李少星，余 華，楊惠歡

宮頸癌是臨床較常見的女性惡性腫瘤，其中80%為鱗狀細(xì)胞癌(cervical squamous cell carcinoma, SCC)，是女性致死性第二大疾病[1]。堿性磷酸酶(ALP)是金屬酶超家族成員之一，多數(shù)存在于骨、肝臟、腎臟中，血清ALP升高被認(rèn)為是體內(nèi)微環(huán)境改變的不良因素之一，既往多被用于肝功能檢測[2]。研究報(bào)道，多種腫瘤及其細(xì)胞系中均有ALP基因過表達(dá)，尤其是睪丸及卵巢癌，ALP可通過影響MAPK信號通路參與腫瘤的發(fā)展[3]。而磷脂酰肌醇-3激酶(PIK3)則屬于磷脂激酶，可與細(xì)胞膜受體發(fā)生相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞外部信號傳入細(xì)胞內(nèi)部[4]。磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基1(PIK3R1)是PI3K的亞基，研究認(rèn)為其可負(fù)向調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲過程，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。也有研究報(bào)道，PIK3R1的減少程度與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移、預(yù)后存在顯著相關(guān)性[6]。本研究分析宮頸癌患者血清ALP、癌組織中PIK3R1基因蛋白表達(dá)水平及臨床意義，以期為宮頸癌診治提供合理的監(jiān)測指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年1月—2019年10月在本院診治的宮頸癌100例作為宮頸癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查確診為宮頸SCC；留存有組織標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：血標(biāo)本及組織標(biāo)本采集前有放化療等治療史、病歷資料缺失。100例年齡27～64(49.12±15.33)歲，其中<55歲53例、≥55歲47例；FIGO分期Ⅰ期42例、Ⅱ期32例、Ⅲ～Ⅳ期26例；高分化12例、中分化42例、低分化46例；癌轉(zhuǎn)移46例。另選取同期因子宮肌瘤行全子宮切除且無子宮肌瘤以外的內(nèi)外科疾病患者30例作為對照組，年齡25～67(50.33±13.85)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2儀器與試劑 ALP試劑盒購自上海申能-德賽診斷技術(shù)有限公司；HITACHI 7080型全自動(dòng)生化分析儀購自日本日立公司；免疫組織化學(xué)染色(免疫組化)油筆、DAB顯色試劑盒、S-P試劑盒及Tween20購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；兔抗人PIK3R1多克隆抗體(一抗)及兔抗小鼠IgG聚合物(二抗)購自Santa Cruz公司；顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3檢測方法

1.3.1血清ALP檢測：所有對象取術(shù)前空腹靜脈血，3000 r/min離心10 min分離血漿，采用HITACHI 7080型全自動(dòng)生化分析儀檢測血清ALP水平。

1.3.2PIK3R1基因蛋白表達(dá)：應(yīng)用免疫組化法檢測，取厚度為4 μm的宮頸組織蠟塊切片烘干，后依次二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟10 min；無水乙醇Ⅱ、95%無水乙醇、85%無水乙醇、75%無水乙醇依次浸泡5 min，流水沖洗5 min；枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)，Tween20細(xì)胞通透，3%過氧化氫消除組織中內(nèi)源性過氧化物酶；后滴加山羊血清于組織切片，免疫組化于濕盒內(nèi)封閉25 min，封閉非特異性蛋白；孵育一抗、二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，依次95%無水乙醇、85%無水乙醇、75%無水乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ脫水；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，中性樹膠封片，鏡下攝片。應(yīng)用Image Pro Plus測量平均吸光度值為PIK3R1基因蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1宮頸癌患者血清ALP及癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá) 宮頸癌患者血清ALP顯著高于對照組，癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1、圖1。

2.2不同病理特征的宮頸癌患者血清ALP及癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá) 不同年齡、FIGO分期、分化程度及轉(zhuǎn)移情況的宮頸癌患者血清ALP、PIK3R1基因蛋白比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，其中年齡≥55歲的宮頸癌患者血清ALP顯著高于<55歲患者，血清ALP隨患者FIGO分期的增加及分化程度的降低而上升，合并轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者血清ALP顯著高于未合并轉(zhuǎn)移患者；而年齡≥55歲的宮頸癌患者癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)顯著低于<55歲患者，癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)隨FIGO分期的增加及分化程度的降低而下降，合并轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)顯著低于未合并轉(zhuǎn)移患者。見表2。

表1 宮頸癌和子宮肌瘤患者血清堿性磷酸酶及癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)

圖1 正常宮頸組織及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基1基因蛋白表達(dá)

表2 不同病理特征的宮頸癌患者血清ALP及癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)

3 討論

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤，病理檢查是宮頸癌的診斷金標(biāo)準(zhǔn)。正常宮頸由鱗狀上皮細(xì)胞、鱗狀柱狀上皮細(xì)胞交界處和柱狀上皮細(xì)胞組成，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)良好，細(xì)胞核未見增大、細(xì)胞未見變形；而宮頸癌組織中鱗狀上皮細(xì)胞異型甚至消失，可見形態(tài)異常、藍(lán)紫色細(xì)胞核，腫瘤累及的宮頸正常形態(tài)結(jié)構(gòu)消失，可見不同程度增生的異型腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞核增大、變形、分裂，腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)塊狀聚集[7-8]。當(dāng)前臨床針對Ⅰ～ⅡA期宮頸癌主要以根治性手術(shù)及放療為主，多數(shù)預(yù)后較好，5年生存率超65%，但仍有15%～30%患者在接受根治性手術(shù)后復(fù)發(fā)[9]。針對ⅡB～Ⅳ期宮頸癌患者則主要以放化療為主，預(yù)后較差，5年生存率不足15%[10]。當(dāng)前臨床評價(jià)宮頸癌患者預(yù)后主要是根據(jù)FIGO分期、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，但有一定滯后性及局限性[11]。而隨著臨床研究的不斷深入，血清標(biāo)志物在腫瘤疾病中的應(yīng)用已成為臨床研究的熱點(diǎn)，但現(xiàn)階段宮頸癌相關(guān)的血清腫瘤標(biāo)志物研究相對少見。ALP由肝細(xì)胞合成、分泌，廣泛存在于人體各器官中，其中以肝臟、骨骼中含量較高。研究指出，ALP可催化脫氧核酸脫掉5＇-P基團(tuán)使DNA、RNA片段的5＇-P末端轉(zhuǎn)換成5＇-OH末端，影響DNA及RNA功能，并進(jìn)一步影響其相關(guān)蛋白質(zhì)的合成[12]。既往ALP檢測多用于肝臟疾病，當(dāng)肝臟發(fā)生病變時(shí)肝細(xì)胞過度合成ALP，并通過淋巴管、肝竇進(jìn)入血液循環(huán)而導(dǎo)致血清ALP上升，提示被測者存在肝功能障礙，但其不能明確病因[13]。本研究顯示，宮頸癌組血清ALP顯著高于對照組，且隨著FIGO分期的增加，宮頸癌患者血清ALP也逐漸上升，且合并轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者血清ALP水平更高。既往有研究報(bào)道，ALP可影響MAPK信號通路，而異常的MAPK信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展又密切相關(guān)[14]。另隨著腫瘤分期的增加，宮頸癌癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肝臟、腎臟也可引起肝細(xì)胞過度產(chǎn)生ALP，引起ALP上升[14]。

現(xiàn)階段研究證實(shí)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展可能涉及多個(gè)基因及步驟，尋找宮頸癌發(fā)生過程中分子遺傳學(xué)改變以尋找簡便可行的診斷及預(yù)后評估指標(biāo)也是近年學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。PI3K/蛋白激酶B(AKT)信號通路是宮頸癌的重要信號通路[15]。PI3K/AKT信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)化及存活等多種功能，不僅如此PI3K/AKT信號通路也參與細(xì)胞的病理過程，其失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞生長、增殖及存活失調(diào)，與腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PI3K/AKT信號通路中PI3K可結(jié)合定位于質(zhì)膜的受體而激活，通過磷酸化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸產(chǎn)生三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)[16]。而AKT則通過PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合PIP3而形成磷酸化的AKT，進(jìn)而啟動(dòng)PI3K/AKT信號通路。而在PI3K家族中又以Ⅰ型PI3K研究最為廣泛。Ⅰ型PI3K由細(xì)胞表面受體激活，是由催化亞基(p110α、p110β、p110δ)、調(diào)節(jié)亞基(p85α、p55α、p50α、p85β、p55γ)構(gòu)成的異二聚體，具有類脂激酶和蛋白激酶雙重活性。其中催化亞基p110α由P1K3CA基因編碼，而調(diào)節(jié)亞基p85α則由PIK3R1基因編碼[17]。本研究顯示，宮頸癌癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)顯著低于對照組；且年齡≥55歲的宮頸癌患者癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)顯著低于<55歲患者，癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)隨FIGO分期增加及分化程度的降低而下降，合并轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者癌組織PIK3R1基因蛋白表達(dá)顯著低于未合并轉(zhuǎn)移患者。提示PIK3R1基因在宮頸癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用，這與Hamaguchi等[18]報(bào)道結(jié)論相似。但有研究指出，在卵巢癌、結(jié)腸癌中PIK3R1主要發(fā)揮癌基因作用[19-20]?；诒狙芯恐蠥LP、PIK3R1與宮頸癌病理特征的關(guān)系，筆者認(rèn)為或可將ALP、PIK3R1作為宮頸癌患者的預(yù)后評估指標(biāo)。

綜上所述，宮頸癌患者血清ALP水平較高，而PIK3R1基因蛋白表達(dá)較低，且ALP、PIK3R1與FIGO分期、腫瘤分化程度及轉(zhuǎn)移情況有一定關(guān)聯(lián)，可能參與宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展，或可作為宮頸癌預(yù)后評估的指標(biāo)之一，但具體機(jī)制仍有待探究。