趙俸涌 楊啟修 郭忠慧 張嘉敏 李勤 沈偉 葉璐夷 朱自嚴(yán) 向東

Rh系統(tǒng)血型同種抗體是造成嚴(yán)重新生兒溶血疾病的主要原因[1，2]，IgG抗-D抗體定量儀已被歐洲、北美及澳大利亞廣泛使用，它主要用來對RhD陰性孕婦血漿中的抗-D抗體進(jìn)行監(jiān)測，同時也用于CCee表型的孕婦及患者抗-c抗體的檢測；除此之外，它還應(yīng)用于抗-D免疫球蛋白注射后RhD陰性母親血漿中的抗-D免疫球蛋白殘余量的檢測[3-8]。我國目前尚未在臨床上開展抗-D免疫球蛋白預(yù)防RhD血型不匹配導(dǎo)致的胎母免疫，亦沒有開展抗-D抗體定量實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室通常對產(chǎn)生抗-D抗體的孕婦及患者血清使用效價測定的方法進(jìn)行檢測和記錄，并作為評估指標(biāo)[9-11]。而采用效價測定作為抗體評價的方法是否與抗體定量值相關(guān)，目前我國還未有相關(guān)研究。為了未來在臨床上科學(xué)開展血型抗體引發(fā)新生兒溶血病的免疫性預(yù)防及監(jiān)測工作，也為了研究采用抗體效價測定作為治療評判的科學(xué)性，我們對IgG抗-D抗體量與效價的關(guān)系進(jìn)行了一些研究。

材料與方法

1 試劑與儀器 抗-A，抗-B定型單克隆抗體試劑盒（批號：20181023）及A、B、O細(xì)胞試劑盒（批號：20195364）用于ABO定型，IgM抗-C（批號：20183001）、IgM抗-E（批號：20183201）、IgM抗-c（批號：20183101）、IgM抗-e（批號：20183301）用于Rh系統(tǒng)抗原表型分型（以上血型檢測試劑均來自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）。4人份O型CCDee表型的細(xì)胞（R1R1）作為試劑細(xì)胞用于效價和抗體定量實(shí)驗(yàn)，抗體效價測定采用ORTHOVISION自動血型檢測儀及配套抗人球凝膠卡（Ortho，美國，批號：IGC051H）進(jìn)行自動檢測。IgG抗-D國際標(biāo)準(zhǔn)品（NIBSC code：73/517）用于制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗-D質(zhì)控品（QC）血漿（人源性抗-D，上海市血液中心血型參比室自制）用于QC監(jiān)測。O型外周血單個核細(xì)胞（PBMC）經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)板（FALCON，批號：354108）培養(yǎng)，用于單核細(xì)胞單層吞噬試驗(yàn)（MMA），使用顯微鏡觀察結(jié)果。

2 樣本制備 本實(shí)驗(yàn)選擇了送至上海市血液中心血型參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測的樣本中17份抗-D效價大于64的孕婦及產(chǎn)生抗-D抗體患者的血漿樣本（見表1），用于效價測定及抗體定量實(shí)驗(yàn)。血漿樣本2500 g離心5 min，取上清。所有血漿樣本均使用譜細(xì)胞進(jìn)行鹽水法檢測以排除IgM抗體，并通過抗體鑒定排除抗-D以外的意外抗體干擾。

3 抗體定量檢測與抗體效價檢測 將抗-D國際標(biāo)準(zhǔn)品按照10個濃度梯度進(jìn)行稀釋并制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，QC-血漿按照比例稀釋用于QC監(jiān)測，每10個樣品進(jìn)行一次QC驗(yàn)證。將待檢血漿按照相應(yīng)濃度，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行稀釋，確保所有樣本按不同稀釋度稀釋后，抗體濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)（表1）?？贵w效價測定采用ORTHOVISION自動血型檢測儀及抗人球蛋白凝膠卡進(jìn)行自動檢測。對全部樣本進(jìn)行抗體效價與抗體定量相關(guān)性分析，對例數(shù)大于等于3的256（n=4）、512（n=3）、2048（n=3）三個效價組中每個樣本都對效價和抗體定量（IU/Titer）進(jìn)行了比較（其中，128效價組由于其中一例樣本存在蛋白析出，為保證檢測的準(zhǔn)確性，并未對128效價組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）。

表1 抗-D抗血漿效價

4 單核細(xì)胞單層試驗(yàn)（Monocyte Monolayer Assay,MMA） 對256組4份樣品進(jìn)行MMA檢測，評估抗體介導(dǎo)紅細(xì)胞被免疫吞噬的能力。將PBMC分離后，鋪板培養(yǎng)2 h，待單層細(xì)胞貼壁后，加入已使用抗血清致敏的紅細(xì)胞（含有IgG抗-D的血漿稀釋10倍后與紅細(xì)胞于37℃共同孵育30 min后使用鹽水洗滌3次）懸液，進(jìn)行吞噬，30 min后固定染色，顯微鏡觀察結(jié)果，選取10個視野統(tǒng)計(jì)吞噬率，并求平均數(shù)。采用10 IU IgG抗-D國際標(biāo)準(zhǔn)血漿致敏的紅細(xì)胞作為陽性對照，采用新鮮AB型抗篩陰性血漿作為陰性對照。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 抗體定量檢測 所有試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線r值大于0.99，C V值在±S D范圍區(qū)間內(nèi)，含抗-D抗體血漿為（0.006-0.092）IU/Titer（定量值/效價），效價與國際單位間相關(guān)系數(shù)r=0.92；P＜0.001（圖1A）。

2 不同效價組抗體定量值比較 256組（0.029±0.002）IU/Titer；512組（0.072±0.027）IU/Titer；2048組（0.038±0.015）IU/Titer，256組與512組比較P＜0.001；512組與2048組比較P=0.215，256組和2048組P=0.102（圖1B）?？贵w定量試驗(yàn)絕對檢測范圍為：0.005 IU/mL～0.033 IU/mL，實(shí)驗(yàn)樣本定量值=實(shí)際檢測值×稀釋倍數(shù)。

3 265效價組抗體介導(dǎo)吞噬試驗(yàn) 單核細(xì)胞單層吞噬實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)雖然抗體效價都為256，但其導(dǎo)致的吞噬率并不一致（分別為4.2%，8%，15%，9%）其中一例吞噬率明顯高于其他三例（圖2）。該組四例標(biāo)本抗體定量值見表2。

圖1 抗體效價法與抗體定量法檢測比較

圖2 256效價組血漿抗體介導(dǎo)紅細(xì)胞免疫吞噬

表2 256效價組測定結(jié)果

討 論

目前發(fā)達(dá)國家和地區(qū)采用抗體定量法對RhD陰性孕婦進(jìn)行抗-D抗體監(jiān)測以評估由抗-D介導(dǎo)的胎兒及新生兒溶血性疾病，從而進(jìn)行必要的干預(yù)治療；同時，抗體定量法還可以用于對抗-D免疫球蛋白預(yù)防性注射后母體外周血?dú)堄嗫贵w的量進(jìn)行監(jiān)測，從而確保預(yù)防效果。而國內(nèi)主要采用效價測定的方法，對母體血漿抗-D抗體進(jìn)行監(jiān)測，預(yù)測胎兒及新生兒發(fā)生溶血性疾病的嚴(yán)重程度[3-8]。

抗-D連續(xù)流自動抗體檢測儀主要工作原理是利用抗體對酶處理細(xì)胞發(fā)生凝集這一現(xiàn)象，在去除凝集塊后將殘余紅細(xì)胞進(jìn)行破膜，最后檢測其游離血紅蛋白的含量，并經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，獲得其對應(yīng)的國際單位值。而效價方法則是通過稀釋抗體后觀察與紅細(xì)胞凝集程度。在放開二胎的新形勢下，由于抗-D引起的新生兒溶血病具有首次懷孕誘發(fā)母體免疫并作用于再次懷孕的特性，勢必導(dǎo)致該疾病發(fā)生概率的增加，而抗-D免疫球蛋白預(yù)防性治療被認(rèn)為是最有效的方法[6-8]?？?D免疫球蛋白是根據(jù)母體內(nèi)胎兒紅細(xì)胞量估算而進(jìn)行注射的，由于通常注射后被動獲得的抗-D抗體很少能達(dá)到4以上的效價，且抗體效價與RhIG的有效性或胎兒母體出血（Fetomaternal hemorrhage，F(xiàn)MH）的量無關(guān)。因此，采用定量法對預(yù)防性抗-D免疫球蛋白注射后抗體的監(jiān)測比抗體定量方法更為準(zhǔn)確[12]。在本實(shí)驗(yàn)過程中，抗體普遍經(jīng)過500～20000倍稀釋后進(jìn)行連續(xù)流檢測（表1），而在該稀釋度下，無法進(jìn)行效價檢測。一般經(jīng)抗-D免疫球蛋白注射后，體內(nèi)含量為1500 IU（約0.33 IU/mL），如若對注射后殘留抗體進(jìn)行檢測，用效價方法在檢測精度和準(zhǔn)確性方面都存在著不足。

本研究在對不同效價抗體組血漿的單位效價抗體定量（IU/Titer）比較后發(fā)現(xiàn)，512組IU/Titer比256組與2048組高出接近兩倍，說明效價方法與抗體定量值存在不平行，某些樣本存在顯著差異。同時，在對256組進(jìn)行MMA試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)同一效價組抗體介導(dǎo)紅細(xì)胞被免疫清除的能力也存在較大差異，該結(jié)果也說明，效價測定方法對胎兒或新生兒溶血反應(yīng)預(yù)測作用并不準(zhǔn)確[13，14]。在對256組進(jìn)行抗體定量后，發(fā)現(xiàn)定量值高低與吞噬強(qiáng)弱相關(guān)一致性較好，較高定量值的抗體吞噬程度較強(qiáng)（圖2、表2）也說明抗體定量方法較效價方法對紅細(xì)胞免疫清除強(qiáng)度的預(yù)測更有效；但我們也發(fā)現(xiàn)，在如256-3與256-4相比較，二者定量值比與吞噬率比而言存在差異，這可能是由于兩份樣本IgG亞型和比例不同造成的[12]，這也是本研究團(tuán)隊(duì)下一步開展研究的方向。

綜上，在本研究中發(fā)現(xiàn)，雖然大部分抗體的高效價意味著抗體定量值較高，但仍然有相當(dāng)一部分高效價的抗體定量值很低，并且在不同效價組間，抗體的IU/Titer比存在顯著差異，可能的原因是不同個體及不同效價抗體的親和力不同，而依據(jù)親和力方程，顯然親和力更高的抗體會更易于和紅細(xì)胞形成穩(wěn)定的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞被清除，最終造成溶血。而抗體定量儀實(shí)驗(yàn)過程中恰恰包含了親和力因素。因此，抗體定量在抗-D抗體的監(jiān)測方面比效價方法存在更多優(yōu)勢。

當(dāng)然，本研究存還在一些不足，如產(chǎn)生抗-D抗體血漿的樣品數(shù)限制，僅進(jìn)行了較小樣本量的探索性實(shí)驗(yàn)。在后期的延續(xù)性研究中，還應(yīng)該對更多的樣本進(jìn)行檢測，以獲得更為精確的結(jié)果。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突