孟倩倩 孫世偉 王政 高圣風 茍亞峰 劉愛勤

摘? 要：為篩選黃翅絹野螟（Diaphania caesalis）逆境脅迫下穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，使該蟲抗逆基因的定量表達分析標準化。本研究根據(jù)黃翅絹野螟成蟲轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果，利用qPCR技術分析了9個分別編碼ACT、β-TUB、GAPDH、G6PDH、RPS3a、RPL13a、EF1α、EIF4A、β-ACT的候選內(nèi)參基因在溫度及藥劑脅迫下mRNA的表達水平，并通過geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder軟件（算法）分析各基因的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：溫度脅迫下，geNorm分析表明ACT和RPS3a為表達最穩(wěn)定的基因，NormFinder和BestKeeper分析結(jié)果表明GAPDH和EIF4a的表達最穩(wěn)定。藥劑脅迫下，geNorm和NormFinder分析結(jié)果均表明EIF4a和ACT為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而BestKeeper分析結(jié)果表明GAPDH和RPS3a為最穩(wěn)定內(nèi)參基因。全樣品條件下，geNorm和NormFinder分析結(jié)果相似，表明EF1α和EIF4a為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，BestKeeper表明GAPDH和RPL13a為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。根據(jù)geNorm軟件成對變異值Vn/Vn+1<0.15的原則，確定3種條件下對靶標基因表達進行標準化時需引入的內(nèi)參基因的數(shù)目均為2個。利用在線分析軟件RefFinder綜合評價上述3個分析結(jié)果，最終確定溫度脅迫下最合適的內(nèi)參基因為EIF4A和GAPDH，藥劑脅迫下最適內(nèi)參基因為ACT和EIF4A，全樣品下最適內(nèi)參基因為EF1α和EIF4A。本研究結(jié)果為利用qPCR技術分析黃翅絹野螟溫敏及抗藥性相關基因表達差異提供了穩(wěn)定的內(nèi)參基因，進而為基因的功能分析奠定了基礎。

關鍵詞：黃翅絹野螟;溫度脅迫;藥劑脅迫;內(nèi)參基因;穩(wěn)定性

中圖分類號：S433.4? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： In order to normalize the expression of stress resistant genes， this study aims to select the reference genes stably expressed of Diaphania caesalis under different stress conditions. According to the annotation information of the transcriptome of D. caesalis， the mRNA expression levels of nine candidate genes predicted to code proteins of ACT， β-TUB， GAPDH， G6PDH， RPS3a， RPL13a， eEF1α， EIF4A and β-ACT， were analyzed by qPCR under temperature and pesticide stress. The stability of each gene was evaluated by geNorm， NormFinder， BestKeeper and RefFinder softwares （algorithms）， respectively. In temperature stress， the most stable genes identified by geNorm were ACT and RPS3a. However， NormFinder and BestKeeper recommended that GAPDH and EIF4a were the most stable genes. In pesticide stress， EIF4a and ACT were ranked as the most stable genes by geNorm and NormFinder， but GAPDH and RPS3a were recognized as the most suitable reference genes referred from the analysis with software of BestKeeper. In all samples， the results analyzed by the softwares of geNorm and NormFinder were similar， which both found that the ideal internal control were EF1α and EIF4a. But GAPDH and RPL13a were considered as the most stable genes based on the result of BestKeeper. Complying with the principle of Vn/Vn+1<0.15 from geNorm software， the two internal reference genes should be introduced in the three treatments above for normalization of target gene expression， respectively. The online software of RefFinder was used to comprehensively evaluate the results of the three softwares. Finally， the most suitable reference genes in temperature stress were confirmed as EIF4A and GAPDH. ACT and EIF4A were determined as the most stable reference genes in pesticide stress， and EF1α and EIF4A were recommended as the most suitable reference genes in all samples. This study would provide suitable internal reference genes for qPCR analysis of the expression of target genes associated to temperature sensitivity and insecticide resistance. Furthermore， it could also lay the foundation for gene functional analysis.

Keywords： Diaphania caesalis; temperature stress; pesticide stress; reference gene; stability

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.026

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qPCR）因其靈敏度高、重復性好、特異性強和快速準確等技術優(yōu)點，被廣泛應用于基因的特異性擴增、mRNA表達水平分析、限制性片段長度多態(tài)性分析和單核苷酸多態(tài)性分析等研究領域[1]。然而，qPCR結(jié)果的準確性和可靠性易受生物信號、引物擴增效率，模板的產(chǎn)量和質(zhì)量等因素影響[2-5]，需要引入穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)Χ拷Y(jié)果進行校正和標準化處理，以減小實驗誤差，保證結(jié)果的準確性和可靠性[6]。因此，選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因是進行qPCR過程中至關重要的一步。一般認為，理想化的內(nèi)參基因應是維持細胞正常生命代謝的管家基因，它們在生物和非生物條件下都能相對穩(wěn)定表達[7-9]。傳統(tǒng)的管家基因包括18S核糖體RNA基因（18S rRNA）、微管蛋白基因（tu bulin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase）和肌動蛋白基因（actin）等，它們常被作為內(nèi)參基因用于許多物種不同處理條件下基因的表達分析[10-12]。但越來越多的研究表明，并沒有絕對穩(wěn)定的內(nèi)參基因能在不同物種、不同組織及不同實驗條件下均穩(wěn)定表達，它們只能在特定物種或?qū)嶒灄l件下相對穩(wěn)定的表達[13-16]。因此，在利用qPCR對某物種基因進行轉(zhuǎn)錄水平表達分析前，需對候選內(nèi)參基因在特定條件下的表達穩(wěn)定性進行評估，以選擇最適內(nèi)參基因。

黃翅絹野螟（Diaphania caesalis）屬鱗翅目（Lepidoptera），螟蛾科（Pyralidae），絹野螟屬（Diaphania）。主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布在海南、云南、廣西、廣東等?。▍^(qū)）。該蟲以幼蟲鉆蛀取食菠蘿蜜（Artocarpus heteroyllus Lam.）、榴蓮蜜（Artocarpus champeden Spreng.）和面包果（Artocarpus altilis Fosberg.）等富含淀粉的“木本糧食作物”[17-19]。蛀蟲果易引起果蠅幼蟲進入取食，使果實受害部位變褐腐爛，導致果實發(fā)育不良、脫落，嚴重影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，造成的經(jīng)濟損失達30%～50%。該蟲在海南全年都有發(fā)生，且無明顯越冬現(xiàn)象，一年發(fā)生約8代，7—9月為發(fā)生高峰期[20-22]。目前關于黃翅絹野螟的研究主要包括其發(fā)生為害特點、分布情況及天敵種類等[19， 23-24]。尚無黃翅絹野螟qPCR內(nèi)參基因的篩選研究。隨著研究的深入，基因表達水平對于研究黃翅絹野螟的寄主選擇、適應性、抗藥性和神經(jīng)調(diào)節(jié)等相關基因的調(diào)控機理方面具有重要作用。因此，在分析黃翅絹野螟基因表達水平之前，首先需評估不同處理條件下內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性。本研究擬檢測黃翅絹野螟9個候選內(nèi)參基因在不同溫度和藥劑脅迫下mRNA的表達水平，并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4個軟件（算法）分析溫度脅迫、藥劑脅迫和全樣品條件下各候選基因的穩(wěn)定性，篩選出不同處理情況下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，以期為黃翅絹野螟溫度和藥劑脅迫下基因表達水平的研究提供合適的內(nèi)參基因。

1? 材料與方法

1.1? 供試昆蟲

黃翅絹野螟采自海南省瓊中縣菠蘿蜜種植園（19°3′24″N， 109°50′58″E），室內(nèi)飼養(yǎng)2代后作為供試昆蟲。幼蟲食料為未施農(nóng)藥的菠蘿蜜葉片，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所試驗基地（18°44′29″N， 110°12′11″E）。將采集的幼蟲置于保鮮盒中飼喂，待羽化為成蟲后轉(zhuǎn)入網(wǎng)籠，喂食10%的蜂蜜水。向籠中放置菠蘿蜜葉片或鮮果收集卵粒，待孵化后挑出幼蟲至干凈的保鮮盒內(nèi)，放入新鮮菠蘿蜜葉片進行繼代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，相對濕度70%±5%，光周期14 L∶10 D。

1.2? 溫度處理

設置低溫處理4 ℃、高溫處理37 ℃、超高溫處理42 ℃及對照處理26 ℃。分別將黃翅絹野螟2～3日齡成蟲置于上述處理下刺激4 h，室溫26 ℃恢復30 min，每個處理3頭成蟲，設置3個重復，置于液氮?80 ℃下凍存，供提取總RNA。

1.3? 藥劑處理

根據(jù)黃翅絹野螟防治常用藥劑，設置高效氯氟氰菊酯（lambda-cyhalothrin）進行藥劑處理。采用藥膜法處理黃翅絹野螟成蟲，具體方法如下：將2.5%高效氯氟氰菊酯水乳劑（安徽省陰山藥業(yè)有限公司）用丙酮依次稀釋40 000、60 000和80 000，吸取5 mL稀釋好的藥液滴入三角瓶中，迅速順時針轉(zhuǎn)動三角瓶，確保藥劑均勻形成藥膜，待丙酮揮發(fā)后放入6頭2～3日齡成蟲處理4 h，每個處理重復3次，對照組為未經(jīng)藥劑處理的黃翅絹野螟成蟲，將對照和處理樣本置于液氮?80 ℃下凍存，供總RNA提取。

1.4? 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

采用TRIzol Reagent試劑（Invitrogen公司，美國）分別進行上述各處理黃翅絹野螟總RNA的提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，利用Biotek H1熒光酶標儀（Biotek公司，美國）測定總RNA的濃度和純度，記錄OD260/OD280波長處的吸光度，比值在1.8～2.2之間的樣品用于cDNA合成。每個樣品取2 μg RNA，按照FastKing RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]步驟合成cDNA第一鏈，稀釋5倍于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5? 候選內(nèi)參基因的確定及引物設計

基于黃翅絹野螟轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果，選擇以下9個基因作為候選內(nèi)參基因。經(jīng)NCBI比對后，分別為編碼肌動蛋白基因（Actin， ACT）、β-微管蛋白基因（β-tubulin， β-TUB）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（glucose 6 phosphate dehydrogenase， G6PDH）、核糖體蛋白S3a基因（ribosomal protein S3a， RPS3a）、核糖體蛋白L13a基因（ribosomal protein L13a， RPL13a）、延伸因子1α（elongation factor 1 alpha， EF1α）、真核生物啟動因子4A（eukaryotic initiation factor 4A， EIF4A）和β-肌動蛋白基因（β-Actin， β-ACT）。根據(jù)基因序列信息，利用NCBI Primer-BLAST設計qPCR引物，基因及引物信息見表1。

1.6? 候選內(nèi)參基因引物特異性及標準曲線繪制

以1.2中對照處理RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過qPCR檢測各基因的mRNA表達水平，qPCR反應使用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II（TaKaRa，日本）酶，擴增結(jié)束后在60～95 ℃通過熔解曲線分析，檢測各引物的擴增特異性。標準曲線的繪制使用5 U/mL Pfu Taq DNA聚合酶（TaKaRa，日本）對9個候選內(nèi)參基因進行PCR擴增，產(chǎn)物膠收后分別連接于pMD19-T載體（TaKaRa，日本）于16 ℃過夜，后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α（TaKaRa，日本）中，通過在LB液體培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA抽提采用EZNA Plasmid Mini Kit試劑盒（Omega公司，美國），后依次稀釋5個梯度，每個梯度稀釋10倍，以各濃度梯度質(zhì)粒DNA為模板進行qPCR。根據(jù)qPCR檢測結(jié)果繪制標準曲線得到線性相關系數(shù)（R2）和斜率（slope），并計算引物的擴增效率（E），E=（10[-1/slope]-1）×100%，qPCR和PCR擴增反應條件、連接、轉(zhuǎn)化等步驟具體參照王政等[7]的方法。

1.7? 候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析

分別以1.4中合成的cDNA為模板，利用qPCR分析9個候選內(nèi)參基因在不同處理下的mRNA表達量，反應體系為20 ?L，反應條件同1.6。采用geNorm[25]、NormFinder[26]、BestKeeper[27]和RefFinder[28]軟件對候選內(nèi)參基因在溫度脅迫、藥劑脅迫以及2種處理條件下全樣品的表達穩(wěn)定性進行分析。geNorm軟件通過計算平均變異度（mean variability， M）和配對變異值（pairwise variation， V）來確定最佳的內(nèi)參基因及數(shù)目。geNorm軟件要求M<1.50的基因為可用內(nèi)參基因，M值越小，候選基因越穩(wěn)定;最佳內(nèi)參基因的數(shù)目要求Vn/Vn+1<0.15，表明最佳內(nèi)參基因數(shù)目為n個。NormFinder根據(jù)各基因表達穩(wěn)定值（stability value， SV），SV越小表明基因表達越穩(wěn)定。BestKeeper軟件計算每個基因產(chǎn)生配對的相關系數(shù)（r）、標準偏差（standard deviation， SD）和變異系數(shù)（coefficient of variation， CV），根據(jù)SD和CV越小則基因越穩(wěn)定的原則，最終對各基因進行排名，SD<1的基因被視為表達水平較為穩(wěn)定。最后，根據(jù)geNorm軟件Vn/Vn+1推薦的穩(wěn)定內(nèi)參的數(shù)量，利用RefFinder在線分析程序（https：//www.heartcure.com.au/reffinder/？type=reference）對上述4種方法的分析結(jié)果進行綜合評價，最終確定各處理條件下適用的內(nèi)參基因。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 候選內(nèi)參基因引物特異性和擴增效率檢測

根據(jù)qPCR結(jié)果，9個候選內(nèi)參基因的溶解曲線均為單一峰（圖1），PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后條帶單一且明亮，長度與引物設計預期長度一致（圖2），無非特異性擴增，經(jīng)測序與黃翅絹野螟轉(zhuǎn)錄組序列一致。表明各基因序列正確，引物特異性良好，可用于后續(xù)試驗。以各基因質(zhì)粒DNA進行梯度稀釋為模板進行標準曲線繪制，結(jié)果顯示9個候選基因的線性相關系數(shù)R2均在0.998以上，表明模板DNA濃度與相應的Ct值線性關系明確，繪制的標準曲線可信。各基因的引物擴增效率為95.10%～107.5%（表1），表明各基因引物設計合理，使用該引物進行qPCR擴增是有效的。

2.2? 不同樣品中候選內(nèi)參基因mRNA表達水平分析

qPCR檢測9個候選內(nèi)參基因在7個處理（3個溫度處理，3個藥劑處理，1個對照組）中的mRNA表達水平結(jié)果顯示，各基因在不同樣品中表達量均有差異，溫度脅迫條件下平均Ct值范圍為18.23（EF1α）～25.45（β-ACT），表達量由高到低依次為EF1α（17.19～19.49）>RPL13a（17.58～20.72）>GAPDH（18.49～19.95）>RPS3a（18.19～21.04）>EIF4A（19.52～22.04）>ACT（20.5～23.37）>β-TUB（20.92～24.48）>G6PDH（21.13～24.78）>β-ACT（21.94～27.47）（圖3A）;藥劑脅迫條件下平均Ct值范圍為18.12（EF1α）～ 25.26（β-ACT），表達量由高到低依次為EF1α（16.90～19.87）>RPL13a（17.58～20.28）>RPS3a（18.11～20.51）>GAPDH（18.49～20.58）>EIF4A（18.66～21.84）>ACT（19.75～22.18）>β-TUB（20.55～24.48）>G6PDH（21.52～25.64）>β-ACT（22.24～27.47）（圖3B）;全樣品條件下平均Ct值范圍為18.22（EF1α）～25.20（β-ACT），表達量由高到低依次為EF1α（16.90～19.87）>RPL13a（17.58～20.72）>GAPDH（18.49～20.58）>RPS3a（18.11～21.04）>EIF4A（18.66～22.04）>ACT（19.75～23.37）>β-TUB（20.55～24.48）>G6PDH（21.13～25.64）>β-ACT（20.55～27.47）（圖3C）。不同處理條件下，各基因在組間的表達量差異較大，其中GAPDH的表達量組間差異最小，β-ACT的表達量組間差異最大。

2.3? 溫度脅迫下內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

溫度脅迫下，geNorm軟件分析結(jié)果表明，9個候選內(nèi)參基因平均變異度M值均小于1.5，表明候選內(nèi)參基因在溫度脅迫條件下均可作為內(nèi)參基因使用，其中ACT和RPS3a的M值（0.115）最小，是排名最穩(wěn)定的內(nèi)參基因;β-ACT的M值（0.983）最大，為相對最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因;基因穩(wěn)定性排序為EF1α（0.303）>EIF4A（0.368）> RPL13a（0.508）>G6PDH（0.576）>GAPDH （0.667）>β-TUB（0.861）（圖4A）。NormFinder軟件分析結(jié)果顯示SV值最小的基因為EIF4A（0.193），因此EIF4A被推薦為表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，基因穩(wěn)定性排序依次為GAPDH（0.354）> EF1α（0.371）>RPL13a（0.618）>G6PDH（0.636）>ACT（0.716）>RPS3a（0.819）>β-TUB（1.211）>β-ACT（1.292）（圖4B）;BestKeeper軟件分析結(jié)果表明，9個基因SD值均小于1，因此都可作為內(nèi)參基因使用，其中GAPDH的SD值（0.198）最小;基因穩(wěn)定性排序為GAPDH（0.198）>EIF4A（0.398）>EF1α（0.451）>ACT（0.605）>RPL13a（0.639）>RPS3a（0.639）>G6PDH（0.676）>β-TUB（0.754）>β-ACT（0.825）（圖4C）。

2.4? 藥劑脅迫下內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

geNorm軟件計算結(jié)果表明，9個基因的M值均小于1.5，均可作為藥劑脅迫下基因表達分析的內(nèi)參基因。其中EIF4A和ACT的M值（0.087）最小，表達最穩(wěn)定，基因穩(wěn)定性排序依次為EF1α（0.117）>RPS3a（0.286）>GAPDH（0.332）> RPL13a（0.350）>G6PDH（0.541）>β-TUB（0.728）>β-ACT（0.913）（圖5A）;NormFinder軟件分析9個基因穩(wěn)定性排序與geNorm結(jié)果一致（圖5B）;BestKeeper軟件分析結(jié)果與geNorm和Norm Finder分析結(jié)果差異較大，其中β-ACT和G6PDH的SD值均大于1，因此其穩(wěn)定性預測結(jié)果不可靠，9個基因穩(wěn)定性排序依次為GAPDH（0.285）>RPS3a（0.387）>EIF4A（0.486）>ACT（0.489）>RPL13a（0.519）>EF1α（0.538）>β-TUB（0.798）>G6PDH（1.266）>β-ACT（1.396）（圖5C）。

2.5? 全樣品條件下內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

全樣品條件下，geNorm軟件分析9個基因M值均小于1.5，表明所有基因都可用作全樣品條件下的內(nèi)參，基因穩(wěn)定性排序依次為EF1α/EIF4A（0.283）>ACT（0.332）>RPS3a（0.386）>RPL13a（0.477）>GAPDH（0.558）>G6PDH（0.700）>β-TUB（0.824）>β-ACT（0.953）（圖6A）;NormFinder分析結(jié)果表明，最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別為EF1α（SV值為0.187）和β-ACT（SV值為1.265），基因穩(wěn)定性排序依次為EIF4A（0.193）>RPL13a（0.461）>ACT（0.545）>GAPDH（0.547）>RPS3a（0.675）>G6PDH（0.951）>β-TUB（1.039）（圖6B）;BestKeeper分析結(jié)果表明，GAPDH的SD值（0.288）和CV值（1.501）均為最小，為最穩(wěn)定內(nèi)參基因，而β-ACT和G6PDH的SD值均大于1，不能將其作為內(nèi)參基因使用，其余基因穩(wěn)定性排序依次為EIF4A（0.496）>EF1α（0.520）>RPL13a（0.571）>RPS3a（0.592）>ACT（0.602）>β-TUB（0.692）（圖6C）。

2.6? 黃翅絹野螟不同條件下最佳內(nèi)參基因的確定

內(nèi)參數(shù)目可參照geNorm軟件成對變異值Vn/Vn+1來確定。即當Vn/Vn+1<0.15時，則該條件下最佳內(nèi)參基因的數(shù)目為n個。geNorm軟件結(jié)果表明，上述不同處理下成對變異值V2/V3均小于0.15（圖7），因此，研究溫度脅迫、藥劑脅迫和全樣品條件下基因表達分析時，需引入2個內(nèi)參基因進行標準化。RefFinder綜合geNorm、NormFinder、BestKeeper 3個軟件的基因穩(wěn)定性排序結(jié)果，最終確定各基因在不同處理條件下的幾何平均值，幾何平均值越小，穩(wěn)定性越好。因此，溫度脅迫下，最終確定的內(nèi)參基因為EIF4A、GAPDH;藥劑脅迫下，最終確定的內(nèi)參基因為ACT、EIF4A;全樣品下，最終確定的內(nèi)參基因為EF1α、EIF4A（表2）。在進行各條件下基因表達分析時，可引入上述基因作為內(nèi)參基因。

3? 討論

黃翅絹野螟因其鉆蛀為害寄主植物的特性，化學防治效果欠佳且生態(tài)弊端顯著，利用分子生物學手段揭示黃翅絹野螟的生理及行為學機制，有助于開發(fā)防控新技術。qPCR技術是分子生物學領域研究基因功能、揭示生理機制的重要技術手段，通常采用相對定量的方法對基因表達水平進行檢測，即引入內(nèi)參基因作為標準校正目的基因的表達量[7， 29]。目前，尚無某個理想的內(nèi)參基因在不同物種和不同處理條件下均能穩(wěn)定表達。因此，對某一物種進行基因表達分析前，篩選出在特定實驗條件下穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因至關重要[30， 13]。黃翅絹野螟是菠蘿蜜、面包果和尖蜜拉等富含淀粉的熱帶果樹上重要的鉆蛀性害蟲，國內(nèi)外未見其內(nèi)參基因篩選的報道。因此，本研究根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出9個候選內(nèi)參基因進行表達穩(wěn)定性分析。在進行基因表達分析前，首先對其引物特異性及擴增效率進行評估。一般認為引物特異性高且擴增效率介于90%～110%之間時，可用于qPCR試驗的開展[31]，本研究中9個候選基因引物均無非特異性擴增，且各基因的引物擴增效率介于95.10%～107.5%之間，表明各基因引物設計合理，符合qPCR擴增要求，檢測結(jié)果有效。

本研究分別采用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：基因穩(wěn)定性排序在3種軟件之間存在差異。溫度脅迫下，NormFinder和BestKeeper分析結(jié)果較為相似，而geNorm分析結(jié)果與NormFinder、BestKeeper分析結(jié)果差異較大。例如，ACT/RPS3a在geNorm中排名為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而在NormFinder中排名分別為第6、第7位，BestKeeper中分別為第4、第6位。藥劑脅迫下，geNorm和NormFinder分析結(jié)果排序結(jié)果均一致，排名前3位的基因均為EIF4A、ACT和EF1α，而這3個基因在BestKeeper中分別排在第3、第4和第6位。全樣品條件下，geNorm和NormFinder分析結(jié)果表明，EF1α和EIF4A為排名前2位的基因，排在后3位的基因均為G6PDH、β-TUB和β-ACT，其他基因排列順序有少許差異，而BestKeeper分析的基因排序結(jié)果顯示，排在前2位的基因為GAPDH和EIF4A，與geNorm和NormFinder差異較大。造成3種軟件分析結(jié)果不一致的原因是各軟件計算原理不同，這種情況在瓜實蠅（Bactrocera cucurbitae）[32]、松墨天牛（Monochamus alternatus）[33]、大灰象甲（Sympiezomias velatus）[34]、扶桑綿粉蚧[35]等昆蟲中也存在。為了消除不同軟件分析結(jié)果的差異，需利用RefFinder在線分析軟件綜合評估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，得到最終排名結(jié)果，從中選出最合適的內(nèi)參基因。

根據(jù)RefFinder最終評價結(jié)果，發(fā)現(xiàn)溫度脅迫、藥劑脅迫和全樣品條件下推薦的穩(wěn)定內(nèi)參基因并不完全相同。其中，僅EIF4A在3種條件下都可作為穩(wěn)定內(nèi)參使用。但使用單一內(nèi)參基因進行qPCR數(shù)據(jù)校準，可能會影響結(jié)果的精確性，因此qPCR分析過程中往往使用多個內(nèi)參基因進行校正[25， 36]。所需內(nèi)參基因的數(shù)目可根據(jù)geNorm軟件基因配對差異值Vn/Vn+1來確定。依據(jù)Vn/Vn+1< 0.15的原則，本研究中溫度脅迫、藥劑脅迫和全樣品條件下進行qPCR時均需引入2個內(nèi)參基因，因此，上述3種處理下推薦的另一個內(nèi)參基因分別是GAPDH、ACT和EF1α。EIF4A為真核生物啟動因子，參與mRNA與核糖體的結(jié)合[37]，已被證實可用作許多鱗翅目昆蟲溫度脅迫或抗藥性基因的表達分析，如家蠶（Bombyx mori）中腸抗菌肽基因的表達[38]、粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）抗藥蛋白基因的表達[39]、蟲草蝙蝠蛾（Thitarodes armoricanus）抗寒基因的表達[40]等。本研究中EIF4A的適用范圍則更廣泛，說明相同的基因在不同物種中可作為內(nèi)參基因的適用范圍并不一致。另外，GAPDH和ACT作為傳統(tǒng)內(nèi)參基因并非在所有條件下均表達穩(wěn)定，如在番茄木虱（Bactericera cockerelli）[41]、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）[42]、二化螟（Chilo suppressalis）[12]、小菜蛾（Plutella xylostella）[43]等昆蟲中二者僅在特定條件下才可作為內(nèi)參基因使用，本研究結(jié)果證實了這一點，GAPDH僅在溫度脅迫下穩(wěn)定，而ACT僅在藥劑脅迫下穩(wěn)定。值得注意的是，王政等[7]發(fā)現(xiàn)茶刺盲蝽在溫度脅迫下最佳內(nèi)參基因為EIF4A和RPS3a，藥劑脅迫和全樣品條件下最佳內(nèi)參基因為RPS3a和RPL13a，盡管本研究部分實驗方法參照此文，但即使在相同處理條件下結(jié)果卻完全不同，再次表明不同物種的內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性存在差異。因此，在進行特定條件靶標基因qPCR分析時，必須首先對內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行篩選，以確保結(jié)果的準確性和可靠性。

本研究僅對黃翅絹野螟溫度脅迫、藥劑脅迫及全樣品條件下的內(nèi)參基因進行篩選，其結(jié)果是否適用其他處理條件或其他物種，有待進一步驗證。本研究結(jié)果為利用qPCR技術分析黃翅絹野螟溫敏及抗藥性相關基因表達差異提供了穩(wěn)定的內(nèi)參基因，進而為基因的功能分析奠定了基礎。

參考文獻

Wang Z， Meng Q Q， Zhu X， et al. Evaluation and validation of reference genes for quantitative real-time PCR in Helopeltis theivora Waterhouse （Hemiptera： Miridae）[J]. Scientific Reports， 2019， 9（1）： 13291.

Jiang H C， Qian Z J， Lu W， et al. Identification and characterization of reference genes for normalizing expression data from red swamp crawfish Procambarus clarkii[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2015， 16（9）： 21591-21605.

Hu Y N， Fu H T， Qiao H， et al. Validation and evaluation of reference genes for quantitative real-time PCR in Macrobrachium Nipponense[J].International Journal of Molecular Sciences， 2018， 19（8）： 2258-2273.

Shu B S， Zhang J J， Cui G F， et al. Evaluation of reference genes for real-time quantitative PCR analysis in larvae of Spodoptera litura exposed to azadirachtin stress conditions[J]. Frontiers in Physiology， 2018， 9： 372.

Zhang Y T， Peng X R， Liu Y， et al. Evaluation of suitable reference genes for qRT-PCR normalization in strawberry （Fragaria × Ananassa） under different experimental conditions[J]. BMC Miology， 2018， 19（1）： 8.

Shekh K， Tang S， Niyogi S， et al. Expression stability and selection of optimal reference genes for gene expression normalization in early life stage rainbow trout exposed to cadmium and copper[J]. Aquatic Toxicology， 2017， 190： 217-227.

王? 政， 朱? 茜， 孟倩倩， 等. 溫度和藥劑脅迫下茶刺盲蝽內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析[J]. 植物保護學報， 2019， 46（3）： 530-541.

Pan H P， Yang X W， Bidne K， et al. Selection of reference genes for RT-qPCR analysis in the monarch butterfly， Danaus plexippus （L.）， a migrating bio-indicator[J]. PLoS One， 2015， 10（6）： e0129482.

Chen H， Yang Z Q， Hu Y， et al. Reference genes selection for quantitative gene expression studies in Pinus massoniana L.[J]. Trees， 2016， 30（3）： 685-696.

Suzuki T， Higgins P J， Crawford D R. Control selection for RNA quantitation[J]. Biotechniques， 2000， 29（2）： 332-337.

Zhang L， Zhang Q L， Wang X T， et al. Selection of reference genes for qRT-PCR and expression analysis of high-altitude-related genes in grassland caterpillars （Lepidoptera： Erebidae： Gynaephora） along an altitude gradient[J]. Ecology and Evolution， 2017， 7（21）： 9054-9065.

Xu J， Lu M X， Cui Y D， et al. Selection and evaluation of reference genes for expression analysis using qRT-PCR in Chilo suppressalis （Lepidoptera： Pyralidae）[J]. Journal of economic entomology， 2017， 110（2）： 683-691.

Volkov R A， Panchuk I I， Sch?ffl F. Heat-stress-dependency and developmental modulation of gene expression： the potential of house-keeping genes as internal standards in mRNA expression profiling using real-time RT-PCR[J]. Journal of Experimental Botany， 2003， 54（391）： 2343-2349.

Najat D， Ghows A， Andrade M L. Assessment of Aedes albopictus reference genes for quantitative PCR at different stages of development[J]. PLoS One， 2018， 13（3）： e0194664.

Li H B， Dai C G， Zhang C R， et al. Screening potential reference genes for quantitative real-time PCR analysis in the oriental armyworm， Mythimna separata[J]. PLoS One， 2018， 13（4）： e0195096.

Wang G H， Chen Y F， Zhang X Y， et al. Selection of reference genes for tissue/organ samples on day 3 fifth-instar larvae in silkworm， Bombyx mori[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology， 2018， 98（2）： e21458.

王平遠. 中國絹螟屬（Diaphania Hübner）記述[J]. 昆蟲學報， 1963， 12（3）： 358-367.

羅永明， 金啟安. 海南島兩種熱帶果樹害蟲記述[J]. 熱帶作物學報， 1997， 18（1）： 71-78.

Kallekkattil S， Krishnamoorthy A， Shreevihar S， et al. First report of a hymenopteran parasitoid complex on jackfruit shoot and fruit borer Diaphania caesalis （Lepidoptera： Crambidae） from India[J]. Journal of Biocontrol Science and Technology， 2019， 29（11）： 1037-1052.

劉愛勤， 桑利偉， 孫世偉， 等. 海南省菠蘿蜜主要病蟲害識別與防治[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學， 2012， 32（12）： 64-69， 74.

王? 政， 孟倩倩， 譚樂和， 等. 黃翅絹野螟蛹和成蟲雌雄形態(tài)的快速鑒定[J]. 環(huán)境昆蟲學報， 2017， 39（5）： 1185- 1190.

孟倩倩， 王? 政， 譚樂和， 等. 黃翅絹野螟觸角感器的掃描電鏡觀察[J]. 熱帶作物學報， 2017， 38（7）： 1323-1327.

Soumya K， Krishnamoorthy A， Patil P， et al. Evaluation of jackfruit germplasm against jack shoot and fruit borer， Diaphania caesalis （Wlk.） （Lepidoptera： Pyralidae）[J]. Pest Management in Horticultural Ecosystems， 2015， 21（1）： 8-10.

Rajkumar M B， Gundappa B， Tripathi M M， et al. Pests of Jackfruit[M]//Omkar. Pests and Their Management. Springer， Singapore， 2018： 589-593.

Vandesompele J， de Preter K， Pattyn F， et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology， 2002， 3（7）： 467-470.

Andersen C L， Jensen J L， ?rntoft T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data： A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization， applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Research， 2004， 64（15）： 5245-5250.

Pfaffl M W， Tichopad A， Prgomet C， et al. Determination of stable housekeeping genes， differentially regulated target genes and sample integrity： BestKeeper-excel-based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnology Letter， 2004， 26（6）： 509-515.

Xie F L， Xiao P， Chen D L， et al. MiRDeepFinder： A miRNA analysis tool for deep sequencing of plant small RNAs[J]. Plant Molecular Biology， 2012， 80（1）： 75-84.

楊? 苓， 胡曉靜， 徐志峰， 等. 桃蛀螟實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J]. 昆蟲學報， 2017， 60（11）： 1266- 1277.

劉凡奇， 萬貴鈞， 曾路影， 等. 近零磁場下灰飛虱轉(zhuǎn)錄表達分析穩(wěn)定性內(nèi)參基因篩選[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2019， 52（19）： 3346-3356.

Taylor S， Wakem M， Dijkman G， et al. A practical approach to RT-qPCR-publishing data that conform to the MIQE guidelines[J]. Methods， 2010， 50（4）： 1-5.

王鳳英， 楊? 朗， 黎柳鋒， 等. 不同溫度脅迫下瓜實蠅RT-qPCR內(nèi)參基因篩選[J]. 環(huán)境昆蟲學報， 2018， 40（5）： 1097-1105.

馮? 波， 郭前爽， 毛必鵬， 等. 松墨天?；瘜W感受組織熒光定量PCR內(nèi)參基因的鑒定與篩選[J]. 昆蟲學報， 2016， 59（4）： 427-437.

李? 曉， 李建文， 成? 波， 等. 大灰象甲實時定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J]. 昆蟲學報， 2018， 61（11）： 1284-1294.

陳? 芳， 陸永躍. 熱脅迫下棉花粉蚧內(nèi)參基因的篩選[J]. 昆蟲學報， 2014， 57（10）： 1146-1154.

Concha C， Edman R M， Belikoff E J， et al. Organization and expression of the Australian sheep blowfly （Lucilia cuprina） hsp23， hsp24， hsp70 and hsp83 genes[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2012， 21（2）： 169-180.

Svitkin Y V， Pause A， Haghighat A， et al. The requirement for eukaryotic initiation factor 4A （eIF4A） in translation is in direct proportion to the degree of mRNA 5secondary structure [J]. RNA， 2001， 7（3）： 382-394.

Wu S， Zhang X， He Y， et al. Expression of antimicrobial peptide genes in Bombyx mori gut modulated by oral bacterial infection and development[J]. Developmental and Comparative Immunology， 2010， 34（11）： 1191-1198.

Simmons J， D Souza O， Rheault M， et al. Multidrug resistance protein gene expression in Trichoplusia ni caterpillars[J]. Insect Molecular Biology， 2013， 22（1）： 62-71.

Liu G Q， Qiu X H， Cao L， et al. Evaluation of reference genes for reverse transcription quantitative PCR studies of physiological responses in the ghost moth， Thitarodes armoricanus （Lepidoptera， Hepialidae）[J]. PLoS One， 2016， 11（7）： e0159060.

Ibanez F， Tamborindeguy C， Selection of reference genes for expression analysis in the potato psyllid， Bactericera cockerelli[J]. Insect Molecular Biology， 2016， 25（3）： 227-238.

Ponton F， Chapuis M P， Pernice M， et al. Evaluation of potential reference genes for reverse transcription-qPCR studies of physiological responses in Drosophila melanogaster[J]. Journal of Insect Physiology， 2011， 57（6）： 840-850.

Teng X L， Zhang Z， He G L， et al. Validation of reference genes for quantitative expression analysis by real-time RT-PCR in four lepidopteran insects[J]. Journal of Insect Science， 2012， 12（60）： 1-17.

責任編輯：謝龍蓮