樊亞東 ，于爽 ，張曉雨 ，王麗 ，白立鼎 ，常軍 ，邊育紅

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381；3.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192）

抑郁癥是全球致殘的主要原因[1]。慢性疾病伴隨抑郁癥將引起自感健康、健康相關(guān)生活質(zhì)量和治療依從性的進(jìn)一步降低，并導(dǎo)致更高的死亡率[2-4]。肝硬化是各類慢性肝病的終末發(fā)展階段之一，目前其病死率在全球疾病死亡中排第14位[5]。相當(dāng)比例的肝硬化患者存在情緒障礙，其抑郁癥的時(shí)點(diǎn)患病率約為17%～57%，越來越多的研究認(rèn)為心理因素影響肝硬化患者的發(fā)展和預(yù)后[6]。在乙型肝炎導(dǎo)致的肝硬化患者中，抑郁癥發(fā)病率與肝硬化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[7]。許多臨床證據(jù)支持肝硬化和抑郁癥的相關(guān)性，并推測兩者存在潛在的共同發(fā)病機(jī)制，但目前兩者共同機(jī)制尚未明確[8]。

肝爽顆?；糜阱羞b散，具有疏肝健脾、清熱散瘀和軟堅(jiān)散結(jié)的功效。多中心臨床研究報(bào)道[9]：肝爽顆?？筛纳聘闻K炎癥活動(dòng)度和肝纖維化程度治療慢性乙型肝炎，且具有較好的安全性。系統(tǒng)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：肝爽顆粒對(duì)乙型肝炎肝硬化具有一定臨床療效[10]。肝爽顆粒的主方逍遙散具有明確的抗抑郁作用，肝爽顆粒在臨床應(yīng)用時(shí)也具有較好的抗抑郁作用[11]。然而，肝爽顆粒治療肝硬化和抑郁癥共病的作用機(jī)制研究存在空白，尚未引起學(xué)者足夠關(guān)注。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)和多向藥理學(xué)，尤其適合揭示中醫(yī)藥的復(fù)雜作用機(jī)制。近年來，隨著疾病共同發(fā)病機(jī)制的探索逐步深入，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法也被引入其中。借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討中醫(yī)中藥“異病同治”的研究也逐漸興起[12]。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探索和闡述肝硬化和抑郁癥發(fā)病之間的潛在機(jī)制聯(lián)系，并為肝爽顆?！爱惒⊥巍敝委煾斡不鸵钟舭Y的藥理學(xué)機(jī)制提供依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來源與方法

1.1 肝硬化和抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)獲取 以“cirrhosis”“l(fā)iver cirrhosis”“hepatic Cirrhosis”“depression”“major depressive disorder”“MDD”等為檢索詞分別通 過 OMIM （http：//www.omim.org） 和 Drugbank（https：//www.Drugbank.ca/） 數(shù)據(jù)庫獲取肝硬化和抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 肝爽顆粒成分與靶點(diǎn)挖掘 使用TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）、TCMSP （http：//tcmspw.com）和 Batman-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫及相關(guān)技術(shù)平臺(tái)挖掘肝爽顆粒單味中藥的化學(xué)成分。在Batman-TCM數(shù)據(jù)庫中設(shè)置化合物靶點(diǎn)預(yù)測的閾值（score cutoff＞20）篩選肝爽顆粒單味藥的潛在蛋白靶點(diǎn)。使用Uniport數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，對(duì)篩選出的蛋白進(jìn)行名稱規(guī)范轉(zhuǎn)化操作。將上述中藥化學(xué)成分靶點(diǎn)與肝硬化及抑郁癥靶點(diǎn)取交集，得到肝爽顆粒治療兩病的共同作用靶點(diǎn)。導(dǎo)入String Version 11.0平臺(tái)（https：//stringdb.org/）構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。選取分值＞0.9分的高置信度區(qū)間蛋白，并根據(jù)自由度值（一個(gè)節(jié)點(diǎn)在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中與該點(diǎn)直接作用的節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，自由度越大則其參與的生物功能越多）篩選藥物作用靶點(diǎn)。

1.3 相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析與構(gòu)建 使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA） 軟件的“Core Analysis”和“Disease&Function”模塊分別對(duì)肝硬化和抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行通路和功能分析。進(jìn)一步采用“Comparison Analysis”模塊尋找兩種疾病共同的通路和功能。將肝爽顆粒治療肝硬化和抑郁癥的共同作用靶點(diǎn)分別導(dǎo)入BioGPS和Genecards數(shù)據(jù)庫中獲得組織和亞細(xì)胞分布相關(guān)信息。對(duì)藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行通路和功能注釋分析，并與肝硬化和抑郁癥共同發(fā)病機(jī)制進(jìn)行比對(duì)，得到疾病治療的核心靶點(diǎn)及相關(guān)通路，并作“異病同治”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 疾病靶點(diǎn)與肝爽顆粒作用靶點(diǎn)的獲取 檢索數(shù)據(jù)庫得到肝硬化和抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)，分別為779和506個(gè)。收集肝爽顆?；衔锍煞趾桶悬c(diǎn)信息見表1。將肝爽顆?；瘜W(xué)成分的1 770個(gè)靶點(diǎn)與肝硬化和抑郁癥靶點(diǎn)取交集，獲得肝爽顆粒治療兩病的56個(gè)共同作用靶點(diǎn)。見圖1。

在String Version 11.0平臺(tái)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化，見圖2。根據(jù)自由度篩選得到47個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，見表2。

2.2 肝硬化和抑郁癥發(fā)病機(jī)制分析 將779個(gè)肝硬化相關(guān)靶點(diǎn)和506個(gè)抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)分別導(dǎo)入IPA分析軟件，通過軟件的“Core Analysis”和“Disease&Function”模塊分別進(jìn)行通路和功能分析。通過“Comparison Analysis”模塊尋找密切相關(guān)的共同通路和功能，結(jié)果見圖3。

表1 肝爽顆粒化合物成分和靶點(diǎn)情況Tab.1 Ingredients and targets situation of Ganshuang Granules

圖1 肝爽顆粒、肝硬化和抑郁癥靶點(diǎn)情況Fig.1 Targets situation of cirrhosis，depression and Ganshuang Granules

2.3 肝爽顆粒治療兩病共同作用靶點(diǎn)組織和亞細(xì)胞分布情況 將47個(gè)肝爽顆粒治療肝硬化和抑郁癥的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)導(dǎo)入BioGPS數(shù)據(jù)庫，獲得其組織分布信息。為保證結(jié)果的可靠性，保留每個(gè)基因表達(dá)量較高的前5位組織，將組織分布信息導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建組織-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4A。其中藍(lán)色菱形節(jié)點(diǎn)表示組織，節(jié)點(diǎn)表示度值大小，紅色V型節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)。

將上述47個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Genecards數(shù)據(jù)庫，獲取和保留confidence大于5的各靶點(diǎn)亞細(xì)胞分布信息。采用Cytoscape軟件構(gòu)建亞細(xì)胞-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4B。其中藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，紅色三角形節(jié)點(diǎn)代表亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

圖2 肝爽顆粒作用靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系Fig.2 Interaction between target proteins of Ganshuang Granules

表2 56個(gè)作用靶點(diǎn)自由度情況Tab.2 Degrees of freedom of 56 targets

2.4 肝爽顆粒治療肝硬化和抑郁癥的作用機(jī)制和功能分析 將47個(gè)肝爽顆粒治療肝硬化和抑郁癥的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，導(dǎo)入IPA分析軟件進(jìn)行核心機(jī)制和生物功能分析，見圖5。結(jié)果顯示：作用靶點(diǎn)富集于肝纖維化/肝星狀細(xì)胞活化、神經(jīng)炎癥信號(hào)通路、糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)、HMGB1信號(hào)、動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)、LXR/RXR激活、急性期反應(yīng)信號(hào)、巨噬細(xì)胞白細(xì)胞介素（IL）-12分泌、細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞間通訊中的作用、肝臟膽汁淤積等信號(hào)通路。

47個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)在生物功能層面與免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、自由基清除、脂質(zhì)代謝、分子轉(zhuǎn)運(yùn)、小分子生化、神經(jīng)學(xué)疾病、心血管系統(tǒng)發(fā)育和功能、代謝類疾病、碳水化合物代謝、肝臟疾病、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能、膽臟系統(tǒng)發(fā)育和功能等均呈現(xiàn)較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。

2.5 肝爽顆粒對(duì)肝硬化和抑郁癥“異病同治”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過比對(duì)肝爽顆粒網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果與肝硬化和抑郁癥的潛在共同發(fā)病機(jī)制和功能結(jié)果，尋找前十名重復(fù)機(jī)制及相關(guān)核心靶點(diǎn)，構(gòu)建肝爽顆?！爱惒⊥巍本W(wǎng)絡(luò)，見圖6。綠色節(jié)點(diǎn)表示31個(gè)核心治療靶點(diǎn)，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為通路歸類，紅色節(jié)點(diǎn)是肝硬化和抑郁癥相關(guān)的診斷和治療生物標(biāo)志物。

3 討論

肝硬化歸屬于中醫(yī)“鼓脹”范疇，基本病機(jī)為：情志不舒，肝氣郁結(jié)，氣機(jī)不利，以致血行不暢，瘀血壅滯肝之脈絡(luò)，肝氣橫逆乘脾，脾失健運(yùn)，水濕不化，飲停腹中，終成鼓脹。抑郁癥歸屬“郁證”范疇，基本病機(jī)為氣機(jī)郁滯，導(dǎo)致肝失疏泄，脾失健運(yùn)，心失所養(yǎng)，臟腑陰陽氣血失調(diào)。因此，中醫(yī)基礎(chǔ)理論中，氣機(jī)不暢，氣血失和，是肝硬化和抑郁癥發(fā)病的重要共同病機(jī)。

肝硬化是所有進(jìn)展性和慢性肝病的最后階段。目前，免疫系統(tǒng)失調(diào)和系統(tǒng)性炎癥被認(rèn)為是肝硬化自然史中涉及的主要生理病理通路。一些系統(tǒng)性炎癥相關(guān)的血清學(xué)指標(biāo)和臨床參數(shù)已被作為評(píng)估肝硬化晚期的預(yù)后標(biāo)志物[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍免疫系統(tǒng)之間存在長期溝通與相互影響。抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與免疫系統(tǒng)的破壞有關(guān)[15]。一方面，肝硬化患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，可導(dǎo)致神經(jīng)炎癥，對(duì)涉及情緒調(diào)節(jié)的大腦區(qū)域產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致抑郁癥狀[16]；另一方面，因病情反復(fù)、治療周期長、費(fèi)用高等問題，患者處于長期壓力暴露狀態(tài)，不但導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍免疫系統(tǒng)失衡，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥相關(guān)免疫系統(tǒng)的激活與亢進(jìn)，還將引起患者大腦結(jié)構(gòu)和功能的改變，造成行為學(xué)的深刻改變，加速抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[17-19]。肝硬化患者產(chǎn)生抑郁和焦慮等心理問題，引起患者治療依從性和治療預(yù)后差等問題，進(jìn)一步導(dǎo)致病情惡化，形成惡性循環(huán)。

圖3 肝硬化和抑郁癥發(fā)病機(jī)制和功能分析Fig.3 Mechanism and function analysis of cirrhosis and depression

圖4 肝爽顆粒治療肝硬化和抑郁癥47個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的組織-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（A）和亞細(xì)胞-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（B）Fig.4 Tissue-target network(A)and subcellular-targets network(B)of 47 key targets for treatment of cirrhosis and depression of Ganshuang Granules

圖5 肝爽顆粒治療肝硬化和抑郁癥核心機(jī)制和生物功能Fig.5 Core mechanisms and biological functions of Ganshuang Granules in the treatment of cirrhosis and depression

圖6 肝爽顆粒治療肝硬化和抑郁癥“異病同治”網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Network of treating different diseases with same method of Ganshuang Granules in treating cirrhosis with depression

肝硬化和糖脂代謝之間存在復(fù)雜的相互作用和因果聯(lián)系。肝臟在糖脂代謝中占據(jù)核心地位，任何病因所致的肝硬化均可影響肝臟調(diào)控糖脂代謝，易誘發(fā)或加重糖脂代謝紊亂[20]。大量研究顯示，糖脂代謝紊亂導(dǎo)致的代謝性疾病，對(duì)大腦功能會(huì)有不良影響，引起情緒障礙和認(rèn)知損傷。薈萃分析顯示，代謝性疾病與情緒障礙間存在雙向聯(lián)系，提示抑郁癥會(huì)增加糖脂代謝異常發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[21]。因此，免疫功能失調(diào)、炎癥反應(yīng)和糖脂代謝異?？赡苁歉斡不鸵钟舭Y并發(fā)的關(guān)鍵作用機(jī)制，未來可作深入探究。

肝爽顆粒主方逍遙散對(duì)抑郁癥具有較好的臨床療效，方中柴胡-白芍藥對(duì)具有明確的抗抑郁作用[22-23]。最近的一項(xiàng)研究，采用高效液相色譜分析初步分析肝爽顆粒中的化學(xué)物質(zhì)含有：芍藥苷、虎杖苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、丹參酮ⅡA以及大黃素等，成分都具有明確的抗炎、抗抑郁和調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[24-25]。肝爽顆粒對(duì)肝硬化和抑郁癥“異病同治”網(wǎng)格構(gòu)建結(jié)果顯示：抑制肝纖維化/肝星狀細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥可能是肝爽顆粒治療兩病的重要基礎(chǔ)。涉及的相關(guān)通路如糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)、HMGB1信號(hào)、急性期反應(yīng)信號(hào)、巨噬細(xì)胞IL-12分泌、肝臟膽汁淤積、樹突狀細(xì)胞成熟、固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的互作、IL-6信號(hào)通路都與免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用密切相關(guān)。提示肝爽顆粒治療肝硬化和抑郁癥涉及多靶點(diǎn)、多通路。篩選出的31個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)是藥物治療兩病的核心靶點(diǎn)，涉及免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)、碳水化合物代謝等眾多方面。如血清炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、干擾素（IFN）等異常增高可促進(jìn)抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[26]。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、IFN-γ、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、金屬蛋白酶（MMP）9等細(xì)胞因子分泌異常，與肝星狀細(xì)胞活化和肝硬化的形成與發(fā)展密切相關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，促炎細(xì)胞因子HMGB1可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放炎癥因子，引起慢性神經(jīng)退行性病變，已成為抑郁癥治療的新靶點(diǎn)[27]。此外，HMGB1還可用于區(qū)分慢性乙肝患者纖維化情況。抑制HMGB1可降低炎癥、凋亡和纖維化，阻止慢性肝病向肝硬化進(jìn)展[28]。值得注意的是：LEP、過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPAR）-γ、mTOR、APoE、AKT1、胰島素樣生長因子（IGF）1、IGF2等糖脂代謝的相關(guān)調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，是肝爽顆粒調(diào)節(jié)糖脂代謝、調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在治療網(wǎng)絡(luò)中具有重要價(jià)值。藥物作用靶點(diǎn)組織和亞細(xì)胞分布結(jié)果顯示：肝爽顆粒作用靶點(diǎn)多分布于心肌細(xì)胞、（胚胎）肝臟、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、眾多免疫器官和細(xì)胞以及松果體、前額皮質(zhì)及腦橋上，符合藥物治療肝硬化和抑郁癥的生理基礎(chǔ)。同時(shí)，結(jié)果提示：藥物可能通過外泌體、高爾基體及線粒體發(fā)揮藥效。已有研究表明[24]，肝爽顆?？赏ㄟ^抑制肝星狀細(xì)胞的活化以及抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活化，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。肝爽顆?？捎行Ц纳坡砸倚透窝谆颊吒喂δ埽档透卫w維化血清標(biāo)志物水平，且在逆轉(zhuǎn)肝纖維化和減輕肝內(nèi)炎癥和壞死方面具有較好療效[29]。這些結(jié)果表明肝爽顆粒具有調(diào)節(jié)免疫功能和抗炎作用，與本研究結(jié)果相符。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘肝硬化和抑郁癥的潛在共同發(fā)病機(jī)制，闡釋中藥肝爽顆粒對(duì)肝硬化和抑郁癥“異病同治”的作用機(jī)制，為其臨床實(shí)踐提供了可靠的理論支撐。由于數(shù)據(jù)庫信息的不完善以及技術(shù)手段的不確定性，研究結(jié)果具有一定局限性，未來仍需對(duì)此進(jìn)行深入挖掘及驗(yàn)證。