方思齊 李澤棟 王記圓 何其光 李瀟 劉文波 張宇 林春花 繆衛(wèi)國

摘? 要：炭疽菌（Colletotrichum siamense）是橡膠樹等多種熱帶作物炭疽病的主要病原。雙組分系統(tǒng)（two component system）在病原真菌中參與菌體對外界環(huán)境變化的適應、耐藥性和毒力的調控。該系統(tǒng)包括感受器和應答調節(jié)蛋白，SSK1（SLF-interacting SKP1-like1）是雙組分系統(tǒng)中的應答調節(jié)蛋白。為了了解炭疽菌中SSK1互作蛋白，本研究克隆獲得橡膠樹炭疽菌的一個應答調節(jié)蛋白編碼基因CsSSK1，大小為2750 bp，cDNA大小為2190 bp，編碼729個氨基酸，包含1個內含子，具有1個cheY同系物接收結構域和10個復雜結構。并利用酵母雙雜交技術，在橡膠樹炭疽菌cDNA文庫中對CsSSK1互作蛋白進行篩選，共篩選到10個互作蛋白，分別為轉酮醇酶、金屬內酰胺酶、鋅乙醇脫氫酶、泛素亞型X1、微管蛋白以及5個未知或假定蛋白。該結果為進一步研究CsSSK1的功能、互作蛋白及調節(jié)機制提供基礎。

關鍵詞：橡膠樹炭疽菌;雙組分系統(tǒng);應答調節(jié)蛋白SSK1;互作蛋白

中圖分類號：S763.7? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： Colletotrichum siamense is the main pathogen of anthracnose of rubber tree or other tropical crops. A two component system is involved in the adaptation of fungi to external environmental changes， drug resistance and virulence in pathogenic fungi. In pathogenic fungi， it includes receptors and SSK1 （SLF-interacting SKP1-like1） response regulatory protein components. To obtain proteins interacting with SSK1 in C. siamense， a homologue gene CsSSK1， 2750 bp long with cDNA 2190 bp， was cloned. It contained a cheY homologs receiving domains and 10 complex structures. Then the pGBKT7-CsSSK1 vector was constructed. By an yeast two hybrid system， ten proteins， including transketolase， β-lactamase， alcohol dehydrogenase， ubiquitin， tubulin and 5 unknown or hypothetical proteins， maight interacting with CsSSK1， were identified after sequencing and bioinformatics analysis. This result would provide a basis for further study of the functions， interaction proteins and regulatory mechanism of CsSSK1.

Keywords： Colletotrichum siamense; two component system; response regulatory protein SSK1; interaction protein

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.027

雙組分系統(tǒng)（two-component signaling system， TCS）是廣泛存在于細菌、真菌、粘菌及高等植物的一類信號傳導系統(tǒng)[1]。在病原真菌中，該途徑參與細胞新陳代謝和生理生化過程，包括細胞能動性、細胞周期的控制、發(fā)育、對脅迫的耐受性、以及致病細菌和真菌的致病性過程等[1]。真核生物的雙組分系統(tǒng)通常由3個部分組成：組氨酸激酶（histidine kinase， HK）、組氨酸基團的磷酸轉移蛋白（HPt）、應答調節(jié)蛋白（response regulator， RR）[2]。例如，模式生物酵母的雙組分系統(tǒng)由Sln1-Ypd1-Ssk1組成，Sln1作為雜合型組氨酸激酶感受器（HK），需要Ypd1（HPt）和Ssk1（RR）來繼續(xù)磷酸基團的轉移[3]。已有研究證明雙組分信號系統(tǒng)對于病原真菌Aspergillus fumigatus、Candida albicans、Cryptococcus neoformans、Blastomyces dermatitidis和Histoplasma capsulatum的毒性和抗藥性的重要性[4]。

SSK1作為雙組分系統(tǒng)中的應答調節(jié)蛋白（RR），在真核細胞中充當接受和傳遞信號的功能，即將雙組分系統(tǒng)中的磷酸基團從Ypd1p轉移至下游HOG MAPK（high-osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase）途徑中的MAPKKK（mitogen-activated protein kinase kinase kinase）的角色[5-7]。HOG MAPK信號途徑在真菌誘導脅迫反應、信息素反應、細胞形態(tài)恢復、致病性和抗藥性等方面都起著重要作用[8-9]。該信號途徑主要由MAPK（Hog1p）、MAPKK（Pbs2p）、和MAPKKK（Ste11p，Ssk2p和Ssk22p）組成[8]。已有研究顯示，SSK1與病原菌的毒力和對各種脅迫的反應有關。例如，在稻瘟病病原Pyricularia oryzae中，雙組分系統(tǒng)2個RR基因（MoSSK1和MoSKN7）共同調控稻瘟菌對于滲透壓和咯菌腈的敏感性，還參與病原毒性[1， 9-10]，在病原真菌Botrytis cinerea中的SSK1與毒性相關[10];Beauveria bassiana的SSK1也與病原菌毒力和對滲透壓的抗性相關[11]。但也有研究報道SSK1在不同真菌中功能有差異，如在Kluyveromyces lactis中，SSK1缺失后，突變體對高滲透壓的敏感性沒有發(fā)生改變[12]，然而，在Candida albicans中，SSK1缺失突變體比野生型對高鹽具有更高的敏感性[4]。在Vertilillium dahliae中，該基因還與病原菌的壓力脅迫反應、黑色素的合成和致病力相關[13]。

橡膠樹炭疽病是橡膠樹葉部的重要病害，炭疽菌（Colletotrichum siamense）是我國橡膠樹炭疽病的主要病原種類[14-15]，也是熱帶作物炭疽病的主要病原種類[16]。項目組前期研究顯示橡膠樹炭疽菌HOG MAPK途徑參與調控菌體對滲透壓和咯菌腈敏感性的功能[17];已有研究表明：SSK1作為傳遞信號至HOG MAPK途徑的角色，且也參與了病原真菌在壓力脅迫、藥劑敏感性、菌體毒性類似功能[1， 9-12]。二者存在何種關系？SSK1在菌體內是否有其他互作蛋白？是否調控其他蛋白的功能等方面知之甚少?；谇捌谝呀?jīng)構建了橡膠樹的炭疽菌（C. siamense）cDNA酵母文庫的基礎上，本研究克隆獲得炭疽菌SSK1同源基因CsSSK1基因，構建誘餌載體pGBKT7-CsSSK1，利用酵母雙雜交技術從橡膠樹炭疽菌cDNA文庫中篩選互作蛋白，該研究結果可為進一步了解CsSSK1的互作蛋白及功能，了解真菌雙組分系統(tǒng)的功能，以及菌體在壓力脅迫、藥劑敏感性、菌體毒性的調控機理奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株及質粒? 橡膠樹炭疽菌（C. siamense）HN08菌株分離自海南省瓊中新進農場橡膠樹病葉，由本實驗室分離鑒定保存[15];大腸桿菌Escherichia coli DH5α和載體PMD-18T購自大連TaKaRa公司;酵母感受態(tài)細胞（Y2HGold Chemically Competent Cell）購自于上海唯地生物技術有限公司;質粒pGADT7、pGBKT7由本實驗室保存。橡膠樹炭疽菌酵母雙雜交cDNA文庫由本實驗室構建保存。

1.1.2? 試劑? 限制性內切酶（EcoRⅠ，BamHⅠ）購自寶生物工程（大連）有限公司;植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）購自天根生化科技（北京）有限公司;凝膠DNA小量回收試劑盒（Hipure Gel pure DNA Mini Kit）購自海南立菲特生物科技有限公司;高保真DNA聚合酶、蛋白質Marker、DNA Marker、RNA反轉錄試劑盒One-step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super Mix購自北京全式金生物技術有限公司;質粒提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司;T4 DNA連接酶購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.1.3? 培養(yǎng)基? 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，固體加入瓊脂18～20 g/L。

完全培養(yǎng)基（CM）：酸水解酪蛋白1 g/L，蔗糖10 g/L，酵母提取物6 g/L，固體加入瓊脂18～20 g/L。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，固體加入瓊脂15～18 g/L，pH調節(jié)至7.5。

酵母選擇營養(yǎng)二缺培養(yǎng)基（SD/-Trp-Leu）：酵母氮源6.7 g/L，Trp/-Leu Droupout 0.64 g/L，葡萄糖20 g/L，調節(jié)pH到5.8。

酵母選擇營養(yǎng)四缺培養(yǎng)基（SD/-Trp-Leu- His-Ade）：酵母氮源6.7 g/L，Trp/-Leu/-His/-Ade Droupout 0.64 g/L，葡萄糖20 g/L，調節(jié)pH到5.8。

酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPDA）：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸腺嘌呤0.03 g/L。

1.2? 方法

1.2.1? 橡膠樹炭疽菌C. siamense CsSSK1基因的克隆和分析? 橡膠樹炭疽菌HN08菌株的總RNA提取使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒[購自于天根生化科技北（北京）有限公司]，按照說明書進行提取。對提取產物進行純度和完整性的檢測，符合目標要求的RNA按照cDNA Synthesis SuperMxi（全式金公司）操作說明書反轉錄合成cDNA備用。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SSK1序列（Gene ID： 850692），采用本地BLAST方法，從橡膠樹炭疽菌基因組中搜索獲得同源序列，根據(jù)序列設計引物對pGBKT7-SSK1-F（5-CCGGAATTCATGGGTGCC CACAAGCCACA-3）/pGBKT7-SSK1-R（5-CGC GGATCCCTACTTCGGTATTACGCTGCGGAAC-3）。以橡膠樹炭疽菌cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR產物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。并將PCR產物回收連接載體PMD-18T獲得重組質粒，連接產物轉化感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)過PCR驗證正確后挑取陽性轉化子，送往深圳華大基因研究院測序，重復3次。

比較分析DNA和cDNA序列，了解外顯子和內含子，并與GenBank中同源序列進行分析，利用NCBI網(wǎng)站上的BLASTx軟件完成。cDNA序列翻譯成氨基酸序列，利用在線的簡單模塊構架搜索工具（simple modular architecture research tool， SMART; http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/ set_mode.cgi）對氨基酸序列進行結構功能域分析[18]。

1.2.2? pGBKT7-CsSSK1誘餌載體的構建? 提取上文中測序成功的陽性轉化子質粒用限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，將酶切下來的CsSSK1片段使用T4 DNA連接酶[購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司]與已經(jīng)用限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切完成的pGBKT7載體在16 ℃連接過夜，轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，并對驗證正確的陽性克隆進行酶切驗證。

1.2.3? 誘餌表達載體毒性及自激活驗證? 將重組的載體pGBKT7-CsSSK1和pGADT7轉入酵母感受態(tài)Y2HGold中，涂布于SD/-Trp-Leu和SD/-Trp- Leu-His-Ade營養(yǎng)缺失培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。

1.2.4? 酵母雙雜交文庫篩選與回復試驗驗證? 將提取的pGBKT7-CsSSK1質粒轉入酵母感受態(tài)Y2HGold中，并挑選在SD-Trp平板中生長正常的酵母單克隆，進行PCR驗證。挑取轉有重組質粒的Y2HGold酵母菌株單菌落接種于50 mL的SD-Trp液體培養(yǎng)基中，把5 mL轉有誘餌基因的Y2HGold酵母菌液和1 mL橡膠樹膠孢炭疽菌cDNA文庫（Y187）合并在一個2 L的錐形瓶中，并加入45 mL的2×YPDA，30 ℃ 40 r/min培養(yǎng)24 h。用50 mL離心管1000 g離心10 min，收集菌體后用10 mL的0.5×YPDA溶液（卡納終濃度50 ?g/mL）重懸菌體，涂布于SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培養(yǎng)基上，3～5 d后挑選正常生長的酵母單克隆，轉板到SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培養(yǎng)基上，重復3次。3次轉板后仍正常生長的酵母單克隆用于做PCR驗證。提取酵母質粒驗證后將陽性克隆質粒轉入大腸桿菌，送華大公司測序。去除重復的單克隆后將正確的菌種保存于-80 ℃冰箱。提取測序正確的互作蛋白質粒與誘餌載體pGBKT7-CsSSK1質粒共同轉化酵母感受態(tài)Y2HGold中，涂布在SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d。

2? 結果與分析

2.1? 橡膠樹炭疽菌CsSSK1基因的克隆及序列分析

以橡膠樹炭疽菌C. siamense HN08總RNA反轉錄獲得的cDNA和DNA為模板，分別擴增獲得目的條帶（圖1）。測序后得到橡膠樹炭疽菌CsSSK1基因序列，序列登錄號為ID：MN624171。測序分析結果顯示，擴增獲得的CsSSK1基因序列包含完整的開放閱讀框架數(shù)據(jù)，DNA序列大小為2750 bp，cDNA序列大小為2190 bp，該基因含有1個內含子，編碼729個氨基酸，含有1個cheY同系物接收結構域和10個復雜結構，cheY結構域包含1個被組氨酸激酶同源物磷酸化的磷酸受體位點（圖2）。

2.2? 誘餌載體pGBKT7-CsSSK1構建及重組質粒自激活檢測

將擴增得到的CsSSK1目的片段，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切得到目的片段，T4連接酶連接載體pGBKT7。用通用引物pGBKT7-F（5-TAATAC GACTCACTATAGGGC-3）/pGBKT7-R（5-AGATG GTGCACGATGCACAG-3）進行菌落PCR驗證，得到目的片段大小約為2190 bp。進行EcoRⅠ和BamHⅠ酶切驗證（圖3），再經(jīng)測序驗證后保存陽性克隆待用。

將重組誘餌載體pGBKT7-CsSSK1與pGADT7空載體共轉化酵母感受態(tài)Y2HGlod，涂布于SD/-Trp-Leu缺陷培養(yǎng)基平板上長出酵母菌落（圖4A），說明pGBKT7-CsSSK1能夠在酵母菌株Y2HGold中成功表達，表達產物對宿主酵母菌沒有產生毒性。SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長（圖4B），說明pGBKT7- CsSSK1沒有自激活現(xiàn)象。

2.3? 酵母文庫的篩選和陽性克隆測序分析

以pGBKT7-CsSSK1為誘餌蛋白，從炭疽菌cDNA酵母文庫中篩選陽性克隆，在SD/-Trp-Leu- His-Ade缺陷培養(yǎng)基上重復篩選3次，得到27個陽性克隆。提取這些陽性克隆的DNA為模板，用引物對pGBKT7-F/R進行PCR驗證，結果顯示擴增出條帶的單克隆有23個，擴增獲得的片段大小在500～2000 bp之間（圖5）。

將23個陽性克隆的酵母質粒，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞內進行擴增，進而提取質粒送華大測序。對測序結果進行分析，排除重復序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blastx分析，結果顯示獲得10個候選互作蛋白，它們分別為：轉酮醇酶（transketolase）、金屬內酰胺酶（β-lactamase）、鋅乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase）、泛素亞型X1（ubiquitin）、微管蛋白（tubulin）以及5個未知或假定蛋白（表1）。

2.4? 酵母雙雜交點對點回復驗證

將酵母雙雜交得到的10個陽性克隆提取質粒，逐一與誘餌載體pGBKT7-CsSSK1質粒共同轉化酵母感受態(tài)Y2HGlod后，結果顯示篩選到的10個陽性克隆都可以在SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培養(yǎng)基正常生長。說明10個陽性克隆在酵母體內與CsSSK1產生互作（圖6）。

3? 討論

炭疽病是橡膠樹重要葉部病害之一，國內外對橡膠樹炭疽菌致病性和抗藥性分子機理的研究基礎相對薄弱。SLN1-YPD1-SSK1級聯(lián)反應是釀酒酵母中參與滲透協(xié)調的雙組分系統(tǒng)。在病原真菌中，該系統(tǒng)還參與耐藥性和毒力的調控[19]。組氨酸激酶（SLN1）感受外界壓力自磷酸化，然后將磷酸基團傳遞給磷酸轉移蛋白（YPD1），再將磷酸基團傳遞給應答調節(jié)蛋白（SSK1）?，F(xiàn)有的研究多在轉錄水平研究SSK1調控哪些基因？這些基因參與哪些功能？研究表明，SSK1在真核細胞中充當接受和傳遞信號的功能，在高滲脅迫時，SSK1可迅速發(fā)生磷酸化，并激活下游HOG MAPK級聯(lián)反應，從而誘導細胞內甘油合成，促使細胞適應滲透壓[19-20]。在這個過程中，已證實SLN1和SSK1都可與YPD1疏水區(qū)結合[20]。此外，在釀酒酵母中，用DNA微列陣方法，鑒定出SSK1還可以調控細胞壁合成相關基因，如AHP1、HSP12、PYC2等，進而調控細胞對氧化脅迫的調節(jié)[10]。但除了YPD1外，目前未見關于SSK1與其他蛋白直接互作的報道。本研究克隆了以炭疽菌CsSSK1基因，并以該基因編碼蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交技術對橡膠樹炭疽菌cDNA文庫進行篩選，結果顯示獲得的互作蛋白有轉酮醇酶、金屬β-內酰胺酶、乙醇脫氫酶、微管蛋白及泛素亞型X1等。該結果表明SSK1作為雙組分系統(tǒng)的應答調節(jié)蛋白，不僅可以與YPD1互作，通過轉移磷酸基團調控HOG MAPK途徑，可能還與其他蛋白相互作用存在其他功能，該研究結果為進一步研究CsSSK1的功能奠定基礎。

轉酮醇酶（transketolase）在戊糖磷酸酸循環(huán)以及光合成的還原型戊糖磷酸循環(huán)中起著重要作用[21]。有研究報道轉酮醇酶在稻瘟病的侵染中起到至關重要的作用，缺乏轉酮醇酶的病原菌可以順利產生附著胞并成功侵染，病原菌可以在細胞間存活，但是其有絲分裂過程變慢，影響病原菌在寄主細胞內維持營養(yǎng)生長以及在細胞間的移動，加入外源ATP后此過程恢復正常[22]。本研究初步顯示CsSSK1可與轉酮醇酶發(fā)生體外互作，CsSSK1是否通過與轉酮醇酶互作，影響病原菌的侵染和生長，值得深入研究。

金屬β-內酰胺酶是一種水解酶，在細菌中研究較多，與細菌耐藥機制有關，可以催化水解β-內酰胺類抗生素的特征性四元環(huán)，進而使β-內酰胺類結構發(fā)生改變產生無效產物，最終導致該類抗生素失去抗菌活性[23]。已有研究證明SSK1對病原真菌的抗藥性有一定影響[13]，本研究初步顯示CsSSK1與金屬β-內酰胺酶互作。病原真菌炭疽菌是否也通過SSK1調控金屬β-內酰胺酶活性，從而調控菌體的抗藥性，需要進一步進行驗證。

除此之外，乙醇脫氫酶、微管蛋白、泛素亞型X1為篩選獲得的假定蛋白，它們與SSK1是否確實存在互作關系？互作的生物學意義又是什么？都有待進一步驗證。本研究僅僅是通過酵母雙雜交方法獲得的互作蛋白，由于酵母是簡單的真核生物，其蛋白質加工、修飾類型及程度與炭疽菌可能存在差異，因此酵母雙雜的結果只是提示互相作用的可能性，后續(xù)還需要通過Co-IP、BiFC等技術對它們的互作性進行驗證。該研究結果可為進一步開展SSK1互作蛋白及豐富其功能研究奠定基礎。

參考文獻

劉凱悅. 雙組分系統(tǒng)基因MoSLN1和MoSKN7在稻瘟病菌生長發(fā)育與致病過程中的功能研究[D]. 南京： 南京農業(yè)大學， 2011.

Bahn Y S. Master and commander in fungal pathogens： The two-component system and the HOG signaling pathway[J]. Eukaryotic Celly， 2008， 7（12）： 2017-2036.

吳雪昌， 胡森杰， 酵母HOG-MAPK途徑[J]. 細胞生物學雜志， 2005， 27（3）： 247-252.

Oide S， Liu J， Yun S-H， et al. Histidine kinase two-compo nent response regulator proteins regulate reproductive development， virulence， and stress responses of the fungal cereal pathogens Cochliobolus heterostrophus and Gibberella zeae[J]. Eukaryotic Cell， 2010， 9（12）： 1867-1880.

Shor E， Chauhan N， Goldman W E. A. Case for two-compo nent signaling systems as antifungal drug targets[J]. PLoS Pathogens， 2015， 11（2）： e1004632.

Posas F， Saito H. Activation of the yeast SSK2 MAP kinase kinase kinase by the SSK1 two-component response regulator[J]. The EMBO Journal， 1998， 17（5）： 1385-1394.

Porter S W， West A H. A common docking site for response regulators on the yeast phosphorelay protein YPD1[J]. BBA – Proteins and Proteomics， 2005， 1748（2）： 138-145.

Rispail N， Soanes D M， Ant C， et al. Comparative genomics of MAP kinase and calcium-calcineurin signalling components in plant and human pathogenic fungi[J]. Fungal Genetics and Biology， 2009， 46（4）： 287-298.

Baltanás R， Bush A， Couto A， et al. Pheromone-induced morphogenesis improves osmoadaptation capacity by activating the HOG MAPK pathway[J]. Science Signaling， 2013， 6（272）： 26.

Yan L， Yang Q， Jiang J， et al. Involvement of a putative response regulator Brrg-1 in the regulation of sporulation， sensitivity to fungicides， and osmotic stress in Botrytis cinereal[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2011， 90（1）： 215-226.

Horie T， Tatebayashi K， Yamada R， et al. Phosphorylated SSK1 prevents unphosphorylated SSK1 from activating the SSk2 mitogen-activated protein kinase kinase kinase in the yeast high-osmolarity glycerol osmoregulatory pathway[J]. Molecular and Cellular Biology， 2008， 28（17）： 5172-5183.

Maeda T， Takekawa M， Saito H. Activation of yeast PBS2 MAPKK by MAPKKKs or by binding of an SH3-containing osmosensor[J]. Science， 1995， 269（5223）： 554-558.

Zheng J Y， Tang C， Deng C L， et al. Involvement of a response regulator VdSSK1 in stress response， melanin biosynthesis and full virulence in Verticillium dahliae[J]. Frontiers in Microbiology， 2019， 10： 606.

林春花， 楊? 歡， 趙曉宇， 等. 海南橡膠樹炭疽菌Colletotrichum siamense和C. fructicola的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（1）： 129-136.

Liu X B， Li B X， Cai J M， et al. Colletotrichum species causing anthracnose of rubber trees in China[J]. Scientific Reports， 2018， 8（1）： 10435.

Sharma G， Pinnaka A K， Shenoy B D. Resolving the Colletotrichum siamense species complex using ApMat marker[J]. Fungal Diversity， 2015， 71（1）： 247-264.

Lin C H， Huang G X， Zheng F C， et al. Functional characterization of CgPBS2， a MAP kinase kinase in Colletotrichum gloeosporioides， using osmotic stress sensitivity as a selection marker[J]. Eruopean Journal of Plant Pathology， 2018， 152（3）： 801-813.

Letunic I， Bork P. 20 years of the SMART protein domain annotation resource[J]. Nucleic Acids Research， 2018， 46（D1）： 493-496.

Chauhan N， Inglis D， Roman E， et al. Candida albicans response regulator gene SSK1 regulates a subset of genes whose functions are associated with cell wall biosynthesis and adaptation to oxidative stress[J]. Eukaryot Cell， 2003， 2（5）： 1018-1024.

Branscum K M， Menon S K， Foster C A， et al. Insights revealed by the co-crystal structure of the Saccharomyces cerevisiae histidine phosphotransfer protein Ypd1 and the receiver domain of its downstream response regulator Ssk1[J]. Protein Science， 2019， 28（12）： 2099-2111.

Fernandez J， Marroquin-Guzman M， Wilson R A. Evidence for a transketolase-mediated metabolic checkpoint governing biotrophic growth in rice cells by the blast fungus Magnaporthe oryzae[J]. PLoS Pathogens， 2014， 10（9）： 1004354.

趙? 斌， 霍靜倩， 張? 哲， 等 以植物轉酮醇酶為靶標的除草活性物質篩選及其生物活性測定[C]//病蟲害綠色防控與農產品質量安全——中國植物保護學會2015年學術年會論文集， 北京： 中國農業(yè)科學技術出版社， 2015： 672.

鞠林成， 史亞興， 苗東旭， 等. 金屬β內酰胺酶及其抑制劑的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述， 2019， 25（6）： 1222-1227.

責任編輯：謝龍蓮