李依，陸旭，郭萌，盧嬌，王俊麗

(中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

藏橐吾Ligulariarumicifolia(Drumm.) S.W.Liu是菊科橐吾屬多年生草本植物，分布于中國(guó)西藏東南部至東北部，生于海拔3 700～4 500 m的湖邊、林下、灌叢及山坡[1].

藏橐吾具有很高的藥用價(jià)值.《西藏常用中草藥》中記載：藏橐吾，藏名日肖，以根部入藥，味苦，性溫.9～10月份采挖，去除莖葉后洗凈曬干，煎湯內(nèi)服，可散寒、潤(rùn)肺下氣、化痰止咳、利尿[2].藏藥大典《晶珠本草》記載：日肖功效為吐培根，赤巴合并病，化性涼，愈瘡，清解難以發(fā)散的舊疫熱[3].《中國(guó)中藥資源志要》記載：藏橐吾可用于治療風(fēng)寒咳嗽、支氣管炎、肺結(jié)核咳血、咽喉炎[4].

藏橐吾作為一種重要的藥用資源植物，由于其分布范圍窄、生長(zhǎng)海拔高，人工引種、馴化困難，加之入藥部位僅限于根和根莖，生物量有限，傳統(tǒng)的采挖方式使得這一資源更加緊缺.利用離體培養(yǎng)的方法對(duì)藥用植物進(jìn)行快速繁殖是擴(kuò)大藥用植物資源、促進(jìn)資源合理開發(fā)利用的重要途徑，目前已有很多種植物建立了離體培養(yǎng)方法.例如，奇異南星[5]、華北八寶[6]、華北藍(lán)盆花[7]、新疆雪蓮[8]、Harpagophytumprocumbens[9]、Violauliginosa[10]等，而有關(guān)藏橐吾組織培養(yǎng)方面的研究鮮見報(bào)道.

1 材料與方法

1.1 植物材料

藏橐吾的種子采自西藏米林縣南伊溝海拔3 104 m的林下, 將種子去除冠毛后放于4 ℃冰箱保存.

1.2 培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為30 g/L的蔗糖和7 g/L的瓊脂，pH值調(diào)為5.8，經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min.培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d.

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

將消毒后的種子接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)30 d獲得無(wú)菌苗.將無(wú)菌苗子葉切成約0.5 cm×0.5 cm的切塊，接種在添加了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng).每瓶接種5個(gè)外植體，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次.

1.4 不定芽的誘導(dǎo)

分別選取愈傷組織和子葉為外植體，接種在含有不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng).每瓶接種5個(gè)外植體，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次.

1.5 生根培養(yǎng)及移栽

選取3 cm左右的不定芽接入生根培養(yǎng)基中，每個(gè)處理取30個(gè)不定芽，重復(fù)3次，30 d后觀察統(tǒng)計(jì)生根情況.

1.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

通過(guò)SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 TDZ與NAA組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

將子葉接種在MS+TDZ(1.0、2.0、3.0)mg/L+NAA(0.5、1.0、2.0、4.0)mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果如表1所示.由表1可知，較低質(zhì)量濃度的TDZ有利于誘導(dǎo)子葉產(chǎn)生愈傷組織.當(dāng)添加的TDZ質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率最高；TDZ質(zhì)量濃度升高到3.0 mg/L時(shí)，不能誘導(dǎo)子葉產(chǎn)生愈傷組織.在MS+TDZ 1.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率為45.33%.因此，誘導(dǎo)子葉產(chǎn)生愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L.

表1 不同質(zhì)量濃度的TDZ與NAA組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 TDZ與NAA組合對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效應(yīng)

將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種到MS+TDZ(1.0、2.0、3.0、4.0)mg/L + NAA(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0)mg/L培養(yǎng)基中，20 d左右出現(xiàn)深綠色的芽點(diǎn).由表2可知，NAA質(zhì)量濃度較低時(shí)，有利于不定芽的誘導(dǎo).較適宜的培養(yǎng)基為MS+TDZ 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率為49.42%.

表2 不同質(zhì)量濃度的TDZ與NAA組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

2.3 6-BA與NAA組合對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效應(yīng)

將愈傷組織接種到MS+6-BA(1.0、2.0、3.0、4.0)mg/L+NAA(0.1、0.5、1.0、2.0)mg/L培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 d時(shí)部分愈傷組織褐化，20 d出現(xiàn)深綠色的芽點(diǎn).培養(yǎng)30 d后，將愈傷組織取出，輕輕刮去褐化的部分，接種到同種新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng).更換培養(yǎng)基10 d后，開始生成不定芽.6-BA與NAA組合對(duì)不定芽的誘導(dǎo)情況如表3所示.從表3可以看出，不定芽的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0+NAA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率為69.56%，每塊愈傷組織可分化出3個(gè)左右的綠色不定芽.

表3 不同質(zhì)量濃度的6-BA與NAA組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

2.4 6-BA與2,4-D組合對(duì)子葉分化不定芽的誘導(dǎo)效應(yīng)

6-BA與2,4-D組合可直接誘導(dǎo)子葉產(chǎn)生不定芽.由表4可知，在MS+6-BA 2.0 mg/L+2,4-D 4.0 mg/L培養(yǎng)基中不定芽的誘導(dǎo)率達(dá)到最高值，為55.18%.

2.5 6-BA與NAA組合對(duì)子葉分化不定芽的誘導(dǎo)效應(yīng)

將子葉接種在MS+6-BA(1.0、2.0、3.0、4.0)mg/L+ NAA(0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0)mg/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 d左右，在子葉切口處誘導(dǎo)出大量球狀凸起，培養(yǎng)至40 d，凸起發(fā)育成不定芽.不定芽的誘導(dǎo)情況如表5所示.6-BA質(zhì)量濃度為4.0 mg/L時(shí)，20 d左右外植體在培養(yǎng)基上褐化死亡，不能誘導(dǎo)不定芽生成.誘導(dǎo)不定芽分化的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+ NAA 0.8 mg/L，誘導(dǎo)率可達(dá)到72.33%.

表4 不同質(zhì)量濃度的6-BA與2,4-D組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

表5 不同質(zhì)量濃度的6-BA與NAA組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

2.6 生根培養(yǎng)

將不定芽接種到1/2 MS+IAA(0.5、1.0、2.0)mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d，不定芽基部長(zhǎng)出2～3條淡黃色不定根，根長(zhǎng)3～5 cm.藏橐吾不定芽適宜生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IAA 0.5 mg/L，生根率為70.00%(表6).

表6 不同質(zhì)量濃度的IAA對(duì)不定根誘導(dǎo)的影響

2.7 煉苗及移栽

將錐形瓶封口膜打開，在無(wú)菌室內(nèi)煉苗1周.選取葉片較大、葉柄粗壯、長(zhǎng)勢(shì)良好的再生苗，小心洗去根部的培養(yǎng)基，移栽至泥炭土、珍珠巖和沙的質(zhì)量比為4∶3∶2的混合基質(zhì)中，置于相對(duì)濕度為80%～90%、溫度為20 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)30 d，成活率為100%.

3 討論

目前已有橐吾屬不同植物組織培養(yǎng)方面的相關(guān)報(bào)道，并且植物種類不同，在誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽的過(guò)程中對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的需求各不相同.杜娟等[11]研究發(fā)現(xiàn)，蹄葉橐吾(Ligulariafischeri)葉片外植體誘導(dǎo)愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5～2.0 mg/L，培養(yǎng)3周后產(chǎn)生少量的愈傷組織.以蹄葉橐吾嫩莖為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，MS+6-BA 0.3 mg/L+2,4-D 1.5 mg/L是較適宜的培養(yǎng)基，MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L是其不定芽分化培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基[12].單花橐吾(Ligulariajamesii)愈傷組織誘導(dǎo)的適宜外植體是葉柄，適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方是MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基可誘導(dǎo)出大量不定芽[13].

本研究發(fā)現(xiàn)，藏橐吾子葉外植體在含有TDZ(1.0～2.0 mg/L)和NAA1.0 mg/L的培養(yǎng)中，可誘導(dǎo)出綠色愈傷組織，并且誘導(dǎo)率在40%以上.MS培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L的6-BA和0.5 mg/L NAA有利于愈傷組織產(chǎn)生不定芽，而MS+TDZ 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L也可誘導(dǎo)愈傷組織分化不定芽，但誘導(dǎo)率不及6-BA和NAA組合.

在植物離體培養(yǎng)過(guò)程中，外植體經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)先產(chǎn)生愈傷組織，再由愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽，這是一種常見的再生途徑.此外，外植體還可不經(jīng)過(guò)愈傷組織化而直接分化產(chǎn)生不定芽.在全緣橐吾(Ligulariamongolica)莖尖培養(yǎng)過(guò)程中，莖尖基部可以直接分化出不定芽，啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，不定芽增殖的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L[14].大頭橐吾的無(wú)菌苗去除胚根后接種到MS+6-BA 1.0 mg/L培養(yǎng)基上，基部可直接形成叢生芽[15].

本研究發(fā)現(xiàn)，6-BA與2,4-D組合可以誘導(dǎo)子葉直接分化產(chǎn)生不定芽，當(dāng)MS培養(yǎng)基中6-BA質(zhì)量濃度為2.0 mg/L、2,4-D為4.0 mg/L時(shí)，子葉不定芽的誘導(dǎo)率最高(55.18%).6-BA與NAA組合也可誘導(dǎo)子葉直接分化出不定芽，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為3.0 mg/L、 NAA為0.8 mg/L時(shí)，子葉不定芽分化率可達(dá)到72.33%.同6-BA與2,4-D組合相比，6-BA與NAA組合可誘導(dǎo)產(chǎn)生更多不定芽.