王鋼樂，董 懿，劉 恒

乳腺癌目前仍然是威脅全世界女性健康的主要惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和病死率，并呈現(xiàn)年輕化趨勢[1]。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer， TNBC)是指免疫組織化學(xué)染色顯示雌激素受體、孕激素受體和原癌基因Her-2均為陰性的一種特殊類型乳腺癌，約占乳腺癌總體的10.0%～20.8%，具有特殊的生物學(xué)行為和臨床病理特征，預(yù)后往往較差[2-3]。腫瘤的發(fā)生與惡性增殖、凋亡抑制、免疫逃逸、促血管新生、炎性反應(yīng)等密切相關(guān)[4]。程序性死亡分子-1(PD-1)/程序性死亡配體-1(PDL-1)被證實參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，鐘亞春等[5]研究指出，PD-1/PDL-1在乳腺癌組織中高表達(dá)，抑制T淋巴細(xì)胞的殺傷作用，并且與腫瘤TNM分期和直徑大小密切相關(guān)。呂淑貞等[6]則證實了乳腺癌組織PD-1/PDL-1高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。目前，關(guān)于TNBC和PD-1/PDL-1表達(dá)相關(guān)性方面的研究較少。因此，本研究主要探討TNBC患者腫瘤組織PD-1/PDL-1表達(dá)與腫瘤臨床特征和T淋巴細(xì)胞免疫功能的相關(guān)性，為明確TNBC的發(fā)生機(jī)制及臨床干預(yù)提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2018年6月—2020年2月我院經(jīng)病理確診的TNBC患者76例作為TNBC組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～75歲；②接受手術(shù)切除腫瘤組織，且病理確診為TNBC；③自愿簽署本研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①復(fù)發(fā)性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌；②其他部位原發(fā)惡性腫瘤；③伴全身感染、自身免疫性疾??；④腫瘤標(biāo)本不合格或被污染。另選取同時間段來我院就診的非TNBC患者124例作為非TNBC組，乳腺良性腫瘤患者50例作為良性組。

TNBC組年齡45～69(53.4±6.9)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)20.8～24.6(22.5±1.3)kg/m2；單側(cè)腫瘤66例(左側(cè)32例、右側(cè)34例)，雙側(cè)10例；腫瘤直徑0.6～5.8(3.5±1.2)cm；導(dǎo)管癌32例，小葉癌44例；絕經(jīng)45例，未絕經(jīng)31例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期30例，Ⅲ期22例，Ⅳ期9例；低分化30例，中分化21例，高分化25例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。非TNBC組年齡43～72(54.5±7.2)歲；BMI 20.9～26.2(22.9±1.5)kg/m2；腫瘤直徑0.5～5.6(3.6±1.3)cm；單側(cè)90例(左側(cè)43例、右側(cè)47例)，雙側(cè)34例；導(dǎo)管癌53例，小葉癌71例；絕經(jīng)69例，未絕經(jīng)55例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期40例，Ⅲ期34例，Ⅳ期25例；低分化57例，中分化42例，高分化25例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例。良性組年齡42～74(54.1±7.0)歲；BMI 21.2～26.1(22.6±1.4)kg/m2；腫瘤直徑0.7～5.9(3.4±1.1)cm；單側(cè)42例(左側(cè)20例、右側(cè)22例)，雙側(cè)8例；導(dǎo)管癌33例，小葉癌17例；絕經(jīng)29例，未絕經(jīng)21例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期21例，Ⅲ期14例，Ⅳ期5例；低分化16例，中分化24例，高分化10例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例。3組年齡、BMI和腫瘤直徑等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施。

1.2研究方法 分別采用免疫組織化學(xué)染色法和Western blot法檢測各組腫瘤組織中PD-1和PDL-1表達(dá)情況，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組腫瘤組織T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)百分比。采用Pearson相關(guān)分析探討3組PD-1和PDL-1定量表達(dá)與CD4+、CD8+和Treg百分比的相關(guān)性。采用單因素分析探討TNBC組PD-1和PDL-1表達(dá)與腫瘤臨床特征的關(guān)系。

1.2.1免疫組織化學(xué)染色：將各組手術(shù)切除的新鮮腫瘤標(biāo)本，制成厚度約4 μm的20～30個組織切片。根據(jù)免疫組織化學(xué)染色檢測試劑盒和蛋白定量檢測試劑盒(美國Sigma公司生產(chǎn))操作步驟完成相應(yīng)的檢測過程。免疫組織化學(xué)染色過程中需要的兔抗人PD-1和PDL-1單克隆抗體一抗以及對應(yīng)大鼠抗兔抗體二抗均購自美國R&D公司，以IgG抗體作為陰性對照。結(jié)果以200倍顯微鏡下計數(shù)視野中陽性細(xì)胞百分比，以黃染細(xì)胞為陽性細(xì)胞。每例隨機(jī)挑選3個組織切片，取平均值為最終結(jié)果。

1.2.2Western blot：各組手術(shù)切除腫瘤組織剪碎勻漿，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，測定濃度和純度后應(yīng)用內(nèi)參β-actin抗體進(jìn)行劑量標(biāo)準(zhǔn)化檢測。吸取30 μg樣本蛋白和等量內(nèi)參蛋白，經(jīng)冰浴變性、8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后將分離區(qū)帶電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，先后滴加羊抗人PD-1、PDL-1和β-actin抗體一抗(稀釋濃度為1︰2000，美國CA公司生產(chǎn))靜置過夜，磷酸緩沖鹽溶液洗滌后滴加兔抗羊二抗(稀釋濃度為1︰500，美國CA公司生產(chǎn))室溫孵育4 h，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，ECL顯色。結(jié)果掃描保存，采用Lab Works4.5凝膠成像軟件(美國Invitrogen 公司生產(chǎn))行半定量分析，結(jié)果以樣品蛋白與內(nèi)參蛋白電泳條帶的灰度值比值表示。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)：各組手術(shù)切除腫瘤組織剪碎勻漿，加入磷酸緩沖鹽溶液調(diào)整濃度為2×106/ml，采用FACS Caliber型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，根據(jù)預(yù)設(shè)淋巴細(xì)胞亞群種類進(jìn)行染色，保證預(yù)觀察的淋巴細(xì)胞亞群損失降至最低，同時圖像清晰度滿意。

2 結(jié)果

2.1組間PD-1和PDL-1陽性表達(dá)情況比較 TNBC組PD-1和PDL-1陽性表達(dá)率明顯高于非TNBC組和良性組，且非TNBC組亦明顯高于良性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者免疫組織化學(xué)染色(200×，DAB顯色劑加蘇木精復(fù)染) TNBC為三陰性乳腺癌，PD-1為程序性死亡分子-1，PDL-1為程序性死亡配體-1

表1 TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者PD-1和PDL-1陽性表達(dá)比較[例(%)]

2.2組間PD-1和PDL-1定量表達(dá)比較 TNBC組PD-1和PDL-1定量表達(dá)水平明顯高于非TNBC組和良性組，且非TNBC組亦明顯高于良性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3組間T淋巴細(xì)胞亞群比較 TNBC組CD4+、CD8+和Treg百分比均明顯低于非TNBC組和良性組，且非TNBC組亦明顯低于良性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，PD-1和PDL-1定量表達(dá)與CD4+、CD8+和Treg百分比呈負(fù)相關(guān)性(P<0.01)。見圖4和表2。

圖2 Western blot法檢測TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者PD-1和PDL-1定量表達(dá) A：TNBC組，B：非TNBC組，C：乳腺良性腫瘤組；TNBC為三陰性乳腺癌，PD-1為程序性死亡分子-1，PDL-1為程序性死亡配體-1，β-actin為內(nèi)參。與非TNBC組同指標(biāo)比較，aP<0.05；與良性組同指標(biāo)比較，cP<0.05

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者T淋巴細(xì)胞亞群百分比 TNBC為三陰性乳腺癌,Treg為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；與非TNBC組同指標(biāo)比較，aP<0.05；與良性組同指標(biāo)比較，cP<0.05

2.5TNBC組PD-1和PDL-1表達(dá)與腫瘤臨床特征的關(guān)系 單因素分析顯示，TNBC組PD-1和PDL-1陽性表達(dá)率在患者年齡、BMI、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、絕經(jīng)狀態(tài)方面無顯著差異(P>0.05)，但在腫瘤TNM分期、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。見表3。

3 討論

腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死不是雜亂無章的，而是眾多基因間相互高度協(xié)調(diào)共同作用的結(jié)果[7]。PD-1/PDL-1是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和免疫逃逸的最重要途徑，PD-1屬免疫球蛋白，由268個氨基酸殘基組成；而PDL-1由CD274基因編碼，主要參與調(diào)控T淋巴細(xì)胞對腫瘤的識別、呈遞、細(xì)胞毒性和免疫殺傷作用[8-9]。

圖4 Pearson相關(guān)分析TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者PD-1和PDL-1定量表達(dá)水平與CD4+、CD8+和Treg百分比的相關(guān)性 TNBC為三陰性乳腺癌，PD-1為程序性死亡分子-1，PDL-1為程序性死亡配體-1,Treg為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

本研究發(fā)現(xiàn)，TNBC組PD-1和PDL-1陽性表達(dá)率和定量表達(dá)水平均明顯高于非TNBC組及良性組，且非TNBC組亦明顯高于良性組。提示PD-1和PDL-1高表達(dá)與TNBC的惡性程度有一定關(guān)系。PD-1通常被稱為免疫調(diào)節(jié)的“檢查點分子”，有助于維持自身的免疫耐受性[10]。PD-1在許多腫瘤浸潤的CD8+ T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、B細(xì)胞、活化單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上表達(dá)[11]。PD-1參與T細(xì)胞的調(diào)節(jié)，通過與配體(PDL-1或程序性死亡配體-2)形成復(fù)合物，傳遞抑制信號，從而抑制腫瘤增殖，發(fā)揮免疫系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)作用[12]。本研究還發(fā)現(xiàn)，TNBC組CD4+、CD8+和Treg百分比均明顯低于非TNBC組和良性組，非TNBC組亦明顯低于良性組。提示TNBC患者常伴隨T淋巴細(xì)胞免疫功能的下降，該結(jié)果與免疫耐受和免疫逃逸的發(fā)生密切相關(guān)。PDL-1在造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞中大量表達(dá)，主要對炎癥和腫瘤的發(fā)生起調(diào)節(jié)作用[13-14]。特別是，PDL-1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)已被證明能抑制T淋巴細(xì)胞活化和誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡[15]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗PD-1單克隆抗體在大量預(yù)處理的TNBC隊列中報告的總體反應(yīng)率為18.5%[16]。

表2 TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者PD-1和PDL-1定量表達(dá)與CD4+、CD8+和Treg百分比的相關(guān)性分析

表3 TNBC患者PD-1和PDL-1表達(dá)與腫瘤臨床特征的關(guān)系(例)

本研究采用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，PD-1和PDL-1定量表達(dá)水平與CD4+、CD8+和Treg百分比呈負(fù)相關(guān)性。提示乳腺癌患者PD-1和PDL-1表達(dá)常與T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，也證實了PD-1和PDL-1與免疫抑制的重要聯(lián)系。雖然PDL-1介導(dǎo)免疫逃避機(jī)制，并被認(rèn)為與預(yù)后不良有關(guān)，但是腫瘤細(xì)胞表達(dá)PDL-1可能在抑制免疫反應(yīng)方面無效，可能僅反映淋巴細(xì)胞浸潤，在一些PDL-1高表達(dá)的惡性腫瘤中，這些腫瘤通常有良好的預(yù)后，包括乳腺癌[17-18]。其他研究也發(fā)現(xiàn)PDL-1并非總與預(yù)后不良相關(guān)，最近對非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤和結(jié)直腸癌的研究表明，PDL-1的表達(dá)與預(yù)后良好有關(guān)[19-20]。其中一項研究指出腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)與98%的PDL-1陽性腫瘤相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)PDL-1與TIL顯著相關(guān)，提示非小細(xì)胞肺癌PDL-1的表達(dá)可能反映了TIL介導(dǎo)的抗腫瘤炎性反應(yīng)，而不是與腫瘤免疫逃逸有關(guān)[21]。

本研究單因素分析發(fā)現(xiàn)，TNBC組PD-1和PDL-1陽性表達(dá)率在腫瘤TNM分期、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面有顯著差異。但該發(fā)現(xiàn)與鐘亞春等[5]結(jié)論不一致，他認(rèn)為腫瘤直徑>5 cm的乳腺癌組織中PD-1和PDL-1表達(dá)水平明顯高于直徑<5 cm的腫瘤組織。但總體來說，PD-1和PDL-1陽性表達(dá)與乳腺癌尤其是TNBC的惡性程度密切相關(guān)。

綜上，TNBC患者腫瘤組織中PD-1/PDL-1異常高表達(dá)可能與T淋巴細(xì)胞免疫功能抑制和腫瘤惡性生物學(xué)行為有關(guān)。本研究創(chuàng)新點在于比較了不同類型腫瘤組織中PD-1/PDL-1及T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)情況，能夠直觀反映腫瘤浸潤的微環(huán)境變化，闡述PD-1/PDL-1表達(dá)與T淋巴細(xì)胞主導(dǎo)的免疫功能的相互作用機(jī)制。但本研究所采用樣本來源為單中心，樣本量有限，且未動態(tài)觀察各指標(biāo)變化情況，因此仍需后續(xù)研究加以證實本文結(jié)論。