C57BL/6J型雄性小鼠作為對(duì)照組（A組）。將造模成功的小鼠分為模型組（B 組），卡托普利組（C 組，劑量為25 mg/kg），牛蒡子苷低、中、高劑量組（D1組、D2組、D3組，劑量分別為 80，160，320 mg/kg），每組 10 只，C 組、D1組、D2組、D3組每天灌胃相應(yīng)藥物，劑量為1 mL/kg，A組、B組給予等體積生理鹽水，持續(xù)56 d，第57天處死小鼠。

1.3 觀察指標(biāo)

生化指標(biāo)：小鼠處死前禁食不禁飲12 h，心臟取血，超量1.5%水合氯醛腹腔注射處死小鼠，全血不抗凝，靜置 30 min，離心（3 000 r/min）15 min，取上層血清，-80℃保存，待測(cè)。全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)小鼠Cr和BUN水平，并計(jì)算24 h尿蛋白/Cr比值；以酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠腎臟勻漿中SOD，MDA，T-AOC，LPO，GSH-Px的水平。

臟器系數(shù)：小鼠處死前稱體質(zhì)量，處死后取左側(cè)腎臟，并稱定質(zhì)量。腎臟系數(shù)=左側(cè)腎臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

日平均飲水量及日平均尿量：給藥第55天，將各組小鼠放入代謝籠24 h，檢測(cè)小鼠24 h內(nèi)飲水量及尿量，計(jì)算平均值。

組織病理學(xué)：處死小鼠后，取腎臟，將其固定于4%多聚甲醛24～72 h，組織梯度脫水，石蠟包埋，5 μm厚度切片，分別用蘇木精-伊紅（HE）、Masson、六胺銀染色，光鏡下觀察病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。組間比較行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的數(shù)據(jù)采用 LSD檢驗(yàn)，方差不齊的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 改善體質(zhì)量

與A組小鼠比較，B組小鼠體質(zhì)量顯著下降（P＜0.01）；與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組小鼠體質(zhì)量顯著上升（P ＜0.01）。詳見圖 1。

2.2 改善血糖、腎功能、飲水量、尿量指標(biāo)

與A組比較，B組小鼠臟器系數(shù)，平均日飲水量，平均日尿量，血糖，24 h尿蛋白 /Cr，Cr，BUN均顯著上升（P ＜0.01）；與 B 組比較，C 組、D1組、D2組、D3組小鼠上述指標(biāo)均顯著降低（P＜0.01）。詳見表1。

2.3 改善腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)

與A組比較，B組小鼠腎臟勻漿中MDA和LPO水平均顯著上升（P ＜0.01），SOD，GSH-Px，T-AOC 水平均顯著下降（P＜0.01）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組、D3組小鼠MDA和LPO水平均顯著下降（P＜0.05），SOD，GSH-Px，T-AOC 均顯著升高（P＜0.05）。詳見表2。

注：與 A組比較，**P＜0.01；與B組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。圖1 各組小鼠體質(zhì)量比較Note：Compared with those in group A，**P ＜ 0.01；compared with those in group B，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01.Fig.1 Comparison of the body mass of mice in each group

2.4 改善腎臟病理變化

HE染色顯示，A組小鼠腎小球飽滿，無壞死；B組小組腎小球萎縮，腎小管排列疏松，有空泡，周圍炎性因子浸潤(rùn)較多。Masson染色顯示，A組小鼠腎纖維化較少（藍(lán)色染色較少），B組小鼠腎纖維化嚴(yán)重。六胺銀染色顯示，A組小鼠腎小球基底膜黑色染色較少，顏色淺，不連續(xù)；B組小鼠腎小球基底膜黑色染色較多，顏色深。與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組小鼠腎小球較飽滿，空泡、炎性因子、腎纖維化、腎小球基底膜黑色染色均較少，顏色較淺。詳見圖2。

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，DN屬“消渴”之“下消”?！峨s病源流犀燭·三消源流》曰：“有消渴后身腫者，有消渴面面目足膝腫小便少者?！睘樘搶?shí)夾雜的糖尿病常見慢性并發(fā)證。消渴病日久不愈、耗氣傷陰，導(dǎo)致腎元虧虛，“陳氣”與內(nèi)熱相合，濕熱、郁熱、凌濁、疲血各種病理因素膠結(jié)，久之病變進(jìn)入腎臟絡(luò)脈之中而形成?！夺t(yī)學(xué)入門》中記載，“三消……熏蒸日久，氣滯凝滯”即致瘀[14-16]，故氣滯、氣瘀和血瘀為DN病機(jī)的重要表現(xiàn)。

牛蒡子最早記錄于《名醫(yī)別錄》，又稱為惡實(shí)、鼠粘子等。李東垣《珍珠囊補(bǔ)遺藥性賦》載“牛蒡味辛平無毒”“牛蒡子疏風(fēng)壅之痰”，又載“鼠粘子味辛、平，性微寒；無毒。降也，陽也。其用有四：主風(fēng)濕癮疹盈肌；退寒熱咽喉不利；散諸種瘡瘍之毒；利腰膝凝滯之氣”。牛蒡子為解表藥，利腰膝凝滯之氣，可解陳氣、血瘀?，F(xiàn)代研究[17-18]表明，牛蒡子苷對(duì)糖尿病動(dòng)物模型的血糖、血管等有顯著改善作用。因此，本研究中將牛蒡子苷用于DN治療。

DN早期的病理表現(xiàn)以腎小球基底膜增厚和系膜基質(zhì)增多為主，晚期則多以彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化為主。因此，本研究中除了觀察糖尿病、腎病的血液指標(biāo)外，還選擇腎臟纖維化及腎小球基底膜改變作為判斷給予牛蒡子苷后的改善指標(biāo)。結(jié)果顯示，牛蒡子苷對(duì)DN模型雄性小鼠的體質(zhì)量、日飲水量、日尿量、血糖、血生化指標(biāo)、腎臟指數(shù)、腎臟中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平、腎臟病理變化均有顯著改善作用?？梢?，牛蒡子苷劑量在80～320 mg/kg范圍內(nèi)對(duì)DN有顯著改善作用，可能是通過調(diào)節(jié)腎臟氧化應(yīng)激而起效。本研究結(jié)果為將牛蒡子苷開發(fā)為治療DN的藥物提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

表1 各組小鼠臟器系數(shù)、飲水量、尿量、血糖、腎功能比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of organ coefficient，water intake，urine output，blood glucose and renal function of mice in each group（±s，n=10）

表1 各組小鼠臟器系數(shù)、飲水量、尿量、血糖、腎功能比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of organ coefficient，water intake，urine output，blood glucose and renal function of mice in each group（±s，n=10）

注：與 A 組比較，**P ＜0.01；與 B 組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。下表同。Note：Compared with those in group A，**P ＜ 0.01；compared with those in group B，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；as well as the following tables.

組別A組B組C組D1組D2組D3組腎臟系數(shù)（g/g×1 000）8.65±1.36 13.89±1.85**9.64±1.60##10.88±1.33##9.69±0.99##9.77±1.19##平均日飲水量（mL）5.62±1.04 8.51±1.27**7.30±1.06#7.97±1.33 7.66±0.84#7.06±1.17#平均日尿量（mL）2.24±0.59 4.9±1.14**3.72±0.75##4.80±0.76 4.26±0.50#4.04±0.69#血糖（mmol/L）5.37±0.53 12.7±1.98**9.03±1.50#11.01±1.48##9.80±1.41##9.44±1.03##24 h尿蛋白/Cr 21.81±5.03 128.50±24.95**67.07±8.22##92.11±10.61##82.07±6.97##88.67±11.98##Cr（μmol/L）38.3±5.88 68.1±8.55**49.8±5.69##54.8±6.43##52.7±4.36##52.4±6.70#BUN（mmol/L）12.18±2.24 19.02±1.98**15.56±1.02##16.56±1.02##15.96±1.09##16.8±1.03##

表2 各組小鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of oxidative stress indexes of kidney in each group（±s，n=10）

表2 各組小鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of oxidative stress indexes of kidney in each group（±s，n=10）

組別A組B組C組D1組D2組D3組MDA（nmol/L）3.52±0.99 9.14±1.89**4.64±1.24##6.19±1.30##5.55±1.11##5.42±1.10##SOD（U/mg）462.49±33.03 197.53±42.07**421.71±50.52##296.38±58.67##381.80±39.68##358.72±42.79##T-AOC（nmol/L）59.08±5.75 35.53±4.72**46.59±7.25#42.33±4.87#45.96±4.82#45.70±6.52#LPO（nmol/L）43.03±11.43 123.01±14.59**57.02±13.50##77.93±11.73##71.23±11.39##71.56±10.33##GSH-Px（U/kg）864.16±87.80 323.50±65.89**568.18±45.16##437.70±48.68##505.19±44.62##530.07±51.83##

圖2 各組小鼠腎臟病理切片圖a.group A b.group B c.group C d.group D1 e.group D2 f.group D3A.Changes of glomerular in mice（HE staining，×200） B.Changes of renal fibrosis in mice（Masson staining，× 200）C.Pathological changes of renal basement membrane in mice（Hexamine silver staining，× 200）Fig.2 Pathological sections of the kidney of mice in each group