富浩軒 付華來 王捷 鄧剛

自1974年臍帶血中被發(fā)現(xiàn)含有豐富的造血干細胞以來，有關學者對其進行了深入的研究，1988年世界上第一次使用臍帶血造血干細胞移植治療范可尼貧血獲得成功[1，2]，引起了越來越多的專家及學者的重視。此后，臍帶血造血干細胞的冷凍及長時間保存被廣泛關注，并已有了一套相對成熟的保存方式。液氮的物理溫度為-196 ℃，將臍帶血造血干細胞直接浸沒在液氮中保存能夠最大限度地保持干細胞的活性，同時液氮因性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉等特點被廣泛使用。

一份臍帶血造血干細胞在合格凍存前需要進行相關的細菌及病毒檢測，檢測周期約為7 d左右。在此之前，各個未知檢測結(jié)果的臍帶血造血干細胞保存于同一液氮中。有報道指出，液氮可以像常見的液體（流水）一樣，可將病毒和細菌在保存的容器內(nèi)傳播，例如：1976年THOMAS SCHAEFER[3]等人在液氮中發(fā)現(xiàn)了感染性病毒，提出了保存在液氮中的標本存在交叉污染的風險，且已被證實一些微生物可以在深低溫環(huán)境下凍存并污染其他標本[4]。在隨后的1995年，TEDDER[5]報告了從未感染過乙肝病毒的供者身上采集的骨髓干細胞，由于儲存在液氮中而被乙型肝炎病毒污染，并導致接受該份骨髓干細胞的受者發(fā)生HBV感染的案例。這表明保存在液氮中的標本間存在交叉污染的風險，因此需要一種更優(yōu)的保存標本的方式。

現(xiàn)在有一種氣相液氮罐，其原理是利用低溫的液氮蒸汽對液氮罐內(nèi)環(huán)境進行降溫達到一個近似于液氮溫度的深低溫環(huán)境，從而實現(xiàn)液氮與標本的干濕分離而采取的一種保存方式。理論上來說，在低于-79 ℃的環(huán)境中酶的生物活性處于基本停止狀態(tài)，而在-196 ℃的環(huán)境中細胞的新陳代謝作用也處于基本停止狀態(tài)，此時的細胞是可以長期保存的[6]。而實際情況是氣相液氮罐由于受保溫工藝的限制，液氮罐內(nèi)液氮面以外位置的實際溫度達不到-196 ℃。本文將探究這種氣相液氮罐內(nèi)不同位置的溫度是否符合要求，以及保存在不同的溫度下臍帶血造血干細胞的凍存質(zhì)量是否有差異。

材料與方法

1 臍帶血樣本 臍帶血樣本來自于浙江省臍帶血造血干細胞庫合法采集的捐獻臍帶血。所有捐獻者均被充分告知其捐獻臍帶血的用途，填寫健康調(diào)查表并簽署知情同意書。樣本總數(shù)為60份，分成3組。其中A組的20份臍帶血造血干細胞保存于液氮中，作為對照組。B組的20份臍帶血造血干細胞保存于氣相液氮罐內(nèi)溫度最低處、C組的20份臍帶血造血干細胞保存于氣相液氮罐內(nèi)溫度最高處，B組和C組為實驗組。選取的60份標本均采自2018年6月～10月，在浙江省內(nèi)多家醫(yī)院采集并通過相同的條件進行運輸、制備、檢測及程控降溫凍存的臍帶血造血干細胞，臍帶血采集完畢后均在24 h內(nèi)完成制備凍存，其過程均符合浙江省臍帶血造血干細胞庫質(zhì)量控制要求。分別在冷凍前及冷凍2年后，進行有核細胞計數(shù)、CD34+細胞計數(shù)、有核細胞活性及CFU-GM培養(yǎng)等檢測（冷凍后的檢測結(jié)果來源于該份臍帶血參照留樣標本臨床應用前的檢測數(shù)據(jù)）。

2 實驗儀器 XN-1000血細胞計數(shù)儀購自日本Sysmex公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司，SANYO MCO-20AIC CO2培養(yǎng)箱購自美國ThermoFisher公司，1892P-190AF-GB液氮罐購自美國MVE公司，CU-600恒溫水浴箱購自上海一恒公司，7451程控降溫儀購自美國Thermo Fisher公司。

3 實驗試劑 WNR染液、WNR溶血素、WDF染液、WDF溶血素、SLS溶血素、DCL稀釋液等計數(shù)儀相關試劑均購自日本Sysmex公司，單克隆抗體CD45-FITC、單克隆抗體CD34-PE、小鼠IgG1-PE、7-AAD、溶血素等流式儀相關試劑均購自美國BD公司，甲基纖維素培養(yǎng)基購自加拿大StemCell公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國GIBCO公司。

4 方法

4.1 有核細胞計數(shù)：利用WNR染液（Fluorocell WNR）對臍帶血樣本進行熒光染色并通過流式細胞術的方法對樣本中所有血細胞進行檢測，根據(jù)側(cè)向熒光（SFL）和前向散射光（FSC）的強弱讀取單位標本量中所含有核細胞數(shù)量從而計算得出樣本中有核細胞的濃度。

4.2 CD34+%和有核細胞活性檢測：根據(jù)ISHAGE（International Society for Hematotherapy and Graft Engineering）標準，利用CD45及CD34單克隆抗體對臍帶血標本進行室溫避光孵育標記，再通過流式細胞儀進行檢測分析。根據(jù)造血干祖細胞的特征：1.CD45弱陽性；2.CD34陽性；3.低側(cè)向散射光（SSC）；4.前向散射光（FSC）與淋巴細胞相似，圈選出造血干祖細胞在有核細胞中所占的比例。有核細胞活性的檢測則是利用7-AAD染液對有核細胞進行染色后通過流式細胞儀分析測定，根據(jù)7-AAD結(jié)果陰性為活細胞，7-AAD結(jié)果陽性為死細胞，圈選出活細胞在有核細胞中所占的比例。

4.3 CFU-GM培養(yǎng)：通過將單位數(shù)量的有核細胞接種到半固體甲基纖維素培養(yǎng)基后在CO2培養(yǎng)箱中進行一定周期培養(yǎng)，正常的造血干祖細胞具有增殖分化能力并最終成為成熟的血細胞集落。通過計數(shù)培養(yǎng)孔內(nèi)生長的集落數(shù)，推斷該份臍帶血造血干細胞的造血能力。理論上來說，培養(yǎng)板上生長的集落數(shù)占接種有核細胞數(shù)的比例應與CD34+%一致，但受細胞活性等因素影響，實際生長的集落數(shù)量無法達到理論值，因此可以通過集落的生長情況側(cè)面反映出一份臍帶血造血干細胞的質(zhì)量。

5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差（±s）表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 氣相液氮罐內(nèi)不同位置的溫度 由于本實驗使用的液氮罐是利用液氮氣化后的深低溫氮氣進行標本保存，因此保存溫度是無法達到-196 ℃的，測量結(jié)果見表1。

表1 氣相液氮罐內(nèi)不同位置的溫度

由此可知距離液氮平面越遠溫度越高，而該氣相液氮罐內(nèi)距離液氮平面最遠和最近位置的溫度分別為：-188 ℃和-195 ℃。保存的標本則是從下到上放置在標本架上并垂直放置于-195℃～-188℃，距離液氮平面越近的臍帶血造血干細胞所處的溫度將越接近理想的保存溫度（-196 ℃），反之則越遠。

2 60份臍血造血干細胞冷凍前后的凍存質(zhì)量分析按照浙江省臍帶血造血干細胞庫的標準操作規(guī)程分別對A組、B組、C組共60份臍帶血進行造血干細胞的提取和凍存；分別對冷凍前及解凍后臍帶血造血干細胞質(zhì)量參數(shù)進行檢測和計算：①有核細胞回收率：（解凍后有核細胞數(shù)/冷凍前有核細胞數(shù)）×100%；②活性變化率：[（冷凍前細胞活性-解凍后細胞活性）/冷凍前細胞活性]×100%；③集落回收率：（解凍后集落數(shù)/冷凍前集落數(shù)）×100%；④CD34+細胞回收率：（解凍后CD34+細胞%/冷凍前CD34+細胞%）×100%。

在對實驗數(shù)據(jù)進行匯總整理后可以發(fā)現(xiàn)用于檢測A、B、C三組代表標本凍存質(zhì)量的項目（有核細胞回收率，活性變化率，集落回收率以及CD34+細胞回收率）其F值分別為0.982、0.828、1.573、0.859，P值均大于0.05，說明各組均值差異不具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果詳見表2。提示因保存標本的位置不同造成的略高于液氮溫度的環(huán)境并沒有對臍帶血造血干細胞的保存質(zhì)量產(chǎn)生影響。

3 樣本冷凍前與復蘇后檢測結(jié)果對比 通過對各項檢測結(jié)果的圖譜進行比對，圖1為利用血細胞計數(shù)儀對樣本進行白細胞五分類計數(shù)的對比情況，由圖1可知細胞分類并未見明顯異常。圖2為流式細胞儀檢測樣本CD34+以及有核細胞活性的對比情況，圖2中未見明顯區(qū)別。圖3為樣本CFU-GM集落培養(yǎng)情況對比，如圖3所示各細胞集落生長情況正常。

表2 各組臍帶血造血干細胞凍存質(zhì)量參數(shù)比較

圖1 有核細胞計數(shù)

討 論

《臍帶血造血干細胞庫技術規(guī)范》規(guī)定：臍帶血冷凍保存溫度不高于-135℃，AABB（美國血庫協(xié)會）要求：臍帶血冷凍保存溫度不高于-150℃，我們使用的氣相罐內(nèi)最高溫度約為-188℃，高于以上標準，符合要求。同時由結(jié)果可知：保存在液相和氣相中的臍帶血造血干細胞的凍存質(zhì)量沒有差異，這表明：氣相液氮罐內(nèi)保存臍帶血能夠達到與在液氮中保存相同的效果，相對于傳統(tǒng)的浸沒在液氮中的保存而言，氣相保存方式減少了在標本存取時產(chǎn)生液氮迸濺的可能，對操作人員更加的安全；同時還能避免因液氮的介質(zhì)作用而造成標本間的交叉污染。

圖2 CD34+及有核細胞活性

圖3 CFU-GM培養(yǎng)結(jié)果

通過本次研究還表明：在低于-188℃的溫度范圍內(nèi)，保存于氣相罐內(nèi)不同位置臍帶血的凍存質(zhì)量也無差異，這也為臍帶血的凍存方式和質(zhì)量管理提供了重要的數(shù)據(jù)支持。

本研究還值得進一步深入探索，由于長期在液氮中凍存的臍帶血造血干細胞樣本的質(zhì)量已被證實不會存在差異[7]，而本研究所使用的冷凍樣本均是凍存時間未超過兩年的，通過實驗結(jié)果可知：在這個時期內(nèi)，保存于氣相罐內(nèi)不同位置臍帶血的凍存質(zhì)量無差異，但隨著時間的延長，其保存效果是否仍無差異，需要我們做一個長期的觀察和統(tǒng)計。另外，在液氮罐的氣相環(huán)境中，是否可以真正避免標本間的交叉污染還需要繼續(xù)通過實驗進一步驗證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突