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        響應(yīng)面法優(yōu)化微波萃取血紅鉚釘菇多糖及抗氧化活性研究

        2021-02-23 11:51:54劉中正宋見喜姜貴全

        吳 也,劉中正,宋見喜,姜貴全

        (北華大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 吉林 132013)

        血紅鉚釘菇(Chroogomphidius viscidus)是鉚釘菇科,紅鉚釘菇屬,學(xué)名為紅蘑,俗稱松樹釘、松樹傘等.血紅鉚釘菇,初期鐘形或近圓錐形,后平展,中部凸起,淺咖啡色,菌肉帶紅色,干后淡紫紅色,近菌柄基部帶黃色[1].血紅鉚釘菇的生長條件比較苛刻,生長在海拔 500~700 m米的陰坡中,到了夏秋季節(jié),可在松林地上往往可見到單生或者群生的血紅鉚釘菇[2].在我國,血紅鉚釘菇主要生長于東北及河北北部地區(qū),是東北一種珍貴的野生食用菌.其不僅口感豐富、香氣迷人,也被稱為“食用菌之王”,珍貴程度不亞于松茸和蟲草,在西方更把它視為珍品[3].血紅鉚釘菇不僅味道鮮美,而且有很高的營養(yǎng)價(jià)值[4].研究發(fā)現(xiàn),血紅鉚釘菇具有良好抗病毒和抗氧化能力,并且也有一定的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用,其中最具有研究潛力的一類化學(xué)成分是多糖[5].多糖類化合物廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中,主要由醛基和酮基通過苷鍵連接的高分子聚合物,是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一[6].

        目前,關(guān)于血紅鉚釘菇多糖的提取方法主要有水提醇沉法、酶提取法、超聲波提取、微波萃取等[7].微波萃取技術(shù)可有效地保護(hù)血紅鉚釘菇多糖中的有效成分,具有高速、高產(chǎn)率、高選擇、低能耗、少溶劑等特點(diǎn)[8].響應(yīng)面法是一個(gè)集試驗(yàn)設(shè)計(jì)、模型建立、因素影響評(píng)估、確定最佳工藝條件為一體的統(tǒng)計(jì)技術(shù)[9],然而,它作為一種工具來研究和優(yōu)化微波萃取血紅鉚釘菇的提取條件還鮮有報(bào)道.

        本文以微波萃取過程中影響多糖得率的幾個(gè)因素進(jìn)行研究,運(yùn)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化血紅鉚釘菇的微波萃取條件.通過 Box-Beknhen 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),從而得出血紅鉚釘菇多糖微波萃取的最佳工藝條件,得到的多糖經(jīng)除蛋白后,研究其抗氧化活性,為血紅鉚釘菇多糖的開發(fā)及綜合利用提供一定理論依據(jù).

        1 儀器與材料

        1.1 試藥與試劑

        血紅鉚釘菇產(chǎn)自吉林通化.

        95%乙醇(分析純)天津市大茂化學(xué)試劑廠;苯酚(分析純)天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;葡萄糖(分析純)上海源葉生物科技有限公司;石油醚(分析純)天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;濃硫酸(分析純)天津市大茂化學(xué)試劑廠;DPPH試劑(分析純)上海展華化學(xué)有限公司.

        1.2 儀器與設(shè)備

        FA2004N電子天平,上海菁海儀器設(shè)備制作有限公司; GZX-9146電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;HH-8電熱恒溫水浴鍋,江蘇億通電子有限公司;CARY-5000紫外分光光度計(jì),美國瓦里安公司;MARS6微波萃取儀,美國CEM公司;DZF-6090電熱真空干燥箱,上海一恒科技有限公司;M32648九十六孔板,北京格瑞有限公司;DNM-9602A酶標(biāo)儀,北京普朗有限公司.

        2 方 法

        2.1 血紅鉚釘菇多糖的提取

        參考侯秀娟等[10]方法:血紅鉚釘菇→烘干→粉碎過篩(40 目)→石油醚脫脂→加水?dāng)噭颉⒉ㄝ腿 ^濾→濃縮→Sevage法去蛋白[11-12]→醇沉→冷凍干燥→血紅鉚釘菇多糖.

        2.2 血紅鉚釘菇多糖含量的測定

        參考張媛媛等[13-14]苯酚-硫酸法,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并測定樣品多糖含量.

        2.2.1 苯酚溶液的配制

        精確稱取苯酚晶體5 g加入至100 mL容量瓶中,蒸餾水定容,配置成5%的苯酚溶液,充分搖勻后轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中備用.

        2.2.2 葡萄糖對(duì)照樣品溶液配制

        精確稱量葡萄糖對(duì)照樣品101.00 mg,置于100 ml容量瓶中,加蒸餾水溶解并定容至刻度,充分震蕩.再從容量瓶中移去10 mL置于100 mL容量瓶中,定容,搖勻備用.

        2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        精確吸取葡萄糖對(duì)照樣品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.22 mL分別置于252mL比色皿中分別加水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL至2 mL,然后分別加入苯酚溶液1.6 mL搖勻震蕩,迅速加入濃硫酸7.0 mL,搖勻.顯色40 min;另以蒸餾水代替葡萄糖對(duì)照樣品溶液,同上操作,作為空白.

        用紫外分光光度計(jì)在4 902 nm波長處分別測定其吸光度.求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.017 218x-0.022 239,R2=0.999 25,線性范圍為0.01~0.05 mg/mL.

        葡萄糖質(zhì)量濃度(mg·mL-1)圖1 苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.2.4 血紅鉚釘菇多糖含量的測定

        多糖含量測定采用苯酚硫酸法[13-14],血紅鉚釘菇多糖的產(chǎn)率按照以下公式得到

        C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定得出的多糖質(zhì)量濃度,mg/mL;V為血紅鉚釘菇多糖提取液的體積,mL;N為稀釋因數(shù);W為血紅鉚釘菇粉末的質(zhì)量,g.

        2.3 單因素試驗(yàn)

        2.3.1 液料比對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

        2.3.2 微波功率對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

        2.3.3 微波溫度對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

        2.3.4 微波時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

        2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

        在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取微波時(shí)間(A)、微波溫度(B)、液料比(C)和微波功率(D)為因素,每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn).根據(jù)Design-Expert(8.0.6)軟件中的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以多糖產(chǎn)率Y(%)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn),得到最優(yōu)的血紅鉚釘菇多糖提取條件.共有29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),其中有24個(gè)分析因子和5個(gè)零點(diǎn).零點(diǎn)試驗(yàn)共5次,用于預(yù)估誤差.分別用-1、0、1對(duì)各自變量的低、中、高3個(gè)試驗(yàn)水平進(jìn)行編碼[18-20].其因素水平表如下:

        表1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)因素水平表

        2.5 血紅鉚釘菇多糖中的蛋白去除

        具體操作步驟為:將Sevage試劑加入到4倍體積的血紅鉚釘菇多糖溶液中,利用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢? h之后,置于分液漏斗中靜置分層,保留上層溶液,用紫外分光光度計(jì)在波長280 nm處測定吸光度,測定蛋白的去除率[21-23].

        2.6 血紅鉚釘菇多糖清除DPPH自由基能力的測定I

        2.6.1 溶液配制

        (1)取血紅鉚釘菇多糖樣本稀釋至80 mg/mL,然后倍數(shù)稀釋至0.625 mg/mL,共8個(gè)濃度梯度,從低到高依次標(biāo)記為1至8號(hào).

        (2)稱取7.88 mg DPPH,用無水乙醇定容于100 mL容量瓶中,搖勻待用.

        2.6.2 實(shí)驗(yàn)方法

        分別稱取100 μL樣品加入到96孔板中,再加入DPPH溶液100 μL,樣品組和對(duì)照組分別做3個(gè)平行樣,充分搖勻后,用錫紙包好進(jìn)行避光處理,置于25 ℃恒溫箱中靜置30 min.于517 nm處測得吸光度值.DPPH清除率計(jì)算公式為:

        DPPH清除率(%)={1-(Ax-Ay)/A0}×100%

        Ax為不同濃度樣品+DPPH吸光度值;Ay為不同濃度樣品+蒸餾水吸光度值;A0為蒸餾水+DPPH吸光度值[24-26].

        3 結(jié)果與討論

        3.1 血紅鉚釘菇多糖的提取

        3.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        (1)液料比對(duì)多糖得率的影響

        液料比(mL·g-1)圖2 液料比對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率的影響

        (2)微波功率對(duì)多糖得率的影響

        由圖3可知,在400 W至700 W范圍內(nèi),多糖得率隨功率增強(qiáng)而提高,但在超過700 W后,多糖產(chǎn)率開始下降.分析原因可能是由于大功率微波使物料溫度升高,壓力增大,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),部分血紅鉚釘菇多糖發(fā)生水解且變性[28],同時(shí)產(chǎn)生大量雜質(zhì),對(duì)水的滲入造成較大阻礙,導(dǎo)致血紅鉚釘菇多糖的得率下降.

        微波功率/W圖3 微波功率對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率的影響

        (3) 微波溫度對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

        由圖4可知,在70 ℃至100 ℃范圍內(nèi),多糖得率隨著溫度的升高而增加.100 ℃之后,隨溫度升高,多糖得率開始下降,可能是由于溫度繼續(xù)升高使得多糖在高溫下分解,從而導(dǎo)致多糖得率開始下降[29].

        微波溫度/℃圖4 微波溫度對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率的影響

        (4) 微波時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

        由圖5可知,在5 min至10 min范圍內(nèi),多糖得率隨時(shí)間的增長而增長,且在10 min時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)率,這是由于多糖溶出的過程是從固體溶質(zhì)向液體溶劑轉(zhuǎn)移的過程,在兩者尚未達(dá)到平衡時(shí),隨時(shí)間增長其作用時(shí)間越長,最終達(dá)到平衡后,多糖得率達(dá)到最大;之后隨時(shí)間增長多糖得率呈下降趨勢.可能是由于微波時(shí)間過長,使得細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)溶出增加或者部分多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化,使得多糖得率降低[30].

        微波時(shí)間/min圖5 微波時(shí)間對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率的影響

        3.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

        (1) 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

        在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以血紅鉚釘菇多糖得率為目標(biāo)值,選定4因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì),結(jié)果見表2.

        表2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果表

        對(duì)上表試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到關(guān)于A、B、C、D的擬合方程如下:

        多糖產(chǎn)率=14.77+0.097A-0.22B+0.28C+0.20D-0.12AB-0.26AC+0.15AD+0.13BC+0.44BD+0.29CD-0.44 A2-0.43B2-0.49C2-0.61D2

        對(duì)此回歸模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3.

        表3 回歸模型方差分析表

        由表3可以得出,多糖得率模型F值為33.66,P值小于0.000 1,此模型達(dá)到高度顯著水平,失擬項(xiàng)為0.785 7,失擬不顯著,表明實(shí)驗(yàn)與模型擬合程度比較好,實(shí)驗(yàn)誤差比較小,該方程能夠預(yù)測和解釋血紅鉚釘菇多糖得率隨微波萃取各因素變化的規(guī)律.

        (2) 響應(yīng)面57圖形分析

        根據(jù)回歸方程分析結(jié)果做出相應(yīng)的響應(yīng)等高線圖(見圖6)和曲面圖(見圖7),以確定微波溫度、微波時(shí)間、微波功率和液料比這4個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響,以此來推測出因變量.

        圖6 各交互因素對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率影響的等高線圖

        圖7 各交互作用對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖

        響應(yīng)面分析的圖形是特定的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)自變量構(gòu)成的三維立體圖形,可以直觀反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響,從試驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析圖上可找到它們?cè)诜磻?yīng)過程中的交互作用[31].

        圖7反映出了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值,即多糖得率的影響.等高線的形狀反映了交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,等高線若趨于圓形則表明兩個(gè)因素交互作用不顯著,趨于橢圓則相反[31].總體來看,除去功率和時(shí)間與功率和溫度兩組外,其他各組因素對(duì)多糖得率的影響都十分顯著.

        3.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

        根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證其是否與真實(shí)情況一致或者相似.考慮到實(shí)際操作,將微波功率修正為600 W,按此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),重復(fù)三次,以驗(yàn)證試驗(yàn)檢測值與理論預(yù)測值的相符程度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4.

        表4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果表

        驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均產(chǎn)率為15.31%,通過方差分析表明,實(shí)際測試值與預(yù)測值差異不顯著,說明該模型可以較為可靠地模擬和預(yù)測血紅鉚釘菇多糖的產(chǎn)率,從而也證明了采用響應(yīng)面法優(yōu)化血紅鉚釘菇多糖提取條件參數(shù)的可行性.

        3.2 Sevage法去蛋白試驗(yàn)結(jié)果

        用Sevage法去除蛋白8次后,每次測定其吸光度,其結(jié)果見圖8.

        去蛋白次數(shù)/次圖8 Sevage法去蛋白折線圖

        由上圖可以看出,去蛋白到第7次后,吸光度與第6次相比極為接近,為減小損耗、節(jié)約試劑,本試驗(yàn)以去除6次為最佳.其余蛋白質(zhì)可能是通過化學(xué)鍵與多糖相連接,Sevage試劑無法將其除去.

        3.3 血紅鉚釘菇多糖清除DPPH自由基能力的測定

        研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)的多糖具備將自由基清除或者提高抗氧化活性來延緩氧化[32].DPPH自由基是一種十分穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,在517 nm波長處其孤對(duì)電子有較強(qiáng)的吸收,當(dāng)存在自由基清除劑時(shí),孤對(duì)電子被配對(duì),吸收消失或減弱[33].本試驗(yàn)在517 nm波長處測其吸光度,通過DPPH清除率計(jì)算公式來評(píng)價(jià)血紅鉚釘菇多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力.如圖9所示,血紅鉚釘菇多糖有顯著的清除DPPH自由基的能力,且在一定范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度的升高其清除能力增強(qiáng).6號(hào)樣品的DPPH自由基清除率最高,即濃度為20 mg/mL時(shí),其自由基清除率為77%.

        樣品序列圖9 血紅鉚釘菇多糖對(duì)DPPH自由基清除率折線圖

        4 結(jié) 論

        對(duì)所提取血紅鉚釘菇多糖的抗氧化實(shí)驗(yàn)顯示,血紅鉚釘菇多糖對(duì)DPPH自由基存在一定的清除能力,并且其清除能力與質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)存在一定的量效關(guān)系,表明血紅鉚釘菇多糖具有較好的抗氧化能力.

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