閆桂溪，杜金城，杜鋼軍*

1.河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，長沙410208

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)［1］認(rèn)為，癌癥屬于“積聚”“癥瘕”等范疇。中藥在抗癌治療方面有標(biāo)本兼治、整體性、多靶點(diǎn)、多途徑等優(yōu)勢［2］，可縮小或穩(wěn)定瘤體、緩解臨床癥狀、降低毒副作用，實(shí)現(xiàn)帶瘤生存，對臨床治療具有重要意義。中藥成分的復(fù)雜性使其具有復(fù)雜的作用機(jī)制，為中藥的深入研究帶來了困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法能建立成分之間復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)與多重靶點(diǎn)，基于靶點(diǎn)的蛋白與基因相互作用的探究為中藥藥理作用與機(jī)制研究提供了新思路。

狼毒是大戟科植物月腺大戟（Euphorbia ebracteolata Hayata）或狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud）的干燥根［3］，其味苦辛、性平、有毒、入肺、脾、肝經(jīng)，具有祛痰逐水、拔毒、祛腐、止癢等功效，臨床用于治療水腫腹脹，心腹疼痛等病癥［4-5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，狼毒提取物對腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)抑制活性，并具有抗菌、抗炎、抗病毒作用，是一個潛在的天然藥物開發(fā)藥源。實(shí)驗(yàn)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對狼毒可能的抗腫瘤成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，并對其抗腫瘤作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究其抗腫瘤成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材

狼毒購自開封市天濟(jì)堂藥店，經(jīng)河南大學(xué)生藥教研室鑒定為大戟科植物狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud）干燥根。狼毒水提物制備：稱取狼毒干燥根40 g，加20 倍（800 mL）蒸餾水浸泡1 h，煎煮30 min，取水煎液。重復(fù)上述過程，共煎煮3 次。合并3 次濾液加熱濃縮至200 mL（1 mL 相當(dāng)于0.2 g原藥材），分裝凍存于-80 ℃冰箱，給藥前用蒸餾水稀釋至需要濃度，按小鼠體質(zhì)量4 g／kg 灌胃給藥。

1.2 試劑

二甲苯（天津市富晨化學(xué)試劑廠，批號：20150812），伊文思藍(lán)（上海沃凱化學(xué)試劑有限公司，批號：20110325）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞

昆明小鼠，雄性，SPF 級，體質(zhì)量＞20 g，采購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心。H22 肝癌細(xì)胞，購自中科院細(xì)胞庫，本實(shí)驗(yàn)室液氮凍存，小鼠腹腔接種傳代。

1.4 儀器

FA1004B 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；EM-KC150 數(shù)顯游標(biāo)卡尺（河?xùn)|區(qū)星光扳鉗工具廠）；JD-2 系列多功能電子天平（沈陽固而特商貿(mào)有限公司）；LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）；微量移液器（上海佳安分析儀器廠）；TDL-508 臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BCD-539WT 低溫冰箱（海爾集團(tuán)）；超凈工作臺（上海博迅實(shí)業(yè)公司）；WH-866渦旋振蕩器（太倉市科教器材廠）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)藥器械廠）；MultiskanTMFC 酶標(biāo)儀（ThermoFisher）；YLS-1A 多功能小鼠自主活動記錄儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）。

1.5 分析平臺與軟件

①中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP（http：／ ／ Isp.nwu.edu.cn／ tcmsp.php）；②UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.uniprot.org／）；③PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／ ）；④Swiss Target Prediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／）；⑤STITCH（http：／ ／stitch.embl.de／）；⑥TTD 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／db.idrblab.org／ttd／）；⑦蛋白質(zhì)相互作用分析平臺STRING（https：／ ／string-db.org／）；⑧人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫DAVID v6.8（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）；⑨Omicshare 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／ www.omicshare.com／）；⑩網(wǎng)絡(luò)圖形拓?fù)浞治雠c編輯軟件Cytoscape。

2 方法

2.1 狼毒有效成分篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺［7］（TCMSP，http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）中輸入狼毒活性成分名稱，查找相關(guān)信息。據(jù)化合物藥動學(xué)參數(shù)：類藥性（DL）≥0.18，口服生物利用度（OB）≥30%，類藥五原則的標(biāo)準(zhǔn)篩選出6 個活性成分。通過Pub-Chem 數(shù)據(jù)庫［8］（https：／ ／Pubchem.Ncbi.nlm.nih.gov）查找并導(dǎo)出6 個活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)（*.SMILES），保存為mol2 格式。

2.2 狼毒活性成分作用靶點(diǎn)的預(yù)測

將相關(guān)化學(xué)成分的mol2 格式結(jié)構(gòu)文件上傳至Swiss Target Prediction［9］（www.swisstargetprediction.cn／）和STITCH［10］（stitch.embl.de）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，2個預(yù)測得到的靶點(diǎn)與TCMSP 中的靶點(diǎn)作為全部備選靶點(diǎn)。采用UniProt 數(shù)據(jù)庫［11］（http：／ ／www.uniprot.org／）將備選靶點(diǎn)名稱規(guī)范化為官方名（Official Symbol）和Uniprot ID。

2.3 活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 3.2.1 軟件［12］構(gòu)建成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)中，靶點(diǎn)和成分以節(jié)點(diǎn)（node）表示，靶點(diǎn)和成分之間的聯(lián)系以邊（edge）表示。

2.4 癌癥治療靶點(diǎn)與抗炎相關(guān)靶點(diǎn)搜集

通過Therapeutic Target Database 數(shù)據(jù)庫［13］（TTD，https：／ ／db.idrblab.org／ttd／），以“l(fā)iver cancer”“cancer”“inflammation”為關(guān)鍵詞收集與癌癥和炎癥相關(guān)治療靶點(diǎn)，通過與預(yù)測靶點(diǎn)對比篩選出狼毒腫瘤治療靶點(diǎn)和抗炎相關(guān)靶點(diǎn)。

2.5 GO 注釋分析與KEGG 通路分析

使用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫［14］（DAVID，https：／ ／david.ncifcrf.gov／）對狼毒腫瘤治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，并用FDR 錯誤控制法對P值作檢驗(yàn)校正，最終設(shè)定閾值P＜0.05，篩選出與狼毒抗腫瘤作用相關(guān)的生物過程和信號通路，進(jìn)一步通過Omicshare 在線將GO 和KEGG 富集分析結(jié)果可視化，篩選出抗腫瘤相關(guān)通路較多的化合物。采用基因富集分析數(shù)據(jù)庫［15］（Enrichr，http：／ ／amp.pharm.mssm.edu／Enrichr／enrich）對狼毒抗炎作用相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，并用FDR 錯誤控制法（FDR＜0.05）對P值作檢驗(yàn)校正，最終設(shè)定閾值P＜0.05，篩選出與狼毒抗炎作用相關(guān)的生物過程和信號通路，并選擇前10 個通路進(jìn)行可視化。

2.6 小鼠H22 皮下腫瘤模型的建立及分組給藥

選擇腹腔接種7～9 d 的H22 小鼠，處死后于無菌條件下抽取乳白色腹水［16］。離心，棄去上清液，收集沉淀細(xì)胞，用無菌生理鹽水稀釋成1 × 107個／mL 細(xì)胞懸液，無菌環(huán)境下每只小鼠右肢腋部皮下接種瘤液0.2 mL。接種小鼠隨機(jī)分為2 組：模型組和狼毒組，每組10 只。腫瘤接種次日，狼毒組按小鼠體質(zhì)量4 g／kg 灌胃狼毒水煎液，1 次／d。

每周測定小鼠體質(zhì)量和自主活動2 次。待腫瘤手觸長出后開始用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑和寬徑，2 次／周。待對照組腫瘤平均直徑＞25 mm 時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，處死小鼠，剝離腫瘤稱重。計(jì)算腫瘤體積及腫瘤抑制率［17］。腫瘤體積（mm3）＝（腫瘤長徑×腫瘤寬徑2）／2；腫瘤抑制率＝（模型組腫瘤體積-狼毒給藥組腫瘤體積）／模型組腫瘤體積×100%。

2.7 二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹

實(shí)驗(yàn)終止當(dāng)日，小鼠給藥后30 min，于各組小鼠右耳正反面均勻涂上二甲苯40 μL 致炎［18］。涂上二甲苯后30 min，處死小鼠，剪下同只小鼠左右耳用打孔器在同一部位打下耳片，分析天平稱重，以兩耳片重差值為耳腫脹度，并計(jì)算腫脹抑制率。腫脹抑制率＝［（模型組耳平均腫脹度-狼毒組耳平均腫脹度）／模型組耳平均腫脹度］×100%。

2.8 瘤組織毛細(xì)血管滲透性

實(shí)驗(yàn)終止當(dāng)日，小鼠給藥1 h，各組小鼠尾靜脈0.2 mL／10 g 注射體積分?jǐn)?shù)1%的伊文思藍(lán)染液30 min后處死，剖取皮下瘤組織0.5 g 剪碎，置于體積分?jǐn)?shù)為70%的丙酮水溶液中浸泡2 d，搖晃2 次／d，離心取上清，酶標(biāo)儀630 nm 測吸光度［19］。

2.9 荷瘤小鼠凝血功能檢測

實(shí)驗(yàn)終止當(dāng)日，各組小鼠斷尾5 mm，記錄凝血時(shí)間。處死時(shí)毛細(xì)管沿眼眶靜脈叢取血，毛細(xì)管法測小鼠凝血時(shí)間［20］。

2.10 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 狼毒有效成分篩選

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選得到6 個可被吸收有效成分，AlogP、Hdon 及Hacc，見表1。

表1 狼毒中可吸收活性成分及其參數(shù)

3.2 狼毒活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過Swiss Target Prediction、STITCH 預(yù)測活性成分靶點(diǎn)與TCMSP 中記載的靶點(diǎn)共得到預(yù)測靶點(diǎn)109 個。將預(yù)測靶點(diǎn)與活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件中共有節(jié)點(diǎn)115 個（6 個活性成分節(jié)點(diǎn)與109 個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)），邊180 條，見圖1。

圖1 狼毒活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)圖

3.3 癌癥治療靶點(diǎn)與抗炎相關(guān)靶點(diǎn)搜集

根據(jù)Therapeutic Target Database（TTD）搜索與癌癥和炎癥相關(guān)治療靶點(diǎn)與預(yù)測靶點(diǎn)對比，分別得到26 個和11 個相同的基因，見表2、表3。狼毒中6個活性成分分別對應(yīng)26 個癌癥相關(guān)治療靶點(diǎn)，見圖2。分別對應(yīng)11 個炎癥相關(guān)治療靶點(diǎn)，見圖3。

表2 腫瘤治療相關(guān)作用靶點(diǎn)

表3 炎癥相關(guān)作用靶點(diǎn)

3.4 GO 注釋分析與KEGG 通路分析

對狼毒26 個腫瘤治療基因和11 個抗炎相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析。GO 分析結(jié)果顯示，26 個癌癥治療靶點(diǎn)參與84 個生物過程（P＜0.05），其中22 個（P＜0.05，count≥4）與癌癥生物過程相關(guān)：生物通路主要有“細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子濃度調(diào)節(jié)”“磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路”“無配體的情況下外源性凋亡信號傳導(dǎo)途徑”“藥物反應(yīng)”“細(xì)胞增殖”等。KEGG 分析結(jié)果表明，癌癥治療靶點(diǎn)參與44 個信號通路（P＜0.05），其中24 個（P＜0.05，count ≥4）與癌癥信號傳導(dǎo)相關(guān)：KEGG 主要通路有“癌癥途徑”“乙型肝炎”“Rap1 信號通路”“HIF-1 信號通路”等。11 個抗炎相關(guān)靶點(diǎn)富集分析顯示其參與147 個生物過程（P＜0.05），前10 個過程可視化圖，見圖4。生物通路主要有“突觸傳遞”“γ-氨基丁酸信號通路”“突觸后膜電位的調(diào)節(jié)”“氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”“一氧化氮生物合成過程調(diào)節(jié)”“活性氧生物合成過程調(diào)節(jié)”等；KEGG 分析結(jié)果表明，其參與26 個信號通路（P＜0.05），前10 個信號通路可視化圖，見圖5。KEGG 主要通路有“NF-κB 信號通路”“雌激素信號通路”“NOD 樣受體信號通路”“花生四烯酸代謝通路”等。

圖2 狼毒活性成分-抗腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)圖

圖3 狼毒活性成分-抗炎相關(guān)靶點(diǎn)圖

圖4 狼毒炎癥相關(guān)GO 注釋分析

圖5 狼毒炎癥相關(guān)KEGG 通路分析

3.5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

將狼毒活性成分、抗腫瘤作用靶點(diǎn)及其相對應(yīng)信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件中共有節(jié)點(diǎn)70個，邊178 條，見圖6。直觀地呈現(xiàn)了6 個活性成分、26 個靶基因、44 個信號通路間的關(guān)聯(lián)。從圖中可以看出狼毒抗腫瘤的主要活性組分是胡蘿卜苷（Daucosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、β-谷甾醇（Beta-Sitosterol），其成分-靶點(diǎn)-通路圖，見圖7。

圖6 狼毒活性成分-抗腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)-信號通路圖

圖7 狼毒主要活性成分-抗腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)-信號通路圖

3.6 狼毒的抗腫瘤作用

小鼠接種H22 瘤株后，第5 天長出手觸可感覺的腫瘤，之后小鼠因腫瘤增長快，體質(zhì)量迅速增加，自主活動降低。與模型組比較，狼毒組腫瘤和體質(zhì)量增長均較慢，自主活動降低不明顯，腫瘤抑制率為32.23%（P＜0.05），見表4。小鼠耳腫脹結(jié)果顯示，模型小鼠平均耳腫脹度為0.021±0.007，狼毒組平均耳腫脹度為0.013±0.003，腫脹抑制率為39.19%（P＜0.05），見表5。瘤組織血管通透性檢測表明，狼毒組的瘤組織伊文思藍(lán)滲透性低于模型組（P＜0.05），見表5。荷瘤小鼠小鼠凝血功能檢測表明，狼毒組斷尾和毛細(xì)管凝血時(shí)間均長于模型組（P＜0.05），見表6。

表4 對小鼠H22 皮下腫瘤生長的影響（）

表4 對小鼠H22 皮下腫瘤生長的影響（）

與模型組比較，*P＜0.05

表5 對荷瘤小鼠耳腫脹和瘤組織血管通透性的影響（）

表5 對荷瘤小鼠耳腫脹和瘤組織血管通透性的影響（）

與模型組比較，*P＜0.05

表6 對荷瘤小鼠凝血功能的影響（）

表6 對荷瘤小鼠凝血功能的影響（）

與模型組比較，*P＜0.05

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過系統(tǒng)方法分析藥物對生物網(wǎng)絡(luò)的作用和影響，從整體角度認(rèn)識和預(yù)測藥物靶點(diǎn)的方法，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩出狼毒6 種活性成分，主要通過NR3C1、ESR1、CASP8、BCL2、CASP3、AR、PIK3CG、STAT3 等靶點(diǎn)，參與“HIF-1 信號通路”“PI3K-Akt 信號傳導(dǎo)”“Rap1”等信號通路。HIF-1 信號通路是機(jī)體為了應(yīng)對缺氧脅迫形成的復(fù)雜反應(yīng)機(jī)制，參與VEGF 的表達(dá)以及腫瘤的生長［21-22］。HIF-1α 能被Hsp90、PI3K-Akt 激活，從而促進(jìn)Cox-2 和BNIP3 等因子的表達(dá)。PI3K-Akt 信號通路可通過抗細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲性轉(zhuǎn)移，增加化療耐藥性等方面促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［23］。Rap1 信號通路可促進(jìn)細(xì)胞增殖，它參與整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附過程，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、黏附與侵襲［24］。狼毒活性成分可與上述信號通路中多個重要靶點(diǎn)發(fā)生作用，可能是狼毒抗腫瘤的主要機(jī)制，其中通路主要活性成分是胡蘿卜苷、豆甾醇、β-谷甾醇。

狼毒中的β-谷甾醇、豆甾醇等活性成分通過GABR、PTGS、ESR、HSP90、NR3C1 靶點(diǎn)參與“NOD樣受體信號通路”“NF-κB”等信號通路。NF-κB 信號通路與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化等生理病理過程密切相關(guān)［25-26］。有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷NF-κB 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可減輕炎性損傷，而NOD 樣受體家族的成員NOD1 可促進(jìn)NF-κB激活，參與炎性損傷。狼毒活性成分也可與上述信號通路中多個重要靶點(diǎn)發(fā)生作用，這可能是狼毒抗炎、改善荷瘤小鼠生存質(zhì)量的主要機(jī)制。

動物腫瘤模型是篩選和評價(jià)抗腫瘤藥物的有效手段，常用的動物腫瘤模型有自發(fā)性腫瘤模型、誘發(fā)性腫瘤模型和移植性腫瘤模型，其中移植性腫瘤模型有實(shí)驗(yàn)周期短、腫瘤發(fā)病時(shí)間一致、腫瘤大小均勻等優(yōu)點(diǎn)，是最常用于篩選和評價(jià)抗腫瘤的藥物。本研究采用小鼠H22 腫瘤模型觀察狼毒水煎液對腫瘤生長的影響，其腫瘤抑制率為32.23%，達(dá)到了抗腫瘤中藥活性篩選標(biāo)準(zhǔn)，證實(shí)了其確切的抗腫瘤作用。因?yàn)檠装Y和腫瘤發(fā)展密不可分，本研究也在荷瘤小鼠體內(nèi)觀察了狼毒水煎液對耳腫脹的影響，發(fā)現(xiàn)其對荷瘤小鼠也有明顯抗炎作用，與常規(guī)腫瘤化療藥物通常引起損傷性炎癥明顯不同。另外，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，狼毒也能降低腫瘤組織血管通透性和改善小鼠凝血，提示狼毒多途徑抗腫瘤、抗炎改善小鼠生活質(zhì)量。近年報(bào)道［27-28］狼毒提取物在抗白血病、抗病毒、抗菌、止痛及改善免疫功能方面也具有良好的效果。楊柯等［29］發(fā)現(xiàn)，狼毒大戟可將腫瘤細(xì)胞阻滯在G0／G1期，在促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮了作用，證實(shí)了我們的預(yù)測結(jié)果。

綜上所述，狼毒的抗腫瘤活性成分可能是胡蘿卜苷、豆甾醇、β-谷甾醇，其抗腫瘤作用與阻止“HIF-1 信號通路”“PI3K-Akt 信號傳導(dǎo)”“Rap1 信號通路”“NF-κB”等信號通路減輕荷瘤小鼠炎癥，改善腫瘤組織血管通透性及小鼠凝血功能有關(guān)，為進(jìn)一步研究其抗腫瘤組分和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。