沈婕 董世滿 李淑霞 彭明

摘? 要：低溫脅迫嚴重影響木薯的生長、產量以及塊根品質。長鏈非編碼RNAs（（lncRNAs）lncRNAs） 作為關鍵的調節(jié)因子，在植物響應非生物脅迫過程中發(fā)揮重要的功能。然而，lncRNAs在木薯中的功能和調控機制尚無報道。因此，為了研究木薯lncRNAs在低溫脅迫應答中的功能，本研究以木薯主栽品種‘60444為材料，利用低溫處理前后的葉片轉錄組數(shù)據(jù)，鑒定到一個受低溫脅迫調控的lncRNA（cold-responsive lncRNA5，CRR5）。通過對其序列比對進行同源性分析， RNA二級結構預測和共表達分析鑒定來分析lncRNA-CRR5響應低溫脅迫的分子功能。并根據(jù)基因的共表達分析推測CRR5的順式作用和反式作用靶基因。這些結果為更進一步研究CRR5的功能提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：木薯;低溫脅迫;lncRNA;功能分析;同源性分析;RNA二級結構預測;共表達基因分析;靶基因

中圖分類號：S533? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： Low temperature stress seriously affects the growth and yield of cassava and the quality of roots. Long non-coding RNAs （lncRNAs） function as major regulators， have been shown to play essential roles in plants in response to abiotic stresses. However， the function and regulation mechanism in cassava has not been reported yet. Therefore， in order to investigate the function of lncRNAs in low-temperature response， we identified a cold-responsive lncRNA 5 （CRR5） from the transcriptome data using cassava cultivars ‘60444as the material. We analyzed the molecular function of lncRNA-CRR5 in response to low temperature stress by homology analysis， RNA secondary structure prediction and co-expression analysis. The cis-acting target gene and trans-acting target gene of CRR5 were predicted based on the analysis of gene co-expression. The results would provide a new perspective theoretical basis for further exploring the response of CRR5 to low temperature.

Keywords： cassava; cold stress; lncRNA; functional analysis; homology analysis; RNA secondary structure; co-expression gene analysis; target genes

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.006

木薯（Manihot esculenta Crantz）是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的經濟作物，在中國廣東、廣西、海南等省份被廣泛種植。木薯塊根用途廣泛，可食用、飼用及作為工業(yè)原料生產乙醇和制取淀粉，即便是生產后的木薯渣殘，亦可用作飼料、肥料被開發(fā)與利用。然而，中國熱帶地區(qū)地處熱帶北緣，經常遭受寒流侵襲。低溫是一種常見的影響植物地理分布、生長發(fā)育和品質產量的非生物脅迫因素，嚴重時會導致植物死亡[1-2]。木薯對低溫非常敏感，在受到低溫脅迫時，頂端生長受抑制、植株萎蔫、莖桿壞死，在薯塊形成后受低溫脅迫則導致塊根膨大和淀粉累積受限、產量下降[3-4]。近年來，木薯雖為中國熱區(qū)種植面積最大的薯類作物，但受寒流侵襲和區(qū)域性氣候的限制，中國熱區(qū)生產的木薯自給嚴重不足，遠遠無法滿足國內的產業(yè)發(fā)展需要，需大量從國外進口。因此，開展耐低溫育種基礎性研究，培育耐低溫、抗旱木薯品種，使木薯種植北移，滿足我國和世界能源工業(yè)對木薯原材料的需求，是我國木薯產業(yè)發(fā)展的迫切需求。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度在200 nt以上的非編碼RNA。根據(jù)其在基因組上的位置可將其分為三3種類型：基因間長鏈非編碼RNA（long intergenetic noncoding RNA，linc RNA）、天然反向轉錄本（natural antisense transcript，NAT）以及內含子長鏈非編碼 RNA（intronic long noncoding RNA）[5-6]。由于lncRNA不具備蛋白質編碼功能，因此，很長一段時間，人們認為它是轉錄過程中的“噪音”。然而，越來越多的研究結果表明，lncRNAs作為功能調控元件在真核生物的基因表達調控中起著非常重要的作用[6]。目前關于長鏈非編碼RNA的工作主要集中在動物中，哺乳動物lncRNAs參與調控多種生物學過程，包括X染色體沉默、基因組印跡、染色體修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸?shù)萚7-8]。在植物長鏈非編碼RNA的生物學功能和作用機制的研究主要集中在模式作物，如擬南芥、水稻等。相對于研究較多的非編碼小RNA，目前大部分lncRNAs的功能尚不清楚。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)植物lncRNA參與了春化作用、根瘤形成、光形態(tài)建成及逆境響應等生物學過程[9-12]。例如：植物春化開花途徑中的關鍵調控基因FLC（Flowering locus C），其mRNA的轉錄受到兩個lncRNA（COOLAIR和COLDAIR）的調控[13-14]。在豆科植物中，人們鑒定到一個非常保守的lncRNA，命名為ENOD40（EARLY NODULIN 40）。研究發(fā)現(xiàn)ENOD40參與到共生根瘤的形成過程，在結瘤過程中，ENOD40作為RNA分子可以影響Mt RBP1（RNA binding protein 1）蛋白的核質轉運[15]。

得益于高通量測序技術的發(fā)展，使大量植物基因組信息的解讀成為可能，同時通過多組學數(shù)據(jù)的整合，研究者可以清晰地認識基因的功能，研究基因的轉錄和調控機制。目前，利用組學數(shù)據(jù)，人們在眾多植物物種中鑒定到大量的lncRNA，這些lncRNA或參與了植物的發(fā)育調控、或介導了逆境脅迫響應過程[16-18]。例如：擬南芥中已經發(fā)現(xiàn)1832個lncRNAs在干旱、低溫、高鹽或脫落酸處理后表達量發(fā)生顯著改變[19-20]。小麥中鑒定到125個脅迫（白粉菌感染和熱脅迫）響應的lncRNAs[21]。Lv等[22]在玉米中鑒定到7245個lncRNA，其中637個與氮營養(yǎng)脅迫相關。本研究中，前期利用組學數(shù)據(jù)篩選到一個低溫響應的lncRNA，命名為CRR5（Cold-responsive lncRNA 5）。運用序列比對進行同源性分析以及RNA二級結構預測，對CRR5的潛在功能和靶基因進行了預測和分析。結果表明，木薯中CRR5對低溫脅迫作出了應答，通過對lncRNAs作用機制的研究，從而篩選特異的功能基因，將為木薯的轉基因遺傳育種提供新的思路。

雖然木薯在塊根作物中研究基礎較好，但仍遠遠落后于水稻等糧食作物，挖掘木薯特異功能基因，進行轉基因木薯品質改良，是木薯品種改良的有效方法之一。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實驗材料為木薯主栽品種，來自中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所研究基地提供。

將組培瓶中的木薯莖去葉片留腋芽和頂芽切成1 cm左右，插入MS培養(yǎng)基中，置于溫室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（（26±2）26±2）℃，光照16 h和黑暗8 h。培養(yǎng)1個月后，分別收集葉片、莖尖、莖段和根等組織部位用于RNA抽提。對于低溫處理組，把木薯組培苗放于4 ℃分別處理1、3、6、12、24、48、72 h，并且和不做低溫處理的MS固體培養(yǎng)為空白對照，3次重復，分別取處理組和對照組的葉片，液氮速凍后儲存在?80 ℃冰箱用于提取組織總RNA。

1.2? 方法

1.2.1? 葉片總RNA的提取? 取木薯葉片，加入液氮后，迅速充分的地將葉片研磨成粉末狀，再將磨完后的粉末裝入2 mL離心管中，加入500 μL裂解液SL，立即渦旋劇烈震蕩混勻。12000 r/min離心2 min。將上清液轉移至過濾柱CS上，12000 r/min離心2 min，小心吸取收集管中的上清液至新的RNase-Free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉淀。緩慢加入0.4倍上清液體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉入CR3中，12000 r/min離心15 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12000 r/min離心15 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱CR3中央加入80 μL的DNase 1工作液，室溫放置15 min（DNase 1工作液的配置：取10 μL DNase 1儲存液放入新的RNA-Free離心管中，加入70 μL RDD緩沖液，輕柔混勻）。向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12000 r/min離心15 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW，12000 r/min離心15 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中，并重復1次。12000 r/min離心2 min，將吸附柱CR3放入一個新的RNase-Free的離心管中，向吸附柱中央部位懸空滴加50 μL RNase-Free ddH2O，室溫放置2 min，12000 r/min離心1 min，得到RNA溶液。

1.4 1. 2.2? RNA反轉錄成cDNA

cDNA反轉錄體系（50 ng～-2 μg）總RNA可建立20 μL體系。先進行基因組DNA去除體系配制混合液，徹底混勻簡短離心，并置于42 ℃孵育3 min，然后放到冰上。（1）gDNA去除反應體系：每個樣品使用5 gDNA Buffer 2 μL，將Total RNA補足50 ng，隨后使用RNase-Free ddH2O補足到10 μL。（2）反轉錄反應體系：

每個樣品使用10 Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，RNase-Free ddH2O 7 μL。

將反轉錄反應中的Mix加到gDNA去除步驟的反應液中，充分混勻，42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后續(xù)的實驗。

1.51.2.3? 實時熒光定量PCR的檢測

（1）20 μL反應體系：

2 SYBRⅡ 10 μL，Primer（正反向） 1.6 μL，ddH2O 7 μL，cDNA 1 μL，SYBR ROX DYe 50 0.4 μL。

（2）反應步驟：第一步，95 ℃預變性30 s，第二步（45個循環(huán)），95 ℃：5 s，60 ℃：30 s，第三步，95 ℃：15 s，60 ℃：1 min，95 ℃：15 s。

1.61.2.4? CRR5二級結構預測

目前有多種算法可以用來預測RNA的二級結構，其中最小自由能算法（Minimum Free Energy，MFE）作為典型代表使用最為廣泛。本文利用RNA fold軟件，利用最小自由能算法對CRR5進行二級結構特征進行分析。

2? 結果與分析

2.1? CRR5的篩選與分析

利用木薯莖尖及幼嫩葉片的轉錄組數(shù)據(jù)，鑒定到682個lncRNA，其中318個受低溫調控表達[23]，并重點篩選出lncRNA-CRR5展開后續(xù)功能研究。CRR5全長976 bp，含有3個外顯子，位一號染色負鏈表達，上下游鄰近蛋白質編碼基因分別是Manes.01G155600和Manes.01G155500。通過設計特異性PCR引物，以木薯cDNA為模板，經過特異性的PCR擴增，最終克隆到CRR5全長序列。為了驗證CRR5的組織表達特征，分別采集了在溫室培養(yǎng)30 d，溫室溫度為（26±2）℃，光照16 h和黑暗8 h的木薯葉、莖段、根等不同的組織部位，抽提RNA后檢測CRR5的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)CRR5基因具有較為明顯的組織表達特異性，在根中表達最低、莖次之、莖尖和葉片中最高，葉柄這種表達量與根中接近（圖1）。

2.2? CRR5同源序列比對以及系統(tǒng)進化樹的構建

為研究木薯CRR5的序列保守程度，從而在進化層面上對其進行功能注釋。以CRR5的全長序列為檢索對象搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，選取了12個與CRR5同源性較高的木薯及其他植物的序列，用MEGA6通過Neighbor joining（NJ）法構建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結果顯示，CRR5與木薯中的組氨酸?；D移酶的同源程度較高，且已有研究結果表明，組蛋白乙酰化修飾在參與并調控植物的生長發(fā)育過程中起著重要的調控作用。此外， CRR5和木薯中一個功能位置的蛋白質編碼基因（Manes.01G194100）同源性最為接近。與此同時，其在橡膠樹、赤豆中也存在同源基因。

2.3? CRR5二級結構預測

對CRR5的一級序列的分析，促使我們獲得其部分信息，而對二級結構的研究可以進一步探索其具有的生物學功能。研究表明，單鏈的RNA自身折疊配對形成螺旋區(qū)和環(huán)，對RNA二級結構的預測是生物信息學領域的研究焦點問題。CRR5的二級結構預測結果如下圖3所示，從圖中可以看出，CRR5二級結構是多莖環(huán)發(fā)夾結構，其中，3個主要的分支環(huán)包含12個莖環(huán)、2個凸環(huán)結構。藍色區(qū)域是5端，紅色的則是3端。藍色區(qū)域表示堿基對的匹配程度較高，自由能值低，穩(wěn)定性好（圖3）。以往研究表明，RNA的莖環(huán)結構在與RNA結合蛋白相互作用過程中至關重要[5]。因此，對CRR5二級結構的預測，可以為研究其功能和作用機制等提供重要數(shù)據(jù)。

2.4? 對不同低溫時間處理下木薯CRR5表達的實時熒光定量分析

為了研究CRR5響應低溫脅迫的動態(tài)表達情況，本實驗用熒光定量PCR的方法對CRR5進行驗證。結果發(fā)現(xiàn)，低溫處理后CRR5的表達量呈現(xiàn)出整體的上升趨勢。在低溫脅迫1 h后，處理組中CRR5的相對表達量約為對照組的7倍;3、6、12 h處理后的相對表達量約為對照組的10倍;在低溫處理24 h后，差異表達最顯著，相對表達量約為處理前的20倍。處理48 h和72 h后CRR5的相對表達量略有下降（圖4）。

2.5? CRR5共表達基因鑒定

基于lncRNA與鄰近基因可能存在協(xié)同表達或調控關系，因此，著重分析了CRR5上下游鄰近蛋白質編碼基因Manes.01G155600、Manes. 01G155500的表達。結果表明，二者在低溫條件下表達變化不顯著，因此推測CRR5和臨近的上下游基因不存在共表達或調控關系。而基于基因共表達的方法，通過分析轉錄組中與CRR5的表達關聯(lián)系數(shù)大于0.9的蛋白編碼基因的功能。可以對CRR5進行功能注釋。利用該方法，在木薯基因組中鑒定了29個蛋白質編碼基因，它們的表達量與CRR5高度相關，將這些編碼基因進行功能注釋。其中29個基因參與代謝過程。6個基因與分子運輸相關，15個基因參與轉錄調節(jié)。8個基因參與激素應答與信號轉導（（表1）表1）。從而推測位于編碼基因上下游的這些lncRNA可能參與轉錄調節(jié)、代謝、激素應答和信號轉導等生物過程來響應低溫脅迫。

在低溫脅迫下，植物細胞至少有3種溫度感受及信號傳導途徑：膜流動性的改變，葉綠體能量轉換失衡和蛋白磷酸化的植物冷響應[1， ， 24]。鈣離子作為細胞內的第二信使會引起一系列代謝及基因表達的變化，激活相應的轉錄因子，如MYB、WRKY等來誘導基因的表達[25-26]。此外，蛋白磷酸化酶和蛋白激酶等也是信號傳導分子。在轉錄水平上的調控途徑，闡述最清楚的是CBF基因家族的調控，經過轉錄組分析，ICE1可結合在CBF3的啟動子MYC元件區(qū)域激活基因轉錄，轉錄的產物再結合在COR基因的啟動子元件上，激活了冷響應有關基因的轉錄從而增強植物的耐寒性[27]。在低溫脅迫下，木薯內CRR5與一些重要的蛋白激酶基因存在協(xié)同表達，比如谷胱甘肽S-轉移酶，AUX/IAA蛋白等，還有與RNA轉錄相關的蛋白（（表1）表1）。

3? 討論

低溫和寒害對熱帶作物木薯的影響巨大。因此，解析低溫響應關鍵基因的功能和作用機理，將會為木薯抗逆性研究提供分子基礎，有助于木薯更好地適應寒冷環(huán)境。在過去的10年里，諸多證據(jù)表明，lncRNA在植物開花調控、根瘤形成、逆境脅迫響應等方面發(fā)揮重要功能[5]。近年來，隨著新一代測序技術的進步，許多新的非編碼RNA在不同的植物物種中被發(fā)現(xiàn)，如水稻、玉米等[18， 22， 28]。然而，由于植物對低溫脅迫表現(xiàn)出復雜的生理、生化和分子反應，以及實驗技術的局限性，其功能研究一直未得到深入驗證，尤其是在木薯中。近年來，科研人員對lncRNA的研究的大部分還停留在對不同植物的識別或調控現(xiàn)象等方面。根據(jù)lncRNA的一級結構推測其二級結構，是功能蛋白質與RNA互作的重要依據(jù)，或成為lncRNA的功能研究的途徑之一。

采用鏈特異性RNA-seq的方法，尋找在低溫脅迫下表達顯著變化的lncRNA，根據(jù)嚴格的篩選標準，篩選到了候選lncRNA-CRR5。本研究從木薯葉片中克隆得到CRR5的cDNA全長，基于CRR5的一級序列，發(fā)現(xiàn)其在植物物種間同源性較低，但系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示，在木薯中存在12個與之同源性較高的蛋白質編碼基因，這一結果暗示CRR5可能與這些基因的功能高度相關。另外CRR5的二級結構預測其存在12個穩(wěn)定的莖環(huán)結構，通過對CRR5二級結構的預測，將為尋找與其存在相互作用的蛋白、蛋白質復合體提供參考和理論依據(jù)。

研究表明，lncRNA的表達具有組織特異性，本研究發(fā)現(xiàn)，CRR5在莖尖、葉片中表達豐度相對較高，表明其在莖尖分生組織的維持、葉片分化及形態(tài)建成過程中可能發(fā)揮功能。木薯的莖頂端和葉片是感受溫度變化的重要部位，對低溫最為敏感。低溫處理后，莖頂端和葉片分別呈現(xiàn)出壞死和萎蔫的癥狀。CRR5在這兩2個部位的高表達，表明其在低溫脅迫響應中擔任重要角色。利用基因組共表達方法，注釋了29個與CRR5共表達的蛋白質編碼基因，并根據(jù)這些基因的功能，推測CRR5主要參與了轉錄調節(jié)、代謝、激素應答和信號轉導等生物過程。本研究中的發(fā)現(xiàn)為未來開展CRR5的功能與分子機制的研究及提高木薯抗逆性奠定基礎。

CRR5與鄰近蛋白質編碼基因的表達并不存在協(xié)同或相關性，表明其并不通過順式作用方式調控靶基因。而共表達基因網絡分析顯示CRR5與真菌素金屬肽酶（M36），Di-葡萄糖結合內質網，不分生頂端蛋白，短鏈脫氫酶，木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶，WRKY轉錄因子的共表達系數(shù)較高，我們推測CRR5與這些基因的表達有關。這些功能基因與激素的調節(jié)，蛋白質的轉運等功能息息相關。研究這些基因一方面可以了解低溫脅迫下CRR5如何發(fā)揮功能，也可以通過驗證這些功能基因的功能推測木薯抵御低溫脅迫的分子遺傳通路，為揭示植物響應低溫脅迫提供新思路。目前CRR5介導木薯抗低溫的分子機制尚不清楚，隨后我們還將遺傳轉化技術，構建CRR5高/低表達轉基因植株，并通過分析轉基因株系在低溫脅迫下的抗寒表型檢驗，以及低溫脅迫前后各項生理指標的變化確定CRR5的生物學功能。并通過RNA熒光原位雜交技術確定其行使功能的具體部位、結合轉錄組學分析該lncRNA的分子機制。

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