林兆威 李超萍 蔡吉苗 時濤 黃貴修

摘? 要：木薯細菌性萎蔫病（cassava bacterial blight， CBB）是當前國內(nèi)木薯生產(chǎn)上最為嚴重的病害。為了明確抗細菌性萎蔫病木薯種質(zhì)的抗病機理，本研究比較木薯抗感種質(zhì)葉片的自身組織結(jié)構(gòu)，與木薯細菌性萎蔫病菌（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis， Xam）互作過程中組織結(jié)構(gòu)和生理生化物質(zhì)變化的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在葉片自身組織結(jié)構(gòu)上，抗病種質(zhì)葉片單位面積氣孔開口總面積、表面蠟質(zhì)含量及角質(zhì)層厚度顯著高于感病種質(zhì);受Xam侵染后，抗病種質(zhì)葉片病/健處產(chǎn)生木栓質(zhì)積累和形成部分侵填體結(jié)構(gòu)，且產(chǎn)生的胼胝質(zhì)比感病種質(zhì)多，過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性及H2O2含量顯著高于感病種質(zhì)。表明3份抗病新種質(zhì)的抗病性與葉片單位面積氣孔開口總面積、表面蠟質(zhì)含量、角質(zhì)層厚度以及Xam侵染所誘導的木栓質(zhì)、侵填體、胼胝質(zhì)、防御酶活性、H2O2含量有關。

關鍵詞：木薯;細菌性萎蔫病;抗病種質(zhì);抗病機理

中圖分類號：S435.33? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： Cassava bacterial blight （CBB） is the most serious disease in the cassava plantations of China. In order to clarify the resistance mechanism of cassava germplasms to bacterial blight， this study compared the structure of the leaves of the resistant and susceptible germplasms， and the tissue structure， physiological and biochemical substances changes during interaction with Xanthomonas axonopodis pv. manihotis. Results showed that the total area of stomatal opening， surface waxy matter content， and keratinization thickness were significantly higher in the resistant germplasms than those in the susceptible germplasms. When the cassava plants were infected with X. axonopodis pv. manihotis， the microstructure observation showed that the resistant cassava germplasms could produce more callose than the sensitive germplasms， the cork accumulated and partial tylosis structure was also formed at the infection sites of the resistant germplasms， and the activity of POD， PAL， PPO and the content of H2O2 in the leaves of the resistant cassava germplasms were significantly higher than those of the susceptible germplasms， which showed that the resistance of the three new cassava germplasms was related to the total area of stomatal opening， surface waxy matter content， keratinization thickness， and cork accumulated， partial tylosis structure， callose， the activity of defense enzyme， the content of H2O2.

Keywords： cassava; bacterial blight disease; resistance germplasm; resistance mechanism

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.028

木薯（Manihot esculenta Crantz），是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬灌木狀一年或多年生作物，與馬鈴薯、甘薯并稱世界三大薯類作物，是世界10億人口日常生活所需熱量的主要來源[1]。19世紀20年代左右傳入我國，現(xiàn)主要栽培于廣西、海南、廣東、云南等熱帶及亞熱帶地區(qū)。目前，木薯在我國除了可加工成淀粉和飼料之外，也作為酒精的主要生產(chǎn)原料。與木薯相關的產(chǎn)業(yè)在當?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位，國內(nèi)木薯產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展對保障相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[2]。但國內(nèi)木薯產(chǎn)量不能滿足需求，自2005年開始，中國一直是世界上最大的木薯干片和木薯淀粉進口國[3]。

木薯細菌性萎蔫?。╟assava bacterial blight， CBB）是由地毯草黃單孢木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis，簡稱Xam）侵染引起的檢疫性病害（也稱細菌性枯萎?。Ｄ壳埃摬≡趶V西、廣東、海南等地頻發(fā)流行，部分地區(qū)嚴重為害，是我國木薯種植園區(qū)中危害最嚴重的病害[4]。但在近年來，國內(nèi)外有關木薯細菌性萎蔫病的抗病機理報道較少，主要集中在葉片結(jié)構(gòu)[5-7]、侵染反應[8]、生理生化物質(zhì)[6， 7， 9]及抗病相關基因的挖掘[10-14]。對于該病的防治，種植抗?。ɑ蚰筒。┢贩N是最有效的方法之一，由于對木薯細菌性萎蔫病的抗病機制缺乏研究，嚴重限制了相關工作的開展。

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所通過木薯種質(zhì)收集和有性雜交獲得的雜交后代進行抗病性評價，篩選獲得‘RXC9‘RXC10和‘RXC11等具有較好抗性的新種質(zhì)。為了明確這3份抗病新種質(zhì)的抗病機理，本研究通過比較抗感木薯種質(zhì)葉片的自身組織結(jié)構(gòu)、與Xam互作過程中組織結(jié)構(gòu)和生理生化物質(zhì)變化的差異，以期進一步明確抗病新種質(zhì)的抗病機理，為木薯抗病育種工作提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

木薯種質(zhì)‘RXC9‘RXC10‘RXC11‘SC205‘GR4和‘SC8，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所提供，‘RXC9為優(yōu)良主栽品種與耐病種質(zhì)有性雜交后代，‘RXC10‘RXC11為不同地區(qū)收集種質(zhì)，3份種質(zhì)均由田間自然病圃和人工接種鑒定為抗病;‘SC205‘GR4和‘SC8為感病種質(zhì)[15];細菌性萎蔫病菌菌株XamGX11由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所提供。

過氧化物酶（POD）活性試劑盒（分光法）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性試劑盒（分光法）、多酚氧化酶（PPO）活性試劑盒（微量法）、H2O2含量試劑盒（微量法）均購自蘇州科銘生物技術有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2? 方法

1.2.1? 氣孔密度觀察? 參照李伯凌[7]的氣孔觀察方法。選取各木薯種質(zhì)健康成熟且葉齡一致的葉片進行氣孔觀察，每個種質(zhì)觀察3個視野，重復3次，計算每個視野的氣孔數(shù)，并計算氣孔密度。

1.2.2? 氣孔開口觀察? 使用田間種植約5個月的木薯為材料，在連續(xù)晴天的上午11：00，各木薯種質(zhì)由完全展開的嫩葉往下數(shù)第10葉齡健康葉片，選取生長方向一致，葉片部位一致為材料。采用指甲油印跡法，在下表皮涂上一層薄薄的透明指甲油，待指甲油干后用鑷子輕輕撕下指甲油薄膜，指甲油薄膜倒置貼在干凈的載玻片上。用VHX-5000超景深三維顯微鏡觀察，在1000倍視野下拍照，并隨機測量氣孔長、寬，每個種質(zhì)測量10個氣孔，重復3次。參照蔡金玲[16]的近似橢圓法計算氣孔開口面積（mm2）S=長×寬×π/4。

1.2.3? 葉片表面蠟質(zhì)含量測定? 參照高揚[17]的蠟質(zhì)含量測量方法。選用各木薯種質(zhì)健康成熟且葉齡一致的葉片提取表面蠟質(zhì)含量，每個木薯種質(zhì)不同葉齡葉片重復3次。單位葉片表面積蠟質(zhì)（μg/cm2）=蠟質(zhì)總含量（μg）/葉片總面積（cm2）。

1.2.4? 健康葉片組織結(jié)構(gòu)觀察? 參照李伯凌[7]的石蠟切片方法。選用各木薯種質(zhì)健康成熟且葉齡一致的葉片進行石蠟切片，測量柵欄組織厚度、海綿組織厚度、上表皮厚度、角質(zhì)層厚度與葉片厚度，每個種質(zhì)各測量10次，重復3次，并計算葉片結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）、葉片結(jié)構(gòu)疏松度（SR）。葉片結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）=柵欄組織厚/葉片厚× 100%;葉片結(jié)構(gòu)疏松度（SR）=海綿組織厚/葉片厚×100%。

1.2.5? 發(fā)病葉片組織結(jié)構(gòu)的顯微觀察? 參照李伯凌[7]的石蠟切片方法。選取田間植株成熟葉片且相同葉齡，均為發(fā)病初期的病斑為實驗材料，將葉片剪成1 cm×1 cm大小，立刻浸泡FAA固定液中，抽真空至葉片下沉，室溫固定2 d，觀察病/健處組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.6? 病原菌引起胼胝質(zhì)產(chǎn)生的染色觀察? 參照卜浩宇[18]的胼胝質(zhì)觀察方法。選用健康且生長一致的盆栽木薯，且葉齡一致，采用注射活體接種，接種菌液濃度為（3×107～3×108）CFU/mL，接種健康且剛完全轉(zhuǎn)綠葉背，于2、4、6 d取樣觀察。

1.2.7? 病原菌侵染前后生理生化物質(zhì)測定? 選用健康且生長一致的盆栽木薯，且葉齡一致，采用注射接菌的方法，菌液濃度為（3×107～3×108）CFU/mL，接種相同葉齡健康成熟葉背，注射范圍大小一致，每張葉片接3片裂葉，空白對照注射無菌水，分別于0、2、4、6、8、10 d取樣。實驗具體操作、結(jié)果換算及注意事項參照蘇州科銘生物技術有限公司POD、PAL、PPO活性及H2O2含量試劑盒說明書。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進行統(tǒng)計分析，采用SAS 9.1.3軟件進行差異顯著性檢驗。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 木薯抗感種質(zhì)自身組織結(jié)構(gòu)的差異

2.1.1? 木薯抗感種質(zhì)葉片氣孔形態(tài)特征? 利用I2-KI染色法和指甲油印跡法觀察木薯抗感種質(zhì)葉片氣孔，比較抗感種質(zhì)之間氣孔的差異。由表1可知，在1 mm2的葉面積中，抗病種質(zhì)的氣孔開口總面積顯著大于感病種質(zhì)，而抗感種質(zhì)間氣孔密度、氣孔寬度、氣孔長度和單個氣孔開口面積無顯著差異。表明抗病種質(zhì)葉片單位葉面積氣孔開口總面積與抗病性具有一定的相關性。

2.1.2? 木薯抗感種質(zhì)葉片表面蠟質(zhì)含量? 利用氯仿提取木薯抗感種質(zhì)葉片表面蠟質(zhì)，比較葉片表面蠟質(zhì)含量的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第5葉齡（嫩葉）的表面蠟質(zhì)比第10葉齡（成熟葉）及第20葉齡（成熟葉）的蠟質(zhì)少，抗病種質(zhì)葉片蠟質(zhì)含量顯著高于感病種質(zhì)（圖1）。由此表明，抗病種質(zhì)葉片蠟質(zhì)含量與抗病性具有一定的相關性。

2.1.3? 木薯抗感種質(zhì)健康葉片組織結(jié)構(gòu)? 通過石蠟切片顯微觀察葉片組織，比較木薯抗感種質(zhì)健康葉片組織結(jié)構(gòu)的差異，由表2可知，木薯抗感種質(zhì)上表皮角質(zhì)層厚度呈顯著差異，抗病種質(zhì)上表皮角質(zhì)層均比感病種質(zhì)的厚，其中‘RXC9的上表皮角質(zhì)層最厚，達7.65 μm，各木薯種質(zhì)上表皮角質(zhì)層厚度依次為‘RXC9>‘RXC10>‘RXC11>‘SC8>‘SC205>‘GR4。抗感種質(zhì)之間葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、組織結(jié)構(gòu)緊密度、組織結(jié)構(gòu)疏松度均無顯著差異。綜上結(jié)果表明，抗病種質(zhì)葉片上表皮角質(zhì)層厚與抗病性具有一定的相關性。

2.2? 木薯抗感種質(zhì)與Xam互作過程中組織結(jié)構(gòu)變化的差異

2.2.1? 木薯抗感種質(zhì)發(fā)病葉片組織結(jié)構(gòu)? 利用石蠟切片法觀察比較木薯抗感種質(zhì)田間發(fā)病初期葉片組織結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗病種質(zhì)發(fā)病葉片的病/健界限明顯，在細胞壁、細胞間隙中木栓質(zhì)積累明顯多于感病種質(zhì)，且‘RXC10和‘RXC11病/健處細胞緊密，病原菌未進一步破壞健康組織細胞，而感病種質(zhì)遭到病原菌破壞嚴重（圖2）。此外，觀察到抗病種質(zhì)導管中出現(xiàn)侵填體，而感病種質(zhì)未觀察到。表明抗病種質(zhì)受Xam侵染后，可誘導病/健處組織產(chǎn)生木栓質(zhì)積累并形成部分侵填體結(jié)構(gòu)。

2.2.2? 木薯抗感種質(zhì)受Xam侵染后胼胝質(zhì)沉積? 由圖3可知，經(jīng)染色觀察，當葉片接種Xam第2天時，木薯抗感種質(zhì)均觀察到胼胝質(zhì)的積累，其中，抗病種質(zhì)中的胼胝質(zhì)沉積密集分布于發(fā)病部位，健康部位亦有零星分布，病/健交界處熒光界線明顯，而在感病種質(zhì)中僅零星分布于發(fā)病部位和健康部位，病/健交界處無明顯的熒光界線。當接種第4天時，抗感種質(zhì)葉片胼胝質(zhì)熒光相比第2天均增強，病/健交界處均有明顯的熒光界線，但抗病種質(zhì)胼胝質(zhì)熒光強度明顯比感病種質(zhì)強，且抗病種質(zhì)發(fā)病部位胼胝質(zhì)形成的范圍明顯比感病種質(zhì)的大，并向健康部位擴展，而感病種質(zhì)健康部位無明顯熒光。當接種第6天時，抗感種質(zhì)發(fā)病部位胼胝質(zhì)均出現(xiàn)降解，并向四周逐漸擴散。由此說明，抗感種質(zhì)葉片受Xam侵染后，均可出現(xiàn)胝質(zhì)的積累，其中抗病種質(zhì)發(fā)病部位出現(xiàn)胼胝質(zhì)沉積比感病種質(zhì)多，胼胝質(zhì)是植物細胞壁增強的主要物質(zhì)，其產(chǎn)生與積累有利于提高植物本身對病原菌的防御能力。

2.3? 木薯抗感種質(zhì)與Xam互作過程中生理生化物質(zhì)變化的差異

通過接種Xam處理木薯葉片，比較木薯抗感種質(zhì)葉片組織受Xam侵染前后POD、PAL和PPO活性及H2O2含量變化的差異。由圖4可知，接種前，抗感種質(zhì)之間POD、PAL和PPO活性及H2O2含量無顯著差異。接種后，POD活性變化呈先上升后下降的趨勢，接種第4天，POD酶活性迅速上升，抗病種質(zhì)POD活性明顯高于感病種質(zhì);接種后，抗感種質(zhì)PAL活性明顯提高，呈先上升后下降的趨勢，‘RXC10的PAL活性在接種第6天時達到峰值，‘RXC9‘RXC11葉片的PAL酶活性于接種第8天時達到峰值，在接種第6天后‘RXC9‘RXC10‘RXC11的PAL活性均高于感病種質(zhì);接種后，抗感種質(zhì)PPO活性明顯提高，總體呈先上升后下降的趨勢，抗病種質(zhì)PPO活性較感病種質(zhì)高;接種后，抗感種質(zhì)葉片H2O2含量較接種前明顯提高，呈先上升后下降再上升的波浪式起伏狀，且在接種后第4天和第8天時出現(xiàn)2個高峰。整個侵染過程POD、PAL和PPO活性及H2O2含量變化均高于空白對照，且空白對照POD、PAL和PPO活性及H2O2含量變化保持相對平穩(wěn)。從整體變化來看，抗病種質(zhì)POD、PAL和PPO活性及H2O2含量的增幅和峰值均高于感病種質(zhì)。

3? 討論

氣孔是植物光合作用和呼吸作用與外界進行氣體交換的主要門戶，控制二氧化碳的進出，并且是病原細菌入侵的自然孔口。前人研究，木薯的抗病性與氣孔密度存在一定的相關性[6-7]。葉片表面蠟質(zhì)含量作為葉片抵抗病原菌入侵的外層屏障，前人研究發(fā)現(xiàn)葉片蠟質(zhì)含量與抗病性具有一定的相關性[19]，且組成蠟質(zhì)中的萜類化合物和黃酮類化合物對細菌和真菌具有一定的抑制作用[20]。角質(zhì)層對病原物的入侵發(fā)揮機械阻礙的作用，Isaacson等[21]在番茄角質(zhì)層突變體中發(fā)現(xiàn)，與野生型番茄相比，突變體角質(zhì)層中角質(zhì)含量明顯下降，厚度變薄，并且對微生物感染更加敏感。本研究觀察木薯葉片組織結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，抗病種質(zhì)葉片單位面積氣孔開口總面積、表面蠟質(zhì)含量及角質(zhì)層厚度顯著高于感病種質(zhì)，由此說明，這3個參數(shù)對提高木薯抗病性可能存在促進作用。在本研究中，抗病種質(zhì)單位葉面積氣孔開口總面積比感病種質(zhì)的大，在相同環(huán)境條件下，可能更有利于抗病種質(zhì)光合作用和呼吸作用的物質(zhì)代謝和能量代謝，促進植株抵抗病原的侵染。對于葉部病害，在自然條件下水孔是細菌侵染的自然孔口之一，水孔主要集中在葉尖、葉緣，田間觀察發(fā)現(xiàn)CBB葉可從葉緣發(fā)病，那么水孔的分布、形態(tài)特征是否與木薯抗病性相關，這將有待下一步的研究與驗證。

木栓質(zhì)、侵填體和胼胝質(zhì)等與植物抗病性密切相關，對病原菌入侵起到重要阻礙作用[22-24]。在本研究觀察抗感種質(zhì)葉片病/健處組織時發(fā)現(xiàn)，抗病種質(zhì)不但產(chǎn)生木栓質(zhì)積累，而且形成部分侵填體結(jié)構(gòu)，而感病種質(zhì)病/健處周圍組織遭到嚴重破壞，未觀察到明顯的木栓質(zhì)積累和侵填體結(jié)構(gòu);此外，本研究比較抗感種質(zhì)在Xam侵染2～6 d后胼胝質(zhì)沉積的差異時發(fā)現(xiàn)，抗病種質(zhì)形成的胼胝質(zhì)比感病種質(zhì)多，另外發(fā)現(xiàn)，病原菌的侵染并沒有系統(tǒng)性地導致胼胝質(zhì)的分布，這可能是木薯對于Xam的侵染反應存在一定的延時性，當Xam已經(jīng)完全侵入木薯葉片，病原菌與寄主建立寄生關系后，才產(chǎn)生相應的寄主抗性反應，以阻止Xam進一步的擴展。綜上所述，說明抗病種質(zhì)與Xam互作可誘導產(chǎn)生木栓質(zhì)積累、侵填體結(jié)構(gòu)及胼胝質(zhì)積累，對抵御Xam侵染具有一定的作用，進一步說明抗病種質(zhì)的抗病性是由木栓質(zhì)、侵填體和胼胝質(zhì)等多種誘導結(jié)構(gòu)共同或相繼作用的結(jié)果，這3個參數(shù)可作為木薯抗病性鑒定的輔助指標。

POD、PPO和PAL是植物抗病原菌侵染的重要防御酶。POD與木質(zhì)素、木栓質(zhì)的合成相關，并參與4-羥基肉桂酸，3，4-二羥基肉桂酸和4-羥基-3-甲氧基肉桂酸的沉積[25-26];PPO可鈍化病原菌的蛋白和酶活性[27];PAL催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶和限速酶，并合成異黃酮類植保素、木質(zhì)素的關鍵酶[28-30]。本研究對木薯抗感種質(zhì)受Xam侵染后POD、PPO和PAL活性進行測定，發(fā)現(xiàn)3個防御酶的活性均上升，呈先上升后下降的趨勢，且抗病種質(zhì)的防御酶活性的增幅和峰值均高于感病種質(zhì)。該結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致[6-7]，僅PPO活性變化與樊春俊[6]研究的PPO活性變化趨勢存在一定的差異，這可能是由于所選木薯種質(zhì)在遺傳背景上存在差異。POD、PPO和PAL活性的提高可增強木薯對Xam侵染的抵抗力，因此可將這3種防御酶作為木薯抗病性鑒定的輔助指標。

H2O2是植物抗病防衛(wèi)反應中的重要物質(zhì)，可對病原物產(chǎn)生直接的傷害，也參與了如細胞壁木質(zhì)化、富含羥脯胺酸蛋白的合成，并可作為細胞過敏性壞死反應的觸發(fā)信號。大量的研究表明，寄主與病原物互作中，H2O2的積累與寄主抗病性相關[31-33]。本研究比較木薯抗感種質(zhì)受Xam侵染后H2O2含量變化的差異，發(fā)現(xiàn)抗病種質(zhì)的H2O2含量明顯高于感病種質(zhì)，說明H2O2的積累對提高木薯抗病性起一定的作用。H2O2含量在接種后第4天和第8天出現(xiàn)峰值，可能是木薯-Xam互作所導致的波動，推測此時H2O2作為細胞過敏性壞死反應的觸發(fā)信號，這將有待進一步研究。

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責任編輯：謝龍蓮