中國(guó)輸血協(xié)會(huì)免疫血液學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)

胎兒新生兒溶血病（hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）是指因母嬰血型不合，母體針對(duì)與其不同的胎兒紅細(xì)胞血型抗原所產(chǎn)生的相應(yīng)抗體經(jīng)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒血液循環(huán)，導(dǎo)致胎兒或新生兒同種免疫性溶血引起的一系列臨床癥狀[1]。HDFN常導(dǎo)致早期流產(chǎn)，輕者出現(xiàn)貧血、水腫、肝脾腫大，重者如果未經(jīng)處理，可能導(dǎo)致胎兒重度貧血、嚴(yán)重的新生兒高膽紅素血癥與核黃疸甚至死亡[2，3]。臨床上以ABO血型不合引起的HDFN多見(jiàn)，一般臨床癥狀較輕，偶爾有IgG高效價(jià)抗-A（B）抗體引起嚴(yán)重的ABO-HDFN案例報(bào)道[4，5]。非ABO-HDFN以Rh血型不合HDFN為主，其特點(diǎn)是起病急、進(jìn)展快、溶血嚴(yán)重，容易發(fā)生膽紅素腦病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病甚至死亡[6，7]。其他血型系統(tǒng)，包括MNS、Kell、Kidd及Duffy等血型系統(tǒng)也會(huì)引起不同程度的胎兒新生兒溶血病[8，9]。

隨著胎兒和新生兒醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，尤其是非侵入性技術(shù)的廣泛應(yīng)用，如孕婦外周血游離胎兒DNA（cell-free fetal DNA，cff-DNA）血型基因檢測(cè)、大腦中動(dòng)脈峰值流速（MCA-PSV）多普勒檢測(cè)等，使得以往的HDFN檢測(cè)規(guī)范需進(jìn)行修改。目前國(guó)外已經(jīng)發(fā)布《孕婦血型和紅細(xì)胞抗體檢測(cè)指南》[10]及《存在紅細(xì)胞抗體孕婦管理指南》[11]，關(guān)于抗體檢測(cè)的知情同意、標(biāo)本采集、抗體篩查時(shí)機(jī)、頻率和管理路徑、cff-DNA應(yīng)用等方面，給出了詳細(xì)的推薦意見(jiàn)，值得我們借鑒與參考。而國(guó)內(nèi)HDFN實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)尚待規(guī)范，仍存在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)方法及抗體篩查時(shí)機(jī)、頻次不完全統(tǒng)一，缺乏有針對(duì)性的質(zhì)量控制，檢測(cè)項(xiàng)目缺項(xiàng)，如胎兒血型基因檢測(cè)、抗體效價(jià)及胎母出血檢測(cè)等問(wèn)題，國(guó)內(nèi)尚無(wú)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展。

1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.1 檢測(cè)對(duì)象：具有不良妊娠史、HDFN史及RhD陰性，尤其存在不規(guī)則抗體、稀有血型而難以獲得相容性血液的備孕女性及孕婦。需注意申請(qǐng)單填寫(xiě)時(shí)應(yīng)明確標(biāo)注流產(chǎn)史、妊娠史、輸血史及抗-D免疫球蛋白注射情況。

1.2 標(biāo)本要求：采集備孕女性、孕婦、配偶或新生兒EDTA抗凝血3～5 mL，新生兒可使用臍血替代，非侵入性游離胎兒基因（cff-DNA）檢測(cè)采集妊娠≥16周孕婦外周血5～8 mL（推薦），侵入性胎兒基因檢測(cè)采用絨毛膜取樣或羊水穿刺術(shù)（慎用）。

1.3 檢測(cè)方案

1.3.1 產(chǎn)前檢查方案：所有孕婦在妊娠8～12周建檔時(shí)進(jìn)行ABO和RhD血型鑒定，紅細(xì)胞不規(guī)則抗體篩查。抗體篩查陽(yáng)性時(shí)需鑒定抗體特異性，進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)；抗體篩查陰性時(shí)，妊娠28周復(fù)查，未檢測(cè)出有臨床意義的抗體時(shí)，孕婦不需要進(jìn)一步做產(chǎn)前血型鑒定或抗體篩查（具體見(jiàn)2.4）。推薦進(jìn)行胎兒非侵入性血型基因型檢測(cè)（cff-DNA），以確定胎兒血型，預(yù)測(cè)HDFN風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)母親確定存在具有臨床意義的抗體，無(wú)法進(jìn)行非侵入性胎兒基因型檢測(cè)時(shí)，推薦進(jìn)行父親血型檢測(cè)，預(yù)測(cè)妊娠胎兒的風(fēng)險(xiǎn)。RhD陰性孕婦有潛在的致敏危險(xiǎn)，應(yīng)常規(guī)產(chǎn)前給予抗-D免疫球蛋白預(yù)防。

1.3.2 胎兒出生后檢測(cè)：可采集臍帶血或新生兒血樣進(jìn)行直接抗人球蛋白試驗(yàn)、游離抗體試驗(yàn)、紅細(xì)胞抗體放散試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行血紅蛋白（Hb）和膽紅素測(cè)定。

1.3.3 其它檢測(cè)：胎母出血檢測(cè)，對(duì)于羊膜穿刺術(shù)、異位妊娠、產(chǎn)前出血、宮內(nèi)死亡、剖腹產(chǎn)等孕婦，及RhD陰性孕婦預(yù)防注射抗-D免疫球蛋白等，推薦進(jìn)行胎母出血檢測(cè)。存在高效價(jià)IgG血型抗體時(shí)推薦進(jìn)行cff-DNA、MCA-PSV及IgG抗體亞型檢測(cè)、單核細(xì)胞單層試驗(yàn)。若臨床已采用MCA-PSV監(jiān)測(cè)，抗體效價(jià)檢測(cè)的臨床價(jià)值有待商榷，尤其是抗體效價(jià)已達(dá)到臨床高危風(fēng)險(xiǎn)，可不做抗體效價(jià)測(cè)定。

1.4 檢測(cè)時(shí)機(jī)和頻次：①備孕女性懷孕之前可檢測(cè)或孕婦妊娠8～12周建檔時(shí)首次檢測(cè)，檢出抗-D或其他具有臨床意義的抗體（包括抗-E、抗-Ec、抗-M等），或IgG抗-A（B）效價(jià)≥64時(shí)，推薦檢測(cè)頻次：妊娠＜28周、1次/4周，妊娠28周至分娩、1次/2周，首次抗體效價(jià)可作為抗體基礎(chǔ)水平。首次抗體檢測(cè)為弱陽(yáng)性而無(wú)法鑒定出特異性時(shí)，應(yīng)在2～4周后復(fù)查，此時(shí)鑒定出特異性，檢測(cè)頻次同前；若仍為弱陽(yáng)性無(wú)法鑒定特異性時(shí)妊娠28周復(fù)查。②首次未檢出具有臨床意義的抗體、抗體檢測(cè)一直為弱陽(yáng)性或IgG抗-A（B）效價(jià)＜64時(shí)，妊娠28周后進(jìn)行復(fù)查，若仍為陰性或IgG抗-A（B）效價(jià)沒(méi)有變化則正常分娩；若抗體檢測(cè)為弱陽(yáng)性或檢出具有臨床意義的抗體，或抗-A（B）效價(jià)升高≥2個(gè)稀釋度（如首次效價(jià)為2，現(xiàn)在上升至8），推薦檢測(cè)頻次：妊娠28周至分娩、1次/2周。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 孕婦及配偶ABO、RhD血型鑒定：采用經(jīng)國(guó)家批準(zhǔn)且檢定合格的單克隆IgM抗-A、抗-B、抗-D，A型、B型、O型試劑紅細(xì)胞，推薦使用試管法或微柱凝膠法。ABO血型必須經(jīng)過(guò)正反定型確認(rèn)，RhD血型可經(jīng)鹽水法初篩及RhD陰性確認(rèn)試驗(yàn)。若孕婦RhD血型無(wú)法確證陽(yáng)性，應(yīng)按照RhD陰性管理；若孕婦確認(rèn)RhD陰性，應(yīng)書(shū)面及口頭告知孕婦及臨床醫(yī)生，并建議給予抗-D免疫球蛋白預(yù)防。

1.5.2 孕婦紅細(xì)胞不規(guī)則抗體篩查及鑒定：選擇經(jīng)國(guó)家批準(zhǔn)且檢定合格的抗體篩查細(xì)胞及抗體鑒定細(xì)胞，使用微柱凝膠抗人球蛋白法進(jìn)行檢測(cè)。檢出具有臨床意義的抗體時(shí)，應(yīng)口頭或書(shū)面告知孕婦或臨床醫(yī)生抗體特異性及可能引起HDFN的風(fēng)險(xiǎn)，并告知輸血時(shí)可能難以獲得相容性血液的風(fēng)險(xiǎn)。中國(guó)黃種人引起HDFN的抗體主要是IgG抗-A（B）和抗-D、抗-E，關(guān)于IgG抗-A（B）和抗-D、抗-E效價(jià)與HDFN發(fā)病率的報(bào)道相對(duì)較多，而抗-Ec、抗-M和抗-c、抗-K等抗體引起HDFN多為個(gè)案報(bào)道，抗體效價(jià)與發(fā)病率情況不明確。

1.5.3 孕婦紅細(xì)胞不規(guī)則抗體效價(jià)/濃度測(cè)定：孕婦不規(guī)則抗體篩查陽(yáng)性鑒定出抗體特異性時(shí)，進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定，應(yīng)增加抗-D血型定型試劑效價(jià)國(guó)家參考品（效價(jià)1∶64）作為室內(nèi)質(zhì)控，我國(guó)已有“抗-D（IgM）血型定型試劑效價(jià)測(cè)定用國(guó)家參考品”，可作為質(zhì)控品保證檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性和可靠性。抗體濃度測(cè)定需要國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物和專(zhuān)門(mén)設(shè)備，測(cè)定結(jié)果報(bào)告形式為IU/mL，國(guó)外有抗-D和抗-c國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參考品，可以進(jìn)行抗體濃度測(cè)定參考[12，13]。若有可能，試驗(yàn)時(shí)將先前效價(jià)檢測(cè)標(biāo)本作為平行對(duì)照，避免因試驗(yàn)方法導(dǎo)致差異。

ABO血型不合孕婦IgG抗-A（B）抗體效價(jià)測(cè)定，國(guó)外大多不推薦此項(xiàng)檢測(cè)。我們對(duì)國(guó)內(nèi)ABO血型不合HDFN數(shù)據(jù)進(jìn)行了Meta分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，認(rèn)為中國(guó)黃種人群ABO血型不合HDFN發(fā)病率高，重癥者時(shí)有報(bào)道，有必要進(jìn)行IgG抗-A（B）抗體測(cè)定[14]。IgG抗-A（B）抗體效價(jià)檢測(cè)應(yīng)使用巰基試劑破壞IgM抗體，如2-巰基乙醇（2-Me）或二硫蘇糖醇（DTT）。傳統(tǒng)的試管抗人球蛋白法易受人為因素影響，推薦使用微柱凝膠抗人球蛋白法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。

根據(jù)IgG抗-A（B）效價(jià)與ABO-HDFN關(guān)系的Meta分析發(fā)現(xiàn)：IgG抗-A（B）效價(jià)＜64，發(fā)病率4.01%（低風(fēng)險(xiǎn)）；64≤IgG抗-A（B）效價(jià)＜128，發(fā)病率18.87%（中等風(fēng)險(xiǎn)）；128≤IgG抗-A（B）效價(jià)＜256，發(fā)病率51.27%（高風(fēng)險(xiǎn)）；256≤IgG抗-A（B）效價(jià)＜512，發(fā)病率74.20%（高風(fēng)險(xiǎn)）；IgG抗-A（B）效價(jià)≥512，發(fā)病率92.13%（高風(fēng)險(xiǎn)）[14]。關(guān)于抗-D效價(jià)與HDFN發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)分析顯示：IgG抗-D效價(jià)＜16，發(fā)病率5.40%（低風(fēng)險(xiǎn)）；16≤IgG抗-D效價(jià)＜32，發(fā)病率33.33%（中等風(fēng)險(xiǎn)）；32≤IgG抗-D效價(jià)＜64，發(fā)病率81.81%（高風(fēng)險(xiǎn)）；64≤IgG抗-D效價(jià)＜128，發(fā)病率92.11%（高風(fēng)險(xiǎn)）；128≤IgG抗-D效價(jià)＜256，發(fā)病率95.65%（高風(fēng)險(xiǎn)）；IgG抗-D效價(jià)≥256，發(fā)病率100.0%（高風(fēng)險(xiǎn)）。根據(jù)抗體強(qiáng)度綜合臨床癥狀采取相應(yīng)的妊娠管理方案指導(dǎo)（表1，2）。

1.5.4 單核細(xì)胞單層試驗(yàn)（monocyte monolayer assay，MMA）：該實(shí)驗(yàn)主要用于評(píng)估孕婦血清IgG抗體的臨床意義，通過(guò)體外觀(guān)察單核細(xì)胞粘附和吞噬致敏紅細(xì)胞的情況，預(yù)判抗體在機(jī)體內(nèi)可能引發(fā)免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱程度[15]。如檢測(cè)到＞20%活性單核細(xì)胞，預(yù)測(cè)95%的病例需要治療；＜20%者預(yù)測(cè)83%不需要治療，該實(shí)驗(yàn)比抗體效價(jià)能更好地預(yù)測(cè)HDFN的嚴(yán)重程度。

表1 IgG抗-A（B）抗體效價(jià)與妊娠管理

表2 抗-D效價(jià)與妊娠管理

1.5.5 胎兒基因檢測(cè)：推薦采用妊娠≥16周孕婦外周血，進(jìn)行非侵入性cff-DNA檢測(cè)，8 h內(nèi)完成血漿分離及胎兒游離DNA提取，判定孕婦是否存在HDFN風(fēng)險(xiǎn)[16]。RhD陰性孕婦推薦cff-DNA檢測(cè)以確定胎兒RhD血型基因型，可有針對(duì)性的進(jìn)行產(chǎn)前預(yù)防抗-D免疫球蛋白注射，避免不必要用藥，未產(chǎn)生抗-D孕婦進(jìn)行cff-DNA檢測(cè)，可減少孕婦產(chǎn)前檢查頻次[17]。

1.5.6 胎兒出生后檢測(cè)：采集新生兒血樣或胎兒娩出后采集臍帶血，進(jìn)行直接抗人球蛋白試驗(yàn)、游離抗體試驗(yàn)、紅細(xì)胞抗體放散試驗(yàn)及Hb和膽紅素測(cè)定。直抗試驗(yàn)紅細(xì)胞需充分洗滌避免結(jié)果假陽(yáng)性，放散試驗(yàn)中ABO系統(tǒng)抗體采用物理放散（冷、熱放散法）或酸放散，ABO系統(tǒng)以外的抗體采用化學(xué)放散法，如乙醚放散、酸放散。直抗陽(yáng)性不能完全診斷HDFN，放散試驗(yàn)檢出抗體特異性是HDFN診斷的重要依據(jù)。除了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，HDFN診斷應(yīng)綜合臨床表現(xiàn)最終確診。

1.5.7 胎母出血（fetomaternal hemorrhage，F(xiàn)MH）檢測(cè)：FMH主要因病理性妊娠、侵襲性檢查、宮內(nèi)治療及分娩等，使胎兒紅細(xì)胞經(jīng)胎盤(pán)絨毛間隙進(jìn)入母體血液循環(huán)，引起胎兒免疫性溶血性反應(yīng)，可造成胎兒嚴(yán)重貧血、宮內(nèi)缺氧，甚至死胎[18]。FMH檢測(cè)有助于明確診斷和了解胎兒宮內(nèi)狀態(tài)，評(píng)估HDFN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和新生兒預(yù)后，指導(dǎo)RhD陰性孕婦注射抗-D免疫球蛋白（immune globulin，Ig）的劑量。檢測(cè)方法主要采用酸洗脫染色試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)，計(jì)算胎兒紅細(xì)胞的比例，估算胎兒出血量[19]。目前認(rèn)為當(dāng)胎兒出血量達(dá)到胎兒血容量20%時(shí)（20 mL/kg），認(rèn)為是大量胎母出血，綜合臨床情況診斷HDFN，必要時(shí)進(jìn)行妊娠干預(yù)[20]。妊娠＜20周孕婦FMH量一般比較少，不必進(jìn)行FMH檢測(cè)。妊娠＞20周的RhD陰性孕婦發(fā)生致敏事件及分娩RhD陽(yáng)性新生兒時(shí)，通常進(jìn)行FMH檢測(cè)。根據(jù)FMH檢測(cè)的胎兒出血量，一般情況下，500 IU抗-D Ig可清除4 mL胎兒紅細(xì)胞，1500 IU清除12 mL。

檢測(cè)方法包括酸洗脫染色試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)，前者主要用于篩查FMH，若胎兒紅細(xì)胞≤2 mL，500 IU抗-D Ig足以清除胎兒紅細(xì)胞；若胎兒紅細(xì)胞＞2 mL，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行D陽(yáng)性紅細(xì)胞檢測(cè)最終確定出血量和抗-D Ig劑量[21]。酸洗脫染色試驗(yàn)（kleihauer-betke test，KBT）是FMH常用檢測(cè)方法，胎兒血紅蛋白（HbF）抗酸能力強(qiáng)于成人血紅蛋白（HbA），孕婦血涂片經(jīng)酸性緩沖液洗脫后，只有含HbF紅細(xì)胞被伊紅染色，從而區(qū)分出胎兒紅細(xì)胞和孕婦紅細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)染色細(xì)胞占全部紅細(xì)胞的比例以確定胎兒紅細(xì)胞的比例，正常值≤3%。流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometer，F(xiàn)MC）：FMH驗(yàn)證試驗(yàn)，通過(guò)熒光標(biāo)記胎兒HbF特異性抗體及其他抗體，利用FMC高分辨率和分選能力，自動(dòng)化分析儀定量檢測(cè)孕婦外周血中胎兒HbF紅細(xì)胞，分析計(jì)數(shù)胎兒紅細(xì)胞比例，比KBT方法靈敏度高、可重復(fù)性強(qiáng)。

1.5.8 高效價(jià)IgG抗體亞型檢測(cè)：IgG抗體有4種亞型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，各亞型激活補(bǔ)體及穿過(guò)胎盤(pán)的能力不同，與紅細(xì)胞結(jié)合后激活補(bǔ)體能力順序?yàn)镮gG1＞IgG3＞IgG2＞IgG4。對(duì)高效價(jià)IgG抗體的孕婦血漿測(cè)定IgG亞型的含量，可預(yù)測(cè)HDFN的發(fā)生概率及嚴(yán)重程度。常用檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)，可定量分析孕婦血清中IgG抗體各亞型的濃度；另外，新型微柱凝膠技術(shù)是將抗原抗體特異性反應(yīng)、生化凝膠過(guò)濾分子篩技術(shù)、間接抗人球蛋白技術(shù)結(jié)合，在微柱凝膠卡反應(yīng)柱中包被抗人IgG亞型的單抗試劑，檢測(cè)IgG抗體亞型，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果特異性和穩(wěn)定性較好[22]。

1.5.9 胎兒大腦中動(dòng)脈峰值流速（MCA-PSV）測(cè)定：IgG抗體效價(jià)明顯升高時(shí)，采用多普勒超聲技術(shù)進(jìn)行胎兒大腦中動(dòng)脈峰值流速（MCA-PSV）測(cè)定，根據(jù)胎兒貧血的病理生理改變，包括胎兒形態(tài)學(xué)及血流動(dòng)力學(xué)變化有效監(jiān)測(cè)胎兒貧血程度，當(dāng)MCA-PSV值＞1.5 MoM（中位數(shù)）時(shí)，即需要進(jìn)行臨床干預(yù)[23，24]。

2 質(zhì)量控制

2.1 有質(zhì)控品要求：推薦使用國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的試劑和質(zhì)控品，與受檢標(biāo)本必須采取相同試驗(yàn)操作步驟。質(zhì)控結(jié)果與預(yù)期靶值相符，結(jié)果在控，受檢標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果可用；質(zhì)控結(jié)果與預(yù)期靶值不相符，結(jié)果失控，受檢標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果不可用，需查找原因、糾正影響因素后，重復(fù)檢測(cè)。

2.2 無(wú)質(zhì)控品要求：對(duì)于無(wú)質(zhì)控品的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，如血型基因檢測(cè)、胎母出血檢測(cè)等，每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

參與制定及修改本共識(shí)的專(zhuān)家 ：駱群（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心輸血科），朱自嚴(yán)（上海市血液中心），苗天紅（北京市紅十字血液中心血型研究室），徐群（山東省血液中心血型研究室），姬艷麗（廣州市血液中心血型研究室），向東（上海市血液中心血型研究室），徐華（陜西省血液中心血型研究室），尹文（空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院輸血科），封志純（解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心附屬八一兒童醫(yī)院），魏瑗（北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科），周玲（戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科），張曉卿（北京大學(xué)第三醫(yī)院輸血科）。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突