嚴雙美，米雅萱，崔玥，鄭澤寶，趙曉瓏

(1. 河北大學 化學與環(huán)境科學學院, 河北 保定 071002；2. 泰山學院 化學化工學院，山東 泰安 271021)

近年來，人們對能夠識別G-四鏈體的新藥物產(chǎn)生了濃厚的興趣[1]. G-四鏈體是由富含鳥嘌呤(G堿基)的核酸序列形成的鳥嘌呤四分體組合構成[2-3]. 有證據(jù)表明，在人類的基因組[4]和mRNA[5]中都發(fā)現(xiàn)了G-四鏈體的存在，特別是在原癌基因啟動子區(qū)域和端粒中. 原癌基因c-myc在高達80%的實體瘤中過表達，但在正常細胞中表達較低，并且與細胞增殖、凋亡密切相關[6].c-myc的過表達會引發(fā)一些癌癥，如結腸癌、乳腺癌、宮頸癌和肺癌、骨肉瘤和白血病等[7-9]. 而c-myc中也含有富G序列，可以通過Hoogesten氫鍵形成G-四鏈體結構，進而來抑制c-myc的復制和翻譯[10-11]. 因此，G-四鏈體已成為癌癥研究中的生物學靶標，并且有可能成為基于DNA靶向治療的新目標[1]. 同時，金屬配合物與G-四鏈體的相互作用成為了新的研究方向，金屬抗癌藥物受到研究者們越來越多的關注[2-3].

順鉑是治療癌癥的金屬藥物之一[12]，但因其有嚴重的副作用和耐藥性，迫使人們?nèi)ふ夷軌蛱娲慕饘偎幬? 其中，釕配合物因具有較多優(yōu)點而受到重視，如它對健康組織有較低的毒性，具有良好的光化學、光物理性能和豐富的光譜學性質(zhì)等[3,13-17]. 據(jù)文獻[18]報道，劉杰課題組發(fā)現(xiàn)配合物[Ru(phen)2(dhipH3)]2+對c-mycPu27 G-四鏈體有很強的結合力，而且可以通過誘導HeLa細胞產(chǎn)生活性氧，進而使線粒體膜電位去極化導致細胞凋亡. 在對釕配合物研究的過程中，人們發(fā)現(xiàn)一些雙核或者多核配合物的中心金屬能夠提供更多的正電荷，它們與單核配合物相比，更具有優(yōu)勢[19]. 計亮年課題組[20]合成的雙核釕配合物[(bpy)2Ru(ebipcH2)Ru(bpy)2]4+、[(bpy)2Ru(mbpibH2)Ru(bpy)2]4+和[(bpy)2Ru(hbpibH2)Ru(bpy)2]4+都能誘導端粒序列AG3(T2AG3)3形成G-四鏈體結構，并且對G-四鏈體有較強的穩(wěn)定作用和較高的選擇性，其中雙核釕配合物[(bpy)2Ru(ebipcH2)Ru(bpy)2]4+能有效地抑制端粒酶活性以及HaLa細胞的增殖. Thomas課題組[21]合成了2個雙核釕配合物[(phen)2Ru(tpphz)Ru(phen)2]4+和[(TAP)2Ru(tpphz)Ru(TAP)2]4+，它們對雙鏈DNA和G-四鏈DNA都有很好的鍵合作用， 其中，配合物[(phen)2Ru(tpphz)Ru(phen)2]4+主要定位于人黑色素瘤細胞的線粒體中，而配合物[(TAP)2Ru(tpphz)Ru(TAP)2]4+主要定位于人黑色素瘤細胞的細胞核中，且[(TAP)2Ru(tpphz)Ru(TAP)2]4+在黑暗條件下沒有毒性，一旦被光敏化，就會對人黑色素瘤細胞產(chǎn)生顯著的毒性. 張丹課題組合[22]成了一個含有非環(huán)冠醚的雙核釕配合物，其具有顯著穩(wěn)定G-四鏈體的能力，并且與G-四鏈體作用后的熒光強度增強約15倍，但與雙鏈DNA結合后熒光強度不變，說明配合物能選擇性結合G-四鏈體，可以作為G-四鏈體的熒光探針.

基于雙核或多核釕配合物在與G-四鏈體作用中的優(yōu)勢，本文合成了一個含有苯酚基的雙核釕配合物，并通過紫外可見吸收光譜和熒光光譜滴定、Job plot、圓二色光譜、PCR擴增反應、顯色反應、FRET實驗研究了其與c-mycG-四鏈體DNA (c-mycPu27和c-mycPu22)之間的相互作用.

1 實驗部分

1.1 釕配合物的合成與表征

釕配合物參考文獻[23]的方法合成，其表征結果與參考文獻一致，該配合物結構如圖1所示.

圖1 釕配合物的結構Fig.1 Structure of ruthenium complex

1.2 主要原料與試劑

c-mycPu27 DNA (5′-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG-3′), Pu27rev (5′-ATCGATCGCTTCTCGTCCTTCCCCA-3′),c-mycPu22 DNA (5′-GAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAG-3′), Pu22rev (5′-ATCGCTTCTCGTCTTCCCCA-3′), F27T (5′-FAM-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG-TAMRA-3′, FAM: carboxyfluorescein, TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine) and F22T (5′-FAM-GAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAG-TAMRA-3′)購自生工生物工程(上海)股份有限公司. 若無特殊說明，所有與c-mycDNA相關的實驗均在Tris-KCl緩沖溶液 (10 mmol/L Tris, 100 mmol/L KCl, pH值為7.40±0.02)中進行. 實驗中緩沖溶液采用超純水配制. 其他試劑均為分析純，沒有進一步純化處理.c-mycPu27 DNA和c-mycPu22 DNA固體樣品通過高速離心機離心20 min后，加入定量緩沖液，充分振蕩后，將樣品稀釋到一定濃度，90 ℃水浴5 min，冷卻至室溫，4 ℃過夜保存.

2 結果與討論

2.1 紫外可見吸收光譜

紫外可見吸收光譜是一種用來研究配合物和DNA相互作用的普遍方法. 一般來說，配合物在紫外可見光譜中會表現(xiàn)出對一定波長光的吸收，但在DNA存在時，吸收峰會發(fā)生減色和紅移現(xiàn)象，并且變化強度取決于配合物與DNA的結合力[24].c-mycDNA加入到釕配合物溶液時的紫外光譜變化，如圖2所示. 從圖2中可以看出，配合物在286、468 nm處有2個吸收峰，分別是由配體內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移(IL)和金屬離子到配體的電荷躍遷(MLCT)引起. 當增加c-mycDNA濃度時，配合物的IL吸收譜帶出現(xiàn)顯著的減色和紅移現(xiàn)象，但MLCT譜帶變化不明顯. 圖2a所示為c-mycPu27和配合物作用后的紫外可見吸收光譜圖，當鍵合作用達到平衡時，IL譜帶的減色率為52.3%，紅移了6 nm；圖2b所示為c-mycPu22和配合物作用后的紫外可見吸收光譜圖，當鍵合作用到達平衡后，IL譜帶的減色率為58.6%，紅移了4 nm，說明配合物和c-mycPu27、c-mycPu22之間有強烈的π-π*堆積作用. 配合物與c-mycDNA相互作用的減色率大于文獻中報道的[Ru(bpy)2(p-tFMPIP)]2+(20.1%)[25]、[Ru(phen)2(p-tFMPIP)]2+(28.0%)[25]、[Ru(phen)2(TMSEPIP)]2+(42.3%)[17]、[Ru(phen)2(BEPIP)]2+(45.0%)[17]等，進一步表明配合物與c-mycDNA有較強的結合作用.

a.c-myc Pu27,c(Ru)=10 μmol/L;b.c-myc Pu22,c(Ru)=6.13 μmol/L.圖2 隨著c-myc DNA的增加，釕配合物紫外可見吸收光譜的變化Fig.2 UV-visible spectra changes of ruthenium complex with increasing c-myc DNA

2.2 熒光光譜

熒光光譜可以進一步闡明配合物與DNA之間的相互作用. 一般情況下，當配合物與DNA結合時，由于受到DNA堿基疏水環(huán)境的作用，使配合物的熒光不易被淬滅，從而產(chǎn)生熒光增強的現(xiàn)象. 圖3為c-mycDNA與配合物作用后的熒光光譜圖. 隨著c-mycDNA濃度逐漸增加，釕配合物在550～600 nm 波長內(nèi)的熒光顯著增強，表明配合物與c-mycDNA作用后，受到DNA堿基疏水環(huán)境的保護，避免了配合物熒光的淬滅. 當配合物與c-mycPu27和c-mycPu22達到鍵合飽和時，熒光強度增大為原來的8.69倍和5.63倍，即I/I0分別為8.69和5.63，高于文獻中報道的一些釕配合物，如配合物[Ru(phen)2(mitatp)]2+(I/I0= 2.4)[26]、[Ru(L1)(dppz)2](PF6)4(I/I0= 4.8) {L1= 5,5′-二(1-(三甲基氨基)甲基)-2,2′-聯(lián)吡啶基陽離子}[27]、[Ru(bpy)2(mitatp)]2+(I/I0= 6.5)[26]、[Ru(L2)(dppz)2](PF6)4(I/I0= 7.6) {L2= 5,5′-二(1-(三乙基氨基)甲基)-2,2′-聯(lián)吡啶基陽離子}[27]等，表明配合物有良好的“G-四鏈體DNA分子光開關”的性質(zhì).

通過曲線擬合得到配合物與c-mycG-四鏈體DNA的鍵合常數(shù)分別為Kb= 6.21×107L/mol (c-mycPu27)，Kb= 2.33×106L/mol (c-mycPu22)[28]，大于已經(jīng)報道的[Ru(phen)2(tip)]2+(Kb= 1.43×106L/mol)[29]、[Ru(bpy)2(dhipH3)]2+(Kb= 2.45×106L/mol)[30]、[Ru(bpy)2(p-BEPIP)]2+(Kb= 1.09×107L/mol)[16]，再一次表明配合物與c-mycDNA之間存在較強的鍵合作用.

a.c-myc Pu27,c(Ru)=3.43 μmol/L;b.c-myc Pu22,c(Ru)=2.45 μmol/L.圖3 隨著c-myc DNA的增加，釕配合物熒光光譜的變化(插圖：曲線擬合法求鍵合常數(shù))Fig.3 Emission spectra of ruthenium complex in the presence of increasing amounts of c-myc DNA, (the nonlinear fitting for calculation of binding constant)

2.3 Job plot

配合物與c-mycG-四鏈體DNA鍵合的物質(zhì)的量比可以通過Job plot實驗來確定. 通過熒光強度的變化ΔI對配合物的摩爾分數(shù)X作圖，圖4中所示拐點即為配合物與c-mycDNA的物質(zhì)的量比. 如圖4所示，當配合物的摩爾分數(shù)增大時，熒光強度變化呈先上升再下降的趨勢，圖4中的最高點分別為X=0.64 (c-mycPu27)和X=0.66 (c-mycPu22)，表明配合物與c-mycPu27和c-mycPu22 G-四鏈體的鍵合物質(zhì)的量比都為2∶1，即每一個c-mycG-四鏈體DNA分子可以結合2個配合物. 已報道的配合物也有相

釕配合物與c-myc G-四鏈體DNA總濃度恒定(10 μmol/L).圖4 隨著釕配合物摩爾分數(shù)的增加，配合物熒光強度的變化曲線Fig.4 Job plot constructed from mixing the ruthenium complex and c-myc G-quadruplex DNA together in variable ratios

同的計量比，如[Ru(phen)2dpq-df]2+和[Ru(bpy)2dpq-df]2+[31]與22AG G-四鏈體的鍵合計量比也為2∶1. 而有些配合物的鍵合物質(zhì)的量比則為1∶1，即1個配合物結合1個G-四鏈體DNA分子，如[Ru(bpy)2(dppz)]2+與22AG G-四鏈體[32]、[Ru(bpy)2(p-BEPIP)]2+和[Ru(bpy)2(p-TEPIP)]2+與c-mycPu22 G-四鏈體[16].

2.4 圓二色(CD)光譜

CD光譜是一種研究核酸構像的方法，可以為生物大分子與DNA的相互作用提供一些有用的信息. 當c-mycG-四鏈體DNA與釕配合物作用后，其CD光譜會發(fā)生變化. 圖5為配合物與c-mycG-四鏈體DNA在Tris-KCl緩沖溶液中的CD光譜圖. 圖5a為c-mycPu27與配合物作用后的變化趨勢，可以看出，c-mycPu27在241 nm處出現(xiàn)負峰，在264 nm處出現(xiàn)正峰，逐漸增加配合物的濃度，264 nm處的正峰強度(ICD)出現(xiàn)下降趨勢，強度降低了70.2%，并在300 nm處誘導出新的負峰；圖5b為c-mycPu22與配合物反應后的譜圖，觀察到c-mycPu22在264 nm處的峰強度隨著配合物的增加而逐漸降低，強度降低了70.9%，在295 nm處誘導出現(xiàn)新的負峰. 這些現(xiàn)象與文獻中報道的化合物[Ru(bpy)2(p-BEPIP)]2+和[Ru(bpy)2(p-TEPIP)]2+與c-mycPu22 G-四鏈體鍵合時的現(xiàn)象相同，表明配合物與c-mycPu27和c-mycPu22是溝槽結合[16].

a.c-myc Pu27,c(Ru)=70 μmol/L;b.c-myc Pu22,c(Ru)=60 μmol/L.圖5 隨著釕配合物的增加，c-myc DNA CD光譜的變化曲線 Fig.5 CD spectra changes of c-myc DNA in the presence of increasing amount of ruthenium complex

2.5 PCR (polymerase chain reaction)

通過聚合酶鏈式反應停止分析，可以檢測釕配合物能否誘導DNA形成G-四鏈體結構. 該反應以Taq DNA聚合酶為催化劑，使DNA序列與其互補序列雜交，形成PCR產(chǎn)物. 如果釕配合物可以誘導c-mycDNA形成G-四鏈體結構，則雜交會阻斷，PCR反應終止，且檢測不到PCR產(chǎn)物[16]. 配合物與c-mycPu27和c-mycPu22 DNA反應的PCR結果如圖6所示. 從圖6可以看出，隨著配合物的加入，雜交被抑制，并且配合物濃度越大時，檢測到的PCR產(chǎn)物越少，出現(xiàn)條帶變暗的現(xiàn)象. 當配合物濃度分別達到4 μmol/L G-四鏈(c-mycPu27)、6 μmol/L (c-mycPu22)時，幾乎檢測不到PCR產(chǎn)物，表明配合物可以誘導c-mycDNA形成G-四鏈體結構. 在報道的文獻中，許多配合物完全抑制PCR擴增產(chǎn)物的濃度略大，如[(η6-HC6H5)Ru(m-MOPIP)Cl]+[33]、[(η6-CH3C6H5)Ru(m-MOPIP)Cl]+[33]、Λ-[Ru(bpy)2(H2iip)]2+[24]的抑制PCR擴增產(chǎn)物的濃度分別為12、9、8 μmol/L，進一步說明了配合物是有效的G-四鏈體誘導劑.

a.c-myc Pu27;b.c-myc Pu22.圖6 釕配合物對c-myc DNA作用的PCR擴增Fig.6 Effect of ruthenium complex on the hybridization of c-myc Pu27 and c-myc Pu22 DNA in PCR-stop assay

2.6 顯色反應

為了進一步證明配合物能否誘導c-mycDNA形成G-四鏈體結構，筆者采用了一種肉眼可見的視覺方法. 因為K+或者配合物可以促使G-四鏈體有效形成，并且G-四鏈體可與氯化血紅素結合形成一種過氧化物脫氧核酶[11]；在這種酶的存在下，過氧化氫介導的TMB (3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺)的氧化過程急劇加速，形成肉眼可見的藍色，而且顏色變化非常敏感，易于鑒定，所以用這種視覺方法來鑒別G-四鏈體的形成. 圖7是配合物的顯色反應結果，從圖7中可以看到，對照組和加入了ct-DNA的釕配合物溶液顏色沒有變化，但加入K+和釕配合物的c-mycDNA溶液從無色變?yōu)樗{色. 此結果表明，配合物和K+都能誘導c-mycPu27和c-mycPu22形成G-四鏈體結構，而不能誘導雙鏈DNA形成G-四鏈體結構.

a. c-myc Pu27;b.c-myc Pu22.c(K+)=500 nmol/L,c(Ru)=500 nmol/L.圖7 在TMB-H2O2體系中，加入配合物或K+后c-myc DNA的酶功能表征Fig.7 Characterizations of the DNAzyme functions of c-myc DNA and ct-DNA in the presence of K+ and ruthenium complex in the TMB-H2O2 system.

2.7 FRET (Fluorescence resonance energy transfer)

通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移熔煉法可以測定配合物對c-mycG-四鏈體DNA的穩(wěn)定作用. 圖8為F27T和F22T的熔解曲線. 在Tris-KCl (10 mmol/L Tris, 60 mmol/L KCl, pH = 7.40 ± 0.02)溶液中，F(xiàn)27T的

圖8 釕配合物與F27T(a)和F22T(b)作用的FRET熔解曲線Fig.8 Normalized FRET melting curves of F27T(a) and F22T(b) with increasing concentrations of ruthenium complex

圖9 釕配合物對F27T(a)、F22T(b)的FRET競爭曲線Fig.9 Competition FRET melting curves of F27T(a) and F22T(b) with increasing concentrations of duplex ct-DNA

3 結論

本文合成并表征了一個含有苯酚基的雙核釕配合物. 通過紫外可見吸收光譜、熒光光譜、Job plot和圓二色光譜研究表明，配合物與c-mycPu27和c-mycPu22 DNA均有較強的鍵合力，鍵合常數(shù)為6.21×107L/mol (c-mycPu27)和2.33×106L/mol (c-mycPu22)，鍵和模式為溝槽結合，鍵合物質(zhì)的量比也都為2∶1，并且配合物與c-mycPu27和c-mycPu22 DNA相互作用后，熒光強度增強為原來的8.69倍和5.63倍，表現(xiàn)出良好的“分子光開關”性質(zhì).PCR實驗和顯色反應表明，配合物可以將c-mycPu27和c-mycPu22誘導形成G-四鏈體結構. FRET及其競爭實驗表明，配合物對c-mycPu27和c-mycPu22都有較強的穩(wěn)定作用，并且在雙鏈DNA存在條件下都能選擇性結合c-mycPu27和c-mycPu22 G-四鏈體.