熊 琳朱婷婷張麗玲陳 躍楊建波歐三桃*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科,四川 瀘州 646000； 2.四川省腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,四川瀘州 646000； 3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科, 四川 瀘州 646000)

慢性腎病礦物質(zhì)骨異常(chronic kidney disease-mineral and bone disorder, CKD-MBD) 是CKD 患者的常見并發(fā)癥,與其心血管事件及死亡率密切相關(guān)[1]。 腎性骨病特指CKD-MBD 的骨異常,骨活檢是其診斷的金標(biāo)準[2],但由于操作有創(chuàng)、費用昂貴、技術(shù)難度高、可重復(fù)性差等,臨床上骨活檢的實施受到很大限制,而檢測骨代謝標(biāo)志物成為臨床實踐中診斷腎性骨病的重要手段。 血管鈣化(vascular calcification,VC)作為CKD-MBD的另一重要組成部分,也是導(dǎo)致CKD 患者發(fā)生心血管事件及死亡率增加的重要危險因素[3-4]。 近年來,“骨-血管軸”理論的提出表明腎性骨病和VC 之間可能有著密切的聯(lián)系[5]。 目前關(guān)于二者的關(guān)系的研究較少,因此本研究旨在探討CKD 大鼠血管鈣化及其嚴重程度與血清骨代謝標(biāo)志物變化之間的關(guān)系,為臨床上制定和改善CKD-MBD 的診療方案提供理論依據(jù),進而有效降低CKD 患者心血管疾病的發(fā)生率及死亡率。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠36 只,體重180～260 g,6～8 周齡,購自西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(川)2018-17],在西南醫(yī)科大學(xué)城北校區(qū)動物房飼養(yǎng)[SYXK(川)2018-065],相對濕度60%～70%,室溫24℃～26℃,12 h 交替照明,每籠3 只,遵循“3R”原則給予人道的關(guān)懷。 經(jīng)由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審批通過(201904158)。

1.2 主要試劑與儀器

腺嘌呤(Sigma 公司,美國)；1.8%高磷飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司,中國)；Von Kossa 染色試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司,中國)；鈣含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,中國)；大鼠1,25-二羥基維生素D3(1,25 -dihydroxy vitamin D3,1,25(OH)2D3)ELISA 試劑盒、大鼠甲狀旁腺素(parathyroid hormone, PTH)ELISA 試劑盒、大鼠骨源性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BALP)ELISA 試劑盒、大鼠骨鈣素(osteocalcin, OC)ELISA 試劑盒、大鼠總I 型前膠原氨基末端肽(type I procollagen amino-terminal peptide, tPINP)ELISA試劑盒、大鼠β-I 型膠原交聯(lián)羧基末端肽(βcarboxy-terminal peptide of type I collagen, β-CTX)ELISA 試劑盒、大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartraresistant acid phosphatase 5b, TRACP-5b)ELISA 試劑盒(上海泛柯實業(yè)有限公司,中國)；全自動生化分析儀(西門子,德國)；標(biāo)準酶標(biāo)儀(Bio-rad 公司,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組和模型制備

SPF 級雄性SD 大鼠36 只,適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后,隨機分為正常對照組(n＝18 只)和CKD 血管鈣化組(n＝18 只)。 CKD 血管鈣化組給予1.8%高磷飼料喂養(yǎng),第1～4 周每日給予2.5%腺嘌呤混懸液250 mg/kg 灌胃1 次,第5 ～6 周隔日灌胃1 次。 正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng),生理鹽水10 mL/kg 灌胃。所有大鼠自由進食及飲水。

1.3.2 組織取材和指標(biāo)檢測

實驗第2、4、6 周末,分別于兩組中隨機選取大鼠6 只,收集24 h 尿液測定24 h 尿蛋白定量(24 hour urine protein,24 h-Upro)。 腹主動脈采血測定尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine, Scr) 及 血 鈣( calcium, Ca)、 血 磷(phosphorus,P)、1,25(OH)2D3、PTH、BALP、OC、tPINP、 β-CTX、TRACP-5b 含量。 留取腹主動脈行Von Kossa 染色及鈣含量測定。

(1)血、尿相關(guān)指標(biāo)檢測

全自動生化分析儀測定血BUN、Scr、24 h-Upro及 Ca、 P。 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 法( Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 測 定 血 清 1, 25(OH)2D3、PTH、BALP、OC、tPINP、β-CTX、TRACP-5b 含量。 所有試劑盒均購自上海泛柯實業(yè)有限公司,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

(2)全段主動脈Von Kossa 染色

主動脈置于細胞培養(yǎng)板中,GENMED 清理液清洗主動脈,吸去清理液；加入GENMED 固定液,室溫下孵育1 h,吸去固定液；再次用GENMED 清理液清洗主動脈2 次；加入GENMED 染色液,60 W 燈下直射室溫孵育1 h,吸去染色液；GENMED 清理液清洗主動脈；加入GENMED 平衡液,室溫下孵育5 min,吸去平衡液；GENMED 清理液清洗主動脈；觀察染色情況。

(3)主動脈鈣含量測定

取各組主動脈進行勻漿,留取上清液備用,按照試劑盒說明書進行相關(guān)操作步驟。 主動脈鈣含量(mmol/gprot)＝(測定OD 值-空白OD 值)/(標(biāo)準OD 值-空白OD 值)×標(biāo)準品濃度(1 mmol/L)÷待測樣本蛋白濃度(mmol/gprot)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 正態(tài)分布的計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準差()表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD 法；非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,兩組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗。 點二列相關(guān)分析血清骨代謝標(biāo)志物和鈣化程度的相關(guān)性。 二元logistic回歸分析血管鈣化及鈣化程度的獨立危險因素,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組和CKD 血管鈣化組腎功能和主動脈鈣含量的比較

與對照組比較,鈣化組各時間點BUN、Scr、24 h-Upro 及主動脈鈣含量均明顯升高(P＜0.05)；鈣化組中,6 周組大鼠主動脈鈣含量較2 周,4 周組明顯升高(P＜0.05)。 見表1。

2.2 全段主動脈Von Kossa 染色和腎形態(tài)

對照組各時間點全段主動脈Von Kossa 染色未見黑色物質(zhì)沉積；鈣化組各時間點全段主動脈Von Kossa 染色均可見黑色物質(zhì)沉積,隨時間進展黑色物質(zhì)沉積逐漸增多。 對照組各時間點腎大小正常,顏色暗紅。 CKD 血管鈣化組各時間點腎體積增大,顏色灰白,呈“大白腎”樣改變。 見圖1。

2.3 兩組大鼠骨代謝標(biāo)志物

與對照組相比,血管鈣化組Ca、1,25(OH)2D3、PTH 明顯降低(P＜0.05)；P、Ca*P 明顯升高(P＜0.05)；BALP、OC 升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；tPINP、 β-CTX、TRACP-5b 明顯降低(P＜0.05)。 見表2。

2.4 血管鈣化的危險因素分析

將VC 單因素分析顯示骨代謝標(biāo)志物差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)納入二元logistic 回歸模型,以是否發(fā)生VC 為因變量,以Ca、P、Ca*P、1,25(OH)2D3、PTH、tPINP、β-CTX、TRACP-5b 為自變量,結(jié)果顯示Ca*P 升高、PTH 和TRACP-5b 降低是VC 的獨立危險因素。 見表3。

表1 兩組大鼠腎功能、尿蛋白和主動脈鈣含量比較(n＝6)Table 1 Comparison of renal function, urinary protein and aortic calcium content between two groups of rats

圖1 各時間點全段主動脈Von Kossa 染色和腎形態(tài)Figure 1 Von Kossa staining of the entire aorta and kidney morphology at each time point

2.5 不同程度血管鈣化組相關(guān)指標(biāo)的比較

根據(jù)主動脈Von Kossa 染色及鈣含量的檢測結(jié)果,將其進一步分為輕中度鈣化組(即2 周和4 周CKD 鈣化組)和重度鈣化組(即6 周鈣化組)。 與輕中度鈣化組相比,重度鈣化組BUN、Scr 及主動脈鈣含量明顯升高(P＜0.05),24 h-Upro 升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 骨代謝標(biāo)志物：與輕中度鈣化組相比,重度鈣化組Ca*P、PTH、BALP、β-CTX明顯升高(P＜0.05),OC 明顯降低(P＜0.05),Ca、P、1,25(OH)2D3、tPINP、TRACP-5b 升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 見表4。

2.6 血管鈣化嚴重程度的危險因素分析

將VC 嚴重程度單因素分析顯示骨代謝標(biāo)志物差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)納入二元logistic 回歸模型,以是否發(fā)生嚴重鈣化為因變量,以Ca*P、PTH、BALP、β-CTX、OC 為自變量,結(jié)果顯示Ca*P 升高和OC 降低是VC 嚴重程度的獨立危險因素。 見表5。

2.7 骨代謝標(biāo)志物和血管鈣化程度的相關(guān)性分析

Ca*P、PTH、BALP、β-CTX 與鈣化程度正相關(guān),OC 與鈣化程度負相關(guān)。 見表6。

3 討論

目前,常用于建立CKD 大鼠模型的方法包括腎大部分切除法(約5/6),腎動脈部分分支結(jié)扎法,冷凍加切除法,阿霉素誘導(dǎo)法,腺嘌呤灌胃法等,上述方法各存在優(yōu)缺點[6]。 其中,腺嘌呤灌胃法誘導(dǎo)CKD 大鼠模型歷史悠久,進入體內(nèi)后的腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下形成難溶于水的2,8—二羥基腺嘌呤,該物質(zhì)經(jīng)腎小球濾過后沉積在腎小管導(dǎo)致腎小管上皮細胞受損,同時可堵塞腎小管引起梗阻性腎病使腎單位大量喪失,導(dǎo)致急性腎損傷并進一步發(fā)展為慢性腎衰竭[6]。 本課題組的前期研究表明,在腺嘌呤灌胃的基礎(chǔ)上聯(lián)合高磷飲食能建立可靠的CKD 大鼠血管鈣化模型[7]。 本研究繼續(xù)沿用該方法復(fù)制CKD 大鼠血管鈣化模型,結(jié)果顯示與對照組相比,各時間點CKD 血管鈣化組BUN、Scr、24 h-Upro 明顯升高,腎形態(tài)呈現(xiàn)“大白腎”樣改變,提示腎功能嚴重受損。 此外,各時間點CKD 血管鈣化組主動脈鈣含量均明顯高于對照組,全段主動脈Von Kossa 染色可見不同程度的黑色物質(zhì)沉積。Von Kossa 染色作為檢測VC 的方法之一,康婷等[8]研究證實Von Kossa 染色呈黑色時表明血管中膜大量鈣化結(jié)節(jié)形成。 因此,本研究的上述結(jié)果提示,隨著時間進展,腎功能不斷下降,主動脈鈣含量進一步升高,血管鈣化更加明顯,并出現(xiàn)CKD 典型的低鈣高磷血癥,表明CKD 大鼠血管鈣化模型建立成功。

表2 兩組大鼠骨代謝標(biāo)志物的比較(n＝18)Table 2 Comparison of bone metabolism markers between two groups of rats

表3 血管鈣化的危險因素分析Table 3 Analysis of risk factors for vascular calcification

表4 輕中度和重度血管鈣化組相關(guān)指標(biāo)的比較Table 4 Comparison of related indexes in mild to moderate and severe vascular calcification groups

表5 血管鈣化嚴重程度的危險因素分析Table 5 Analysis of risk factors for the severity of vascular calcification

表6 骨代謝標(biāo)志物和鈣化嚴重程度的相關(guān)性Table 6 Correlation between bone metabolism markers and calcification severity

骨骼是一個活躍的組織,在破骨細胞去除舊骨和成骨細胞產(chǎn)生骨基質(zhì)并通過基質(zhì)礦化形成新骨的骨重塑過程中,釋放出破骨細胞和成骨細胞分泌的酶和激素,以及骨基質(zhì)的膠原蛋白代謝產(chǎn)物或非膠原蛋白,這些物質(zhì)被稱為骨代謝標(biāo)志物,可及時反映骨代謝狀態(tài),包括一般骨代謝指標(biāo)和骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物兩類。 前者包含Ca,P,PTH,1,25(OH)2D3等,后者可進一步分為骨形成標(biāo)志物和骨吸收標(biāo)志物,如反映骨形成的BALP,tPINP,OC 等,反映骨吸收的β-CTX、TRACP-5b 等[9]。

既往認為VC 是細胞和組織間鈣磷結(jié)晶被動沉積于血管壁的過程,鈣化血管壁的主要成分為羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA),近年來大量研究表明VC 是血管平滑肌細(vascular smooth muscle cell,VSMC)向成骨細胞轉(zhuǎn)分化的復(fù)雜生物學(xué)過程,鈣化過程與骨骼形成類似[10],礦物質(zhì)骨異常有助于VC的發(fā)生[11]。 本研究發(fā)現(xiàn),在一般的骨代謝指標(biāo)中,與對照組相比,CKD 血管鈣化組Ca、1,25(OH)2D3和PTH 明顯降低,P 和Ca*P 升高,血清PTH 降低和Ca*P 升高是VC 的獨立危險因素。 腎功能衰竭后,腎小球濾過率下降,故尿磷排出減少,血磷逐漸升高。 PTH 具有升鈣降磷的生理作用,血清PTH 降低勢必導(dǎo)致血鈣降低,血磷進一步升高。 高磷血癥可抑制合成1,25(OH)2D3所必須的1α-羥化酶的活性,導(dǎo)致1,25(OH)2D3缺乏合成受阻。 此外,腎小管受損本身可直接導(dǎo)致1α-羥化酶缺乏,進一步加重1,25(OH)2D3缺乏,導(dǎo)致血鈣進一步降低。 因此,CKD 典型的礦物質(zhì)代謝紊亂表現(xiàn)為低血鈣、高血磷和1,25(OH)2D3缺乏。 大量研究表明,高磷血癥和Ca*P 升高是促進VC 發(fā)生和進展的主要原因,推測與高血磷上調(diào)成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2 和osterix 從而刺激VSMC 向成骨細胞轉(zhuǎn)分化,并促進VSMC 基體礦化和VSMC 凋亡細胞等相關(guān)[11-13]。維生素D 對骨骼礦化有重要作用,骨礦化受損與缺乏1,25(OH)2D3有關(guān)。 目前,1,25(OH)2D3缺乏促進VC 的確切機制尚不清楚,推測與骨礦化受阻致血清無機磷升高、促進成骨細胞分化因子MSX2、BMP2 和Runx2 的表達、誘導(dǎo)炎癥和氧化應(yīng)激致內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等相關(guān)[13-15]。

由于1,25(OH)2D3缺乏致骨形成和礦化過程受損,缺氧誘導(dǎo)因子-1α 和抗氧化劑Nrf2 減少致骨髓細胞表達血管內(nèi)皮生長因子-A 降低[16],尿毒癥毒素硫酸吲哚酚抑制成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子osterix,OC和BMP2 的mRNA 表達進而抑制骨形成,同時抑制RANKL 的表達進而抑制RANKL 依賴的破骨細胞分化和成熟等[17],CKD 骨轉(zhuǎn)換異?？杀憩F(xiàn)為低骨轉(zhuǎn)換[18-19]。 本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,CKD 血管鈣化組tPINP、β-CTX、TRACP-5b 明顯降低,低PTH和TRACP-5b 是VC 的獨立危險因素。 tPINP 和β-CTX 分別是反映骨形成和骨吸收的骨代謝標(biāo)志物[9],而TRACP-5b 主要來源于破骨細胞,是CKD患者良好的骨吸收標(biāo)志物。 此外,PTH 被認為是評估CKD 患者骨轉(zhuǎn)換最有價值的骨代謝標(biāo)志物[20-21],低PTH 預(yù)示著低骨轉(zhuǎn)換的可能性較大。因此,本研究結(jié)果表明CKD 血管鈣化大鼠呈低骨轉(zhuǎn)換,且與VC 密切相關(guān),這是由于低骨轉(zhuǎn)換使骨骼緩沖細胞外鈣和磷酸鹽的能力降低,循環(huán)中升高的鈣和無機磷難以進入骨骼,進而促進VC 的發(fā)生[19]。本研究還發(fā)現(xiàn),低TRACP-5b 是VC 的獨立危險因素。 磷酸化的骨橋蛋白(OPN)可抑制HA 的形成和生長,TRACP 能使OPN 去磷酸化從而消除OPN 對HA 的抑制作用[22],提示TRACP-5b 降低導(dǎo)致VC的發(fā)生可能與促進HA 沉積于血管平滑肌相關(guān)。 目前,TRACP-5b 導(dǎo)致VC 發(fā)生的機制研究甚少,未來需要進一步研究。

本研究進一步探討了骨代謝標(biāo)志物與鈣化嚴重程度的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)與輕中度鈣化組相比,重度鈣化組血清Ca*P、PTH、BALP、β-CTX 明顯升高并與鈣化程度正相關(guān),而OC 明顯降低并與鈣化程度負相關(guān),tPINP 和TRACP-5b 隨鈣化程度的增加呈上升趨勢,血清Ca*P 升高和OC 降低是鈣化嚴重程度的獨立危險因素。 BALP 由成骨細胞分泌,可通過去磷酸化使OPN 失活,從而抑制OPN 對體外礦化的抑制作用,在很大程度上促進VC 的發(fā)生[22]。 此外,BALP 可通過降解VC 的重要抑制劑焦磷酸鹽,促進血管中羥基磷灰石沉積導(dǎo)致VC[23],血清BALP 升高與主動脈鈣化正相關(guān)[24-25]。 OC 是骨礦化基質(zhì)中最豐富的非膠原蛋白,主要由成熟的成骨細胞分泌。 完全羧化的OC 對HA 的親和力高,血管壁OC 表達上調(diào)可促進血管中膜鈣化[26]。與之相反,未完全羧化的OC 與HA 的親和力低,更容易被釋放到血液循環(huán)中,并通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能和糖脂代謝及減輕炎癥等途徑對血管起保護作用[27-28],故血清OC 降低可能通過破壞血管內(nèi)皮功能和糖脂代謝平衡間接導(dǎo)致血管鈣化。 在亞洲進行的研究中,有37%的報告表明血清OC 與VC 或動脈粥樣硬化負相關(guān)[28],低血清OC 會增加心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險[29-30]。 另外,盡管BALP 和OC 均為反映骨形成的指標(biāo),但本次研究發(fā)現(xiàn)隨著腎功能下降,血清BALP 升高而OC 降低,這可能是由于首先,BALP 合成與骨基質(zhì)礦化密切相關(guān),當(dāng)骨骼礦化受阻時成骨細胞分泌大量的BALP,使血清BALP 明顯升高[9]。 其次,VSMC 轉(zhuǎn)分化為成骨樣細胞后可分泌BALP[23],故循環(huán)中BALP 水平的增加可能部分來自鈣化的動脈[31]。 最后,OC 是在骨基質(zhì)礦化之后才能表達[9],故骨骼礦化受阻時血清BALP 升高而OC 降低。 由此可見,本研究發(fā)現(xiàn)盡管CKD 血管鈣化大鼠處于低骨轉(zhuǎn)換狀態(tài),但隨著低鈣血癥、高磷血癥、1,25(OH)2D3缺乏和骨骼對PTH 抵抗的發(fā)生,骨代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PTH 分泌逐漸增多。 升高的血清PTH 直接作用于成骨細胞和骨細胞促進骨形成,間接作用于破骨細胞促進骨吸收,加速骨重塑和骨轉(zhuǎn)換。 在這種情況下,成骨細胞和破骨細胞的活性增加,大量的鈣和磷酸鹽從骨骼中釋放出來。 此外,由于快速的骨重塑阻止了新形成骨的充分礦化,循環(huán)中鈣和無機磷的水平進一步增加,從而促進血管鈣化的發(fā)生和進展[5,19]。 因此,本研究的上述結(jié)果表明,隨著血清PTH、BALP 和β-CTX 的升高和OC 降低,血管鈣化程度增加,表明骨轉(zhuǎn)換速率加快和骨骼礦化受損均可加劇血管鈣化,這與骨代謝加快致骨骼釋放鈣和磷增加以及骨骼礦化受阻共同導(dǎo)致血清鈣磷水平升高有關(guān),同時這也是Ca*P 升高作為血管鈣化嚴重程度獨立危險因素的原因之一。

綜上所述,本次研究表明CKD 大鼠血管鈣化與礦物質(zhì)骨代謝紊亂緊密相關(guān),鈣磷乘積升高和骨轉(zhuǎn)換異常會促進血管鈣化的發(fā)生及進展。 CKD 大鼠血管鈣化與血清骨代謝標(biāo)志物的關(guān)系密切,通過檢測血清骨代謝標(biāo)志物,有利于評估血管鈣化的發(fā)生、判斷其嚴重程度并預(yù)測其進展,對臨床上制定和改善CKD-MBD 的診療方案有重要意義,進而有助于降低CKD 患者心血管疾病的發(fā)生率及死亡率,未來有必要進行更多的研究以進一步探討相關(guān)骨代謝標(biāo)志物導(dǎo)致血管鈣化的具體機制。