郝曉鵬，王 燕，董 雪，田 翔，趙建棟，暢建武

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所），農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜糧研究中心（太原），山西太原 030031）

山黧豆（Lathyrus sativus L.）又稱(chēng)家山黧豆、草香豌豆、牙豆，是豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionoideae）山黧豆屬（Lathyrus L.）的唯一栽培種，為一種起源于西亞和中東地區(qū)的古老作物[1-2]。山黧豆在我國(guó)主要種植在甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古、陜西和山西。山黧豆可以食用種子、芽菜，植株可作牧草，因其具有耐旱、耐瘠薄、耐澇、耐鹽堿和抗病蟲(chóng)的特點(diǎn)，是世界貧窮地區(qū)和農(nóng)業(yè)環(huán)境惡劣地區(qū)的首選作物[3]。盡管山黧豆有上述諸多優(yōu)點(diǎn)，但由于山黧豆毒素（β-L-oxalyl-2，3-diaminopropionic acid，β-ODAP）大量存在于其種子、幼苗和植株的根、莖、葉等各組織和各生育期，而長(zhǎng)期食用會(huì)導(dǎo)致人和牲畜等神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[4]。因此，該毒素是山黧豆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的主要限制因素，已成為山黧豆種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的瓶頸[5-7]。迄今為止，僅鑒定出一些低毒資源[8]，尚未發(fā)現(xiàn)山黧豆無(wú)毒品種。

山黧豆毒素，即三七素（Dencichine），易溶于水，呈酸性，為一種非蛋白質(zhì)氨基酸，分子式C5H8N2O5，分子質(zhì)量176.13 g/mol。目前發(fā)現(xiàn)存在于山黧豆（Lathyrus sativus）、豬屎豆（Crotalaria mucronata）、金合歡（Acacia farnesiana）、三七（Panax notoginseng）、人參（Panax ginseng）和蘇鐵（Cycas revoluta）等植物當(dāng)中，并作為止血、活血藥物的重要功能成分[9]。山黧豆毒素不僅具有藥用功效，而且在植物抗逆性、化感作用、抑制真菌和昆蟲(chóng)拒食等方面有重要作用[10]。

研究表明，該毒素還存在一個(gè)同分異構(gòu)體（α-L-oxalyl-2，3-diaminopropionic acid，α-ODAP），毒理學(xué)研究得出該異構(gòu)體沒(méi)有神經(jīng)毒性，而β-ODAP在水溶液、高溫條件或者酸堿性條件下可以向α-ODAP 異構(gòu)體轉(zhuǎn)變[11-12]。

本研究采用Emmrich 改進(jìn)后的Rao 分光光度法[13-14]，對(duì)137 份山黧豆種質(zhì)資源ODAP 含量鑒定，以期篩選出高毒、低毒資源，可為山黧豆無(wú)毒、低毒品種篩選和利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 選擇來(lái)源于印度、敘利亞、埃塞俄比亞、西班牙、孟加拉國(guó)、俄羅斯等國(guó)家的137 份山黧豆種質(zhì)資源，現(xiàn)保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心種質(zhì)資源庫(kù)。

1.1.2 儀器設(shè)備 Synergy H1 全功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek），5804R 高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），HH-600 型水浴鍋（江蘇金分儀器有限責(zé)任公司），Dragon lab MX-S 漩渦儀（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司），Tissue lyser Ⅱ高通量研磨儀（德國(guó)QIAGEN），Direct-Q3 超純水儀（美國(guó)Millipore）。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 無(wú)水乙醇分析純（≥99.7%，天津市開(kāi)通化學(xué)試劑有限公司），KOH 分析純（≥85.0%，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），鄰苯二甲醛生化試劑（≥99.0%，生工生物工程（上海）股份有限公司），四水合四硼酸鉀生化試劑（≥98.0%，生工生物工程（上海）股份有限公司）、β-巰基乙醇生物試劑（≥99.0%，生工生物工程（上海）股份有限公司）、超純水（自制）、三七素標(biāo)樣（≥98.0%，上海純優(yōu)生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 2018 年7 月，將137 份山黧豆種質(zhì)資源播種于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大吳創(chuàng)新基地智能溫室中。采用育苗盤(pán)進(jìn)行播種，每穴播種3 粒，每份材料2 個(gè)重復(fù)。播種后10 d，取葉片放入預(yù)先填充變色硅膠的10 mL 離心管當(dāng)中，4 ℃冰箱中干燥10 d，使葉片完全脫水。分別稱(chēng)取10 mg 干燥葉片放入含有鋼珠的2 mL 離心管，采用高通量研磨機(jī)粉碎成粉末狀。

1.2.2 緩沖液配制（1）稱(chēng)取鄰苯二甲醛41 mg，溶解于1 mL 乙醇中，加入82 μL β-巰基乙醇，配制成A 液。（2）稱(chēng)取6.25 g 四水合四硼酸鉀，在60 ℃水浴下溶解并冷卻至室溫，配制成B 液。將A 液與B 液混合，定容于50 mL 容量瓶中，配制成OPA-Tetraborate buffer。

1.2.3 回歸曲線建立方法 稱(chēng)取0.6 mg 三七素標(biāo)準(zhǔn)樣于2 mL 離心管當(dāng)中，用1 mL 超純水60 ℃加熱溶解，制備成三七素母液。而后將0.6 mg/mL 母液依次稀釋為0.3、0.15、0.075、0.037 5、0.018 75、0.009 375 mg/mL 共7 個(gè)梯度，每個(gè)濃度設(shè)置4 個(gè)重復(fù)。每個(gè)樣品檢測(cè)4 次，取平均值，并基于不同濃度和吸光度值建立回歸方程。

1.2.4 ODAP 毒素檢測(cè) 將10 mg 葉片研磨后的粉末加入1.5 mL 蒸餾水旋渦儀混勻，放入95 ℃水浴鍋當(dāng)中20 min，提取ODAP 毒素。采用Emmrich 等改進(jìn)后的Rao 分光光度法，使用BioTek Synergy H1全功能微孔板檢測(cè)儀在420 nm 波長(zhǎng)進(jìn)行吸光度（OD）檢測(cè)，每個(gè)樣品檢測(cè)4 次，取平均值。

其中，y 為提取液當(dāng)中ODAP 濃度（mg/mL），z 為干燥葉片ODAP 百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸方程的建立

由表1 可知，隨著標(biāo)準(zhǔn)樣質(zhì)量濃度由大到小成比例降低（0.6～0.009 375 mg/mL），各濃度吸光度值呈現(xiàn)成比例的遞減（1.891～0.018）。而變異系數(shù)則是由高濃度向低濃度逐漸增大，這是由于隨著質(zhì)量濃度的降低，儀器本身的系統(tǒng)誤差造成的。

表1 7 個(gè)濃度下4 個(gè)平行各吸光度值統(tǒng)計(jì)

由圖1 可知，采用一元線性回歸模型，最終建立回歸方程y＝0.314 6x＋0.006 7（R2＝0.999 8），其中，x 為水解反應(yīng)液與對(duì)照的吸光度值之差，y 為提取液濃度。

2.2 ODAP 在山黧豆資源中含量分異

在建立回歸方程的基礎(chǔ)上，對(duì)137 份山黧豆種質(zhì)資源苗期10 d 葉片進(jìn)行取樣。

由圖2 可知，137 份山黧豆葉片當(dāng)中ODAP 含量平均值為3.552%，最大值為7.307%，最小值為1.065%，標(biāo)準(zhǔn)差為1.115，通過(guò)K-S 檢驗(yàn)，P 值為0.839（P≥0.05），即137 份山黧豆種質(zhì)資源葉片ODAP 含量符合正態(tài)分布。

2.3 山黧豆資源ODAP 含量等級(jí)劃分

對(duì)137 份山黧豆葉片ODAP 含量進(jìn)行方差和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，采用以1δ 為間距（δ 為ODAP 含量標(biāo)準(zhǔn)差，X 為含量平均值），劃分為5 級(jí)，其中，1 級(jí)＜X-1.5δ，5 級(jí)≥X＋1.5δ，每一級(jí)相差1δ，ODAP 含量劃分等級(jí)如表2 所示。

表2 137 份山黧豆ODAP 含量等級(jí)統(tǒng)計(jì)

由表2 可知，在137 份山黧豆資源中，ODAP中等級(jí)資源有63 份，平均值為3.477%。中低等級(jí)和中高等級(jí)資源均為29 份，平均值為2.532%和4.566%。低等級(jí)和高等級(jí)資源均為8 份，平均值分別為1.478%和6.239%。

從變異系數(shù)來(lái)看，中高等級(jí)資源變異系數(shù)最低，為0.063，低等級(jí)資源變異系數(shù)最高，為0.191。

3 結(jié)論與討論

有關(guān)山黧豆毒素定量檢測(cè)方法的研究較多，有Rao 分光光度法[15]、熒光光度法[16]、高效液相色譜法[17-20]、毛細(xì)管電泳法[21]和氣相色譜質(zhì)譜分析法[22]等。分光光度法和熒光光度法檢測(cè)準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、快速，但無(wú)法區(qū)分2 個(gè)異構(gòu)體，高效液相色譜法檢測(cè)準(zhǔn)確度較高，但操作繁瑣，僅適合少批量精確鑒定，而毛細(xì)管電泳法和氣相色譜質(zhì)譜分析法則應(yīng)用較少。

分光光度法和高效液相色譜法均是氨基酸及其類(lèi)似物常用的檢測(cè)方法之一[23-24]。其在山黧豆ODAP 檢測(cè)中應(yīng)用較為普遍，其中，分光光度法主要利用ODAP 水解產(chǎn)物α，β-二氨基丙酸（α，β-diaminopropionic acid，DAP）與鄰苯二甲醛（O-phthal aldehyde，OPA）及巰基乙醇（β-Mercaptoethanol，β-Me）反應(yīng)形成咪唑-異吲哚的黃色產(chǎn)物，在420 nm條件下有高的吸收峰[9，14，25]。本研究采用Emmrich 改進(jìn)后的分光光度法較李志孝等[16]熒光光度法和高效液相色譜法[18]減少了樣品前處理繁瑣的技術(shù)流程，節(jié)省了檢測(cè)分析時(shí)間，相比較液相色譜方法更加快速、高效。

本研究通過(guò)采用Rao 改進(jìn)后的分光光度法建立了山黧豆ODAP 含量和吸光度的回歸方程，實(shí)現(xiàn)了ODAP 含量的快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)。通過(guò)頻度分布檢驗(yàn)，確定毒素含量在137 份山黧豆中呈正態(tài)分布，將137 份山黧豆資源ODAP 含量劃分為5 級(jí)并篩選到高毒和低毒山黧豆資源各8 份。