董琳琳閆慧敏豐晨然石 璐苗 豐趙一穎陳 芳孫文燕*郝 靜*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理系,北京 102488；2.國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院中醫(yī)科,北京 100045)

咳嗽是兒童常見(jiàn)多發(fā)病,多伴有咳痰、喘息等表現(xiàn),往往反復(fù)發(fā)作,難以根治。 該病病理表現(xiàn)多以慢性氣道炎癥、氣道高阻力為主,易受吸煙及環(huán)境中的過(guò)敏原或生活污染物影響[1]。 痰濕蘊(yùn)肺型咳嗽在臨床中較為常見(jiàn),中醫(yī)理論認(rèn)為其主要病因是陰虛肺熱,脾腎虧虛[2]。 痰喘寧合劑為北京兒童醫(yī)院的院內(nèi)制劑,用于痰濕蘊(yùn)肺型患兒有確切臨床療效[3],而對(duì)其藥效尚缺乏系統(tǒng)研究。 本研究分別采用卵蛋白所致過(guò)敏性哮喘大鼠模型、氯化乙酰甲膽堿及磷酸組胺引喘豚鼠模型、氨水引咳小鼠模型、枸櫞酸引咳豚鼠模型、小鼠氣管段酚紅排泌量實(shí)驗(yàn),觀察痰喘寧合劑的平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰作用,以期為其臨床合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠5 周齡(體重130 ～150 g)84只,SPF 級(jí)ICR 小鼠4 周齡(體重14 ～16 g)144 只,均雌雄各半,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 SPF 級(jí)豚鼠4 周齡132 只,體重200～230 g,雌雄各半,購(gòu)自于北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心[SCXK(京)2018-0010]。 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,實(shí)驗(yàn)期間,保持動(dòng)物房室溫在(21±5)℃,相對(duì)濕度為40%～70%,光照條件設(shè)置為12 h/12 h 明暗交替。 實(shí)驗(yàn)大鼠自由進(jìn)食,自由飲水。所有涉及動(dòng)物的相關(guān)實(shí)驗(yàn)程序均已經(jīng)過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)術(shù)委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理小組委員會(huì)批準(zhǔn)(bucm-4-20190611-2045),大鼠、小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(京)2016-0038],豚鼠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室[SYXK(京)2016-0013],并經(jīng)過(guò)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理審查通過(guò)(20193004)。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有操作均符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

痰喘寧合劑(北京兒童醫(yī)院)；卵蛋白(Sigma,批號(hào)：SLBV7493)；注射用氫氧化鋁凝膠(Pierce,批號(hào)： SH255260)； 磷 酸 組 胺, 氯 化 乙 酰 甲 膽 堿(Bioruler,批號(hào)分別為：3410,r621712)；醋酸地塞米松(天津力生制藥股份有限公司,批號(hào)：20170401)；氨溴特羅(北京韓美藥品有限公司, 批號(hào)：H20040317)；小青龍合劑(西安天一秦昆制藥有限責(zé)任公司,批號(hào)：180306)； 10%中性緩沖福爾馬林固定液,Harris 蘇木素,0.5%伊紅,中性樹(shù)膠封片劑(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)；Rat IgE、IL-4、IL-17、TNF-α ELISA 試劑盒(瑞格博,批號(hào)分別為：20200129.60139R、 20200129.60021R、 20200129.60032R、20200129.60080R)；瑞氏吉姆薩染色液(南京建成)；枸櫞酸,酚紅(Salarbio,批號(hào)分別為：126E041,1211C031)；氨水(北京化工廠(chǎng),批號(hào)：20141008)。

402A、B 型超聲霧化器(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)；Buxco 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氣道阻力和肺順應(yīng)性有創(chuàng)檢測(cè)儀器(美國(guó)Buxco 公司)； 移液器(美國(guó)Eppendoff 公司)；臺(tái)式離心機(jī),低溫水平高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific 公司)；Tissue-TEK VIP6 生物組織脫水儀、Tissue-TEK TEC 生物組織包埋儀(日本櫻花公司)；Leica RM2235 組織切片儀、Leica HI1210 撈片機(jī)、Leica HI1220 烤片機(jī)、Leica ST5020自動(dòng)染色儀、Leica CV5030 自動(dòng)封片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；Olympus BX53 顯微鏡(美國(guó)奧林帕斯公司)Path QC 病理質(zhì)控和資料管理系統(tǒng)(中國(guó)朗珈公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Epoch, BioTek 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 痰喘寧合劑平喘作用研究

(1)卵蛋白(OVA)所致哮喘大鼠實(shí)驗(yàn)

將SD 大鼠隨機(jī)分為7 組[4]：正常組、模型組、痰喘寧合劑低劑量組(7.5 mL/kg)、痰喘寧合劑中劑量組(15 mL/kg)、痰喘寧合劑高劑量組(30 mL/kg)、醋酸地塞米松組(0.55 mg/kg),小青龍合劑組(4 mL/kg)。 每組12 只,雌雄各半。 除正常組外,其余動(dòng)物建立哮喘大鼠模型：于實(shí)驗(yàn)第1 日、第8 日在大鼠的腹腔、兩腹股溝注射每mL 含10 mg OVA、100 mg AL(OH)3的混懸液,注射劑量為(腹腔0.5 mL,兩腹股溝各0.25 mL),正常組注射相同體積的生理鹽水。 實(shí)驗(yàn)第15 天,各組按劑量灌胃,正常組及模型組給予生理鹽水。 模型組和各給藥組在給生理鹽水或相應(yīng)藥物1 h 后用1% OVA 霧化激發(fā)30 min,正常組則用生理鹽水代替,連續(xù)7 d。 于末次激發(fā)24 h 后,大鼠麻醉,仰面固定,氣管插管,置于密閉體描箱內(nèi),肺功能儀系統(tǒng)輔助呼吸。 等待大鼠氣道阻力基線(xiàn)穩(wěn)定,滴加不同濃度的氯化乙酰甲膽堿20 μL(0、6.25、12.5 和50 mg/mL),霧化30 s,記錄3 min,檢測(cè)氣道阻力(RL)。 將大鼠從密閉體描箱取出,腹主動(dòng)脈取血,室溫靜置2 h 后,4℃,3000 r/min離心10 min,ELISA 法檢測(cè)血清中IgE、IL-4、IL-17和TNF-α 的含量。 分別將2 mL、2 mL、1mL 生理鹽水于氣管插管處緩慢注入,停留約10 s 后,緩慢抽回, 收集灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid,BALF),4℃,1500 r/min 離心10 min,取沉淀用0.2 mL PBS 混懸,瑞氏染色,用于WBC 及EOS 計(jì)數(shù)。取出大鼠右肺下葉組織,將其置于10%福爾馬林固定液中,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋并切片,HE 染色,光學(xué)顯微鏡下觀察右肺下葉組織病理變化,并進(jìn)行支氣管及周?chē)装Y評(píng)分。 根據(jù)其病變的嚴(yán)重程度半定量為：無(wú)病變,記0 級(jí),為0 分；輕度,記Ⅰ級(jí),為1分；中度,記II 級(jí),為2 分。

HE 染色步驟如下：二甲苯溶液I、II 浸泡各15 min 脫蠟；100%乙醇溶液I、II 浸泡5 min；95%、85%、75%梯度乙醇溶液浸泡,各5 min；蘇木素染液染色5 min,水洗；鹽酸乙醇溶液分化2 ～3 s,水洗；氨水溶液浸泡返藍(lán)1 min,水洗；伊紅染液染色5 min；75%、85%、95%梯度乙醇溶液浸泡,各5 min；100%乙醇溶液I、II 浸泡,各5 min；二甲苯溶液I、II浸泡,各5 min；中性樹(shù)膠封片。

(2)氯化乙酰甲膽堿及磷酸組胺引喘豚鼠實(shí)驗(yàn)

將豚鼠置于霧化器內(nèi)[5],以2%氯化乙酰甲膽堿與0.1%磷酸組胺等體積混合液定量恒壓噴霧10 s,記錄2 min 內(nèi)豚鼠從接受?chē)婌F開(kāi)始到出現(xiàn)喘息性抽搐,直至跌倒的潛伏期。 引喘潛伏期超過(guò)120 s者舍棄不用。 將篩選出的豚鼠隨機(jī)分為模型組、痰喘寧合劑低劑量組(8.4 mL/kg)、痰喘寧合劑中劑量組(16.8 mL/kg)、痰喘寧合劑高劑量組(33.6 mL/kg)、氨溴特羅組(4.5 mL/kg)、小青龍合劑組(4.5 mL/kg),每組10 只,雌雄各半。 各組按劑量灌胃,模型組灌胃等量生理鹽水,連續(xù)7 d。 末次給藥1 h 后,用上述方法測(cè)定各組豚鼠引喘潛伏期。

1.3.2 痰喘寧合劑鎮(zhèn)咳作用研究

(1)枸櫞酸引咳豚鼠實(shí)驗(yàn)

將豚鼠置于霧化器內(nèi)[6],以17.5%的枸櫞酸霧化1 min,并持續(xù)刺激4 min,測(cè)定5 min 內(nèi)豚鼠的咳嗽次數(shù),小于10 次者舍去。 將篩選合格的豚鼠隨機(jī)分為模型組、痰喘寧合劑低劑量組(8.4 mL/kg)、痰喘寧合劑中劑量組(16.8 mL/kg)、痰喘寧合劑高劑量組(33.6 mL/kg)、氨溴特羅組(4.5 mL/kg)、小青龍合劑組(4.5 mL/kg),每組10 只,雌雄各半。 各組按劑量灌胃,模型組灌胃等量生理鹽水,連續(xù)3 d。末次給藥1 h 后,用上述方法測(cè)定各組豚鼠咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)。

(2)氨水引咳小鼠實(shí)驗(yàn)

將小鼠隨機(jī)分為模型組、痰喘寧合劑低劑量組(5.72 mL/kg)、痰喘寧合劑中劑量組(11.43 mL/kg)、痰喘寧合劑高劑量組(22.85 mL/kg)、氨溴特羅組(5.70 mL/kg)、小青龍合劑組(6.50 mL/kg),每組12 只,雌雄各半。 各組小鼠按劑量灌胃,模型組灌胃等量的生理鹽水,連續(xù)3 d。 末次給藥1 h后,將小鼠置于倒置的500 mL 燒杯中,放入注有0.2 mL 氨水的棉球。 1 min 后將棉球取出,觀察2 min。 小鼠第一次咳嗽(小鼠張大嘴,同時(shí)腹部收縮,偶有咳嗽聲)時(shí)間即為咳嗽潛伏期,并記錄3 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.3.3 痰喘寧合劑祛痰作用研究

將小鼠隨機(jī)分為模型組[6]、痰喘寧合劑低劑量組(5.72 mL/kg)、痰喘寧合劑中劑量組(11.43 mL/kg)、痰喘寧合劑高劑量組(22.85 mL/kg)、氨溴特羅組(5.70 mL/kg)、小青龍合劑組(6.50 mL/kg),每組12 只,雌雄各半。 各組小鼠按劑量灌胃,模型組灌胃等量的生理鹽水,連續(xù)3 d。 末次給藥30 min后,腹腔注射2.5%的酚紅溶液(0.2 mL/10 g)。 30 min 后處死,剪開(kāi)頸部,暴露氣管,剪下自甲狀軟骨至氣管分叉處的一段氣管,放入2 mL 碳酸氫鈉與生理鹽水的混合液中(比例為1 ∶15),酶標(biāo)儀檢測(cè)546 nm 處的吸光度(OD)值,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算酚紅排泌量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 痰喘寧合劑平喘作用研究

2.1.1 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致哮喘大鼠氣道阻力的影響

相較于正常組,模型組大鼠RL在乙酰甲膽堿濃度為0、12.5、50 mg/mL 時(shí)均升高(P＜0.05)。 相較于模型組,痰喘寧合劑低劑量組與小青龍合劑組在乙酰甲膽堿濃度為0、12.5、50 mg/mL 時(shí)RL降低(P＜0.05 或P＜0.01)；痰喘寧合劑中劑量組在乙酰甲膽堿濃度為6.25 mg/mL 時(shí),相對(duì)于模型組,RL有所升高(P＜0.05)；醋酸地塞米松組在乙酰甲膽堿濃度為50 mg/mL 時(shí),RL降低(P＜0.05)。 結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.2 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致哮喘大鼠血清IgE、IL-4、IL-17 和TNF-α 水平的影響

相較于正常組,模型組大鼠血清中IgE、IL-4、IL-17 和TNF-α 水平升高(P＜0.01)；相較于模型組,醋酸地塞米松組IgE 水平降低,痰喘寧合劑各劑量組IgE 水平均有降低趨勢(shì)(P＞0.05)；相較于模型組,痰喘寧合劑中劑量組及醋酸地塞米松組IL-4、IL-17 及TNF-α 水平降低(P＜0.05 或P＜0.01)；小青龍合劑組IL-17 水平降低(P＜0.01)。 結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.3 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致哮喘大鼠肺泡灌洗液WBC 及EOS 的影響

相較于正常組,模型組大鼠BALF 中WBC 數(shù)量和EOS 百分比升高(P＜0.01)。 相較于模型組,痰喘寧合劑各劑量組、醋酸地塞米松組及小青龍合劑組均可降低BALF 中WBC 數(shù)量和EOS 百分比(P＜0.01)。 結(jié)果見(jiàn)表3。

2.1.4 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致哮喘大鼠肺組織病理影響

正常組大鼠支氣管管腔未見(jiàn)擴(kuò)張,管腔內(nèi)無(wú)分泌物,皺襞如常,上皮細(xì)胞未見(jiàn)變性、壞死及脫落,平滑肌層未見(jiàn)增生,管壁未見(jiàn)增厚；周?chē)芪匆?jiàn)增生及擴(kuò)張,間質(zhì)及肺泡腔未見(jiàn)明顯炎癥。 模型組大鼠支氣管管腔局部見(jiàn)代償性擴(kuò)張,管腔內(nèi)見(jiàn)分泌物,皺襞或增生或平坦,上皮細(xì)胞變性,局部可見(jiàn)脫落,管壁增厚,平滑肌層增生明顯；周?chē)茉錾?、擴(kuò)張,間質(zhì)及肺泡腔見(jiàn)中等量炎癥,肺組織炎癥評(píng)分升高(與正常組相比,P＜0.01)。 痰喘寧合劑低劑量組支氣管管腔輕度擴(kuò)張,管腔內(nèi)罕見(jiàn)分泌物,皺襞較為平坦,上皮細(xì)胞輕度變性,未見(jiàn)壞死及脫落,管壁輕度增厚,平滑肌層增生較少量；周?chē)茉錾?、擴(kuò)張,間質(zhì)及肺泡腔見(jiàn)中等量炎癥,肺組織炎癥評(píng)分有降低趨勢(shì)(與模型組相比,P＞0.05)。 痰喘寧合劑中劑量組支氣管管腔輕度擴(kuò)張,支氣管管腔內(nèi)未見(jiàn)分泌物,皺襞較為明顯,上皮細(xì)胞變性不明顯,未見(jiàn)壞死及脫落,管壁輕度增厚,平滑肌層增生不明顯；周?chē)倭垦茉錾?、擴(kuò)張,間質(zhì)及肺泡腔見(jiàn)少量炎癥,肺組織炎癥評(píng)分降低(與模型組相比,P＜0.05)。 痰喘寧合劑高劑量組支氣管管壁輕度擴(kuò)張,管腔內(nèi)未見(jiàn)分泌物,皺襞較為明顯,上皮細(xì)胞變性不明顯,未見(jiàn)壞死及脫落,管壁增厚及平滑肌層增生均不明顯；周?chē)鷺O少量血管增生、擴(kuò)張,間質(zhì)及肺泡腔見(jiàn)少量炎癥,肺組織炎癥評(píng)分降低(與模型組相比,P＜0.01)。 醋酸地塞米松組支氣管管腔擴(kuò)張不明顯,管腔內(nèi)可見(jiàn)分泌物,皺襞代償性增生,上皮細(xì)胞輕度變性,未見(jiàn)壞死及脫落,支氣管管壁輕度增厚,平滑肌層增生不明顯；周?chē)茉錾?、擴(kuò)張,間質(zhì)及肺泡腔見(jiàn)中等量炎癥,肺組織炎癥評(píng)分降低(與模型組相比,P＜0.05)。 小青龍合劑組支氣管管腔擴(kuò)張不明顯,支氣管管腔內(nèi)偶見(jiàn)分泌物,皺襞代償性增生,管腔上皮細(xì)胞輕度變性,未見(jiàn)壞死及脫落,管壁輕度增厚,平滑肌層增生不明顯；周?chē)茉錾?、擴(kuò)張,間質(zhì)及肺泡腔見(jiàn)中等量炎癥(與模型組相比,P＞0.05)。 結(jié)果見(jiàn)表4 及圖1。

表1 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致哮喘大鼠RL 的影響( , cmH2O/(mL/s), n＝12)Table 1 Effects of Tanchuanning Mixture on airway resistance in asthmatic rats induced by OVA

表1 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致哮喘大鼠RL 的影響( , cmH2O/(mL/s), n＝12)Table 1 Effects of Tanchuanning Mixture on airway resistance in asthmatic rats induced by OVA

注：與正常組相比,aP ＜0.05；與模型組相比,cP ＜0.05, dP ＜0.01。Note.Compared with the normal group, aP ＜0.05.Compared with the model group, cP ＜0.05, dP ＜0.01.

Mch(mg/mL) 劑量(mL/kg)Dose 0 6.25 12.5 50正常組Normal group - 0.34±0.09 0.46±0.11 0.51±0.07 0.60±0.13模型組Model group - 0.45±0.12a 0.50±0.21 0.72±0.30a 1.01±0.47a醋酸地塞米松組Dexamethasone acetate group 0.55(mg/kg) 0.44±0.30 0.59±0.29 0.66±0.21 0.71±0.23c小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.00 0.32±0.08c 0.38±0.09 0.50±0.15c 0.49±0.16d痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 7.50 0.31±0.11d 0.46±0.12 0.46±0.14d 0.61±0.26c痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 15.00 0.37±0.10 0.58±0.13c 0.66±0.10 0.77±0.25痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 30.00 0.39±0.08 0.52±0.16 0.64±0.31 0.74±0.31

2.1.5 痰喘寧合劑對(duì)氯化乙酰甲膽堿及磷酸組胺引喘豚鼠的影響

相較于模型組,痰喘寧合劑各劑量組、氨溴特羅組、小青龍合劑組引喘潛伏期均延長(zhǎng)(P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表2 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致哮喘大鼠血清IgE、IL-4、IL-17 及TNF-α 水平的影響(n＝12)Table 2 Effect of Tanchuanning Mixture on the levels of serum IgE, IL-4, IL-17 and TNF-α in asthmatic rats induced by OVA

表2 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致哮喘大鼠血清IgE、IL-4、IL-17 及TNF-α 水平的影響(n＝12)Table 2 Effect of Tanchuanning Mixture on the levels of serum IgE, IL-4, IL-17 and TNF-α in asthmatic rats induced by OVA

注：與正常組相比, bP ＜0.01；與模型組相比,cP ＜0.05, dP ＜0.01.Note.Compared with the normal group, bP ＜0.01.Compared with the model group, cP ＜0.05, dP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose IgE (U/mL) IL-4 (ng/L) IL-17 (ng/L) TNF-α (ng/L)正常組Normal group - 6.40±1.38 34.25±4.25 45.65±10.94 60.19±16.62模型組Model group - 11.44±5.36b 47.27±16.07b 86.35±41.51b 110.73±65.31b醋酸地塞米松組Dexamethasone acetate group 0.55(mg/kg) 6.14±3.47d 28.55±10.60d 41.73±24.33d 46.81±30.94d小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.00 8.59±1.19 38.43±5.28 56.90±9.51d 75.30±19.49痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 7.50 9.06±4.12 40.20±8.95 64.31±24.01 81.17±32.63痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 15.00 7.98±2.79 35.1±9.67c 53.26±16.17d 64.56±35.10c痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 30.00 10.20±3.97 43.92±12.94 69.01±32.59 97.46±51.16

表3 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致哮喘大鼠BALF 中WBC 及EOS 的影響(,n＝12)Table 3 Effect of Tanchuanning Mixture on WBC and EOS in BALF of OVA-induced asthma rats

表3 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致哮喘大鼠BALF 中WBC 及EOS 的影響(,n＝12)Table 3 Effect of Tanchuanning Mixture on WBC and EOS in BALF of OVA-induced asthma rats

注：與正常組相比,bP ＜0.01；與模型組相比, dP ＜0.01.Note.Compared with the normal group, bP ＜0.01.Compared with the model group, dP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose WBC(107/L) EOS(%)正常組Normal group - 15.08±2.91 1.67±1.15模型組Model group - 46.08±8.35b 5.92±1.88b醋酸地塞米松組Dexamethasone acetate group 0.55(mg/kg) 31.17±6.51d 3.50±1.31d小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.00 33.25±6.84d 3.58±1.44d痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 7.50 35.58±6.89d 3.75±1.36d痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 15.00 33.42±6.64d 3.42±1.24d痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 30.00 33.67±5.53d 3.25±1.54d

表4 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致支氣管哮喘大鼠肺組織病變程度的影響(n＝12)Table 4 Effect of Tanchuanning Mixture on the degree of lung tissue lesion in bronchial asthma rats induced by OVA

表4 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致支氣管哮喘大鼠肺組織病變程度的影響(n＝12)Table 4 Effect of Tanchuanning Mixture on the degree of lung tissue lesion in bronchial asthma rats induced by OVA

注：與正常組相比, bP ＜0.01；與模型組相比,cP ＜0.05, dP ＜0.01。Note.Compared with the normal group, bP ＜0.01.Compared with the model group, cP ＜0.05, dP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose病變程度Grade of pathological changes 0 級(jí)Grade 0 I 級(jí)Grade I II 級(jí)Grade II評(píng)分Score正常組Normal group - 8 4 0 0.33±0.49模型組Model group - 0 6 6 1.50±0.52b醋酸地塞米松組Dexamethasone acetate group 0.55(mg/kg) 2 8 2 1.00±0.60c小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.00 0 3 9 1.75±0.45痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 7.50 1 8 3 1.16±0.57痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 15.00 2 8 2 1.00±0.60c痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 30.00 3 9 0 0.75±0.45d

圖1 痰喘寧合劑對(duì)OVA 所致哮喘大鼠肺組織病理的影響(HE 染色)Note.A, Normal group.B, Model group.C, Dexamethasone acetate group.D, Xiaoqinglong Mixture group.E, Low dosage group.F,Moderate dosage group.G,High dosage group.Figure 1 Effect of Tanchuanning Mixture on the pathology of lung tissue in asthma rats induced by OVA (HE staining)

2.2 痰喘寧合劑鎮(zhèn)咳作用研究

2.2.1 痰喘寧合劑對(duì)枸櫞酸引咳豚鼠的影響

相較于模型組,痰喘寧合劑中、高劑量組,氨溴特羅組,小青龍合劑組咳嗽潛伏期均延長(zhǎng)(P＜0.01),低劑量組咳嗽潛伏期有延長(zhǎng)趨勢(shì)(P＞0.05)。 相較于模型組,痰喘寧合劑各劑量組、氨溴特羅組、小青龍合劑組咳嗽次數(shù)減少(P＜0.01 或P＜0.05)。 結(jié)果見(jiàn)表6。

2.2.2 痰喘寧合劑對(duì)氨水引咳小鼠的影響

相較于模型組,痰喘寧合劑各劑量組,氨溴特羅組,小青龍合劑組咳嗽潛伏期均延長(zhǎng)(P＜0.01)；相較于模型組,痰喘寧合劑各劑量組、氨溴特羅組、小青龍合劑組咳嗽次數(shù)均減少(P＜0.01)。 結(jié)果見(jiàn)表7。

2.3 痰喘寧合劑祛痰作用研究

相較于模型組,痰喘寧合劑低、高劑量組,氨溴特羅組,小青龍合劑組氣管段酚紅排泌量均升高(P＜0.01 或P＜0.05)。 結(jié)果見(jiàn)表8。 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。

表5 痰喘寧合劑對(duì)豚鼠引喘作用的影響(,n＝10)Table 5 Effect of Tanchuanning Mixture on guinea pig's induced asthma

表5 痰喘寧合劑對(duì)豚鼠引喘作用的影響(,n＝10)Table 5 Effect of Tanchuanning Mixture on guinea pig's induced asthma

注：與模型組相比, bP ＜0.01。Note.Compared with the model group, bP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose引喘潛伏期(s)Induced asthma incubation period模型組Model group - 34.1±6.66氨溴特羅組Ambroxol Group 4.5 94.3±28.99b小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.5 59.7±13.37b痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 8.4 62.9±19.46b痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 16.8 67.4±14.57b痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 33.6 69.8±8.33b

表6 痰喘寧合劑對(duì)枸櫞酸引咳豚鼠的影響(,n＝10)Table 6 Effect of Tanchuanning Mixture on citrate guinea pig

表6 痰喘寧合劑對(duì)枸櫞酸引咳豚鼠的影響(,n＝10)Table 6 Effect of Tanchuanning Mixture on citrate guinea pig

注：與模型組相比,aP ＜0.05, bP ＜0.01.Note.Compared with the model group, aP ＜0.05, bP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose咳嗽潛伏期(s)Cough latency咳嗽次數(shù)(次)Number of coughs (times)模型組Model group - 108.7±44.07 24.1±9.49氨溴特羅組Ambroxol Group 4.5 170.9±38.95b 6.3±4.08b小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.5 211.1±62.64b 4.8±2.09b痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 8.4 115.2±63.97 14.9±6.47a痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 16.8 168.9±38.22b 5.8±3.55b痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 33.6 197.9±57.02b 4.1±2.28b

表7 痰喘寧合劑對(duì)氨水引咳小鼠的影響(n＝12)Table 7 Effect of Tanchuanning Mixture on mice induced by cough with ammonia

表7 痰喘寧合劑對(duì)氨水引咳小鼠的影響(n＝12)Table 7 Effect of Tanchuanning Mixture on mice induced by cough with ammonia

注：與模型組相比, bP ＜0.01。Note.Compared with the model group, bP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose咳嗽潛伏期(s)Cough latency咳嗽次數(shù)(次)Number of coughs (times)模型組Model group - 51.92±13.91 45.42±9.37氨溴特羅組Ambroxol Group 5.70 108.25±31.83b 11.33±4.50b小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 6.50 115.92±20.87b 11.42±4.19b痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 5.72 69.08±26.42b 30.33±11.83b痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 11.43 87.75±23.13b 24.08±14.52b痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 22.85 92.67±19.80b 22.25±12.06b

表8 痰喘寧合劑對(duì)小鼠氣管段酚紅排泌量的影響( ,n＝12)Table 8 Effect of Tanchuanning Mixture on the excretion of phenol red in tracheal segment of mice

表8 痰喘寧合劑對(duì)小鼠氣管段酚紅排泌量的影響( ,n＝12)Table 8 Effect of Tanchuanning Mixture on the excretion of phenol red in tracheal segment of mice

注：與模型組相比,aP ＜0.05, bP ＜0.01。Note.Compared with the model group, aP ＜0.05, bP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose酚紅濃度(μg/mL)Phenol red concentration模型組Model group - 0.075±0.0048氨溴特羅組Ambroxol Group 5.70 0.088±0.013b小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 6.50 0.094±0.018b痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 5.72 0.090±0.013b痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 11.43 0.082±0.012痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 22.85 0.087±0.018a

圖2 酚紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure 2 Standard curve of phenol red

3 討論

兒童咳嗽、咳喘易反復(fù)發(fā)作,最終可引發(fā)哮喘。痰喘寧合劑組方是閆慧敏教授在老專(zhuān)家劉韻遠(yuǎn)先生治療咳喘經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)上,根據(jù)當(dāng)代兒童咳喘特點(diǎn)進(jìn)行加減化裁而成[3],全方由炙麻黃、白果、醋五味子、干姜、炒紫蘇子、白前、蜜百部、川芎、青黛等12 味中藥組成,有宣肺化痰、止咳平喘功效,作為北京兒童醫(yī)院的協(xié)定處方及院內(nèi)制劑在臨床用于兒童咳喘的治療已有二十余年,尤其在治療痰濕蘊(yùn)肺型患兒方面,療效確切。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)痰喘寧合劑平喘、鎮(zhèn)咳和祛痰作用進(jìn)行了研究。

哮喘患者因炎癥導(dǎo)致氣道狹窄造成氣道阻力增大,最終表現(xiàn)出咳喘,呼吸急促等表現(xiàn)[7]。 氣道高反應(yīng)性是評(píng)判哮喘模型是否成功的重要客觀性指標(biāo)之一。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中多采用有創(chuàng)或無(wú)創(chuàng)方法進(jìn)行氣道阻力測(cè)定來(lái)反映氣道順應(yīng)性情況[8]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于正常組,模型組氣道阻力隨乙酰甲膽堿濃度升高而顯著升高,提示本研究大鼠哮喘模型復(fù)制成功；相比于模型組,痰喘寧合劑低劑量組氣道阻力顯著降低,中、高劑量組有一定降低趨勢(shì),提示痰喘寧合劑對(duì)氣道高反應(yīng)性具有一定的降低作用。

哮喘是IgE 介導(dǎo)的以炎性細(xì)胞浸潤(rùn),炎性因子分泌增多為主要特征的呼吸系統(tǒng)疾病。 IgE 與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的IgE 受體結(jié)合并激活細(xì)胞,釋放組胺及炎癥介質(zhì),引發(fā)炎癥反應(yīng)[9]。 Th1/Th2細(xì)胞失衡學(xué)說(shuō)是哮喘發(fā)病機(jī)制之一[10]。 Th2 細(xì)胞介導(dǎo)嗜酸性細(xì)胞炎癥反應(yīng)。 炎性因子IL-4 由Th2細(xì)胞分泌,而IL-4 分泌增多可導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞的蓄積,加重炎癥反應(yīng)。 IL-4 還可促進(jìn)IgE 的合成,從而加重氣道炎癥[11]。 本研究中,模型組血清IgE、IL-4 水平顯著升高,痰喘寧合劑中劑量組IL-4 水平明顯降低,痰喘寧合劑各劑量組IgE 均呈下降趨勢(shì)。研究表明,Th2 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)在揭示哮喘發(fā)作機(jī)制方面稍顯不足,Th17 細(xì)胞也參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展[12]。IL-17 由Th17 細(xì)胞分泌,不僅參與Th17 細(xì)胞介導(dǎo)的嗜中性細(xì)胞氣道炎癥,還可加重Th2 細(xì)胞誘導(dǎo)的嗜酸性細(xì)胞炎癥[13]。 TNF-α 是常見(jiàn)的內(nèi)源性炎性因子,通過(guò)募集炎性細(xì)胞,促進(jìn)其他炎性因子的釋放使炎癥加重,還可引起氣道高反應(yīng)性[14],增加氧化應(yīng)激參與哮喘的發(fā)生發(fā)展[15]。 臨床研究表明,在哮喘患者的肺組織及痰液中檢測(cè)到高水平的TNF-α。本研究顯示,痰喘寧合劑可降低IL-17、TNF-α 水平,減少BALF 中WBC 及EOS 數(shù)量,減輕大鼠肺組織病理?yè)p害和氣道炎癥。

乙酰膽堿作為一種神經(jīng)遞質(zhì),可促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞釋放趨化因子,使大量炎性細(xì)胞及炎性因子聚集在氣道平滑肌,增強(qiáng)其收縮能力,加重哮喘病情[16]。 組胺由肥大細(xì)胞釋放,當(dāng)機(jī)體受到過(guò)敏原刺激時(shí),組胺釋放增多,造成氣道狹窄,呼吸困難。 在豚鼠實(shí)驗(yàn)中,磷酸組胺可通過(guò)其受體,使氣道平滑肌收縮增強(qiáng),加重氣道炎癥。 因此,本研究采用二者結(jié)合的方式,研究痰喘寧合劑的平喘作用。 結(jié)果顯示,豚鼠出現(xiàn)明顯的呼吸困難,喘息甚至跌倒癥狀,而痰喘寧合劑各劑量組可明顯延長(zhǎng)豚鼠的引喘潛伏期,提示痰喘寧合劑可顯著改善氣道平滑肌痙攣等癥狀,具有一定的平喘作用。

咳嗽是咳嗽中樞受到外界刺激的一種生理反應(yīng),咳嗽反復(fù)發(fā)作極大地影響了患者的生活質(zhì)量[17]。 咳嗽反射弧包括感受器、傳入神經(jīng)、神經(jīng)中樞、效應(yīng)器、傳出神經(jīng),對(duì)反射弧中的感受器和傳出神經(jīng)進(jìn)行刺激最易引發(fā)咳嗽反應(yīng)。 本研究采用氨水及枸櫞酸引咳小鼠及豚鼠,結(jié)果表明痰喘寧合劑各劑量組均能明顯延長(zhǎng)咳嗽潛伏期及減少咳嗽次數(shù),鎮(zhèn)咳作用明顯。

痰液由氣管及支氣管黏膜分泌。 正常狀態(tài)下,痰液分泌較少,可濕潤(rùn)呼吸道。 疾病狀態(tài)下,痰液過(guò)于黏稠,不易排出,可引起氣道狹窄,從而加重病情[18]。 祛痰藥物多為降低痰液黏稠度,促進(jìn)痰液排出。 祛痰作用實(shí)驗(yàn)中,酚紅作為指示劑,可通過(guò)其排泌量的多少間接評(píng)價(jià)藥物的祛痰效果。 結(jié)果表明,痰喘寧合劑可增加小鼠氣管段的酚紅排泌量,提示痰喘寧合劑對(duì)痰液的排出有一定的促進(jìn)作用。

以上研究結(jié)果表明,痰喘寧合劑具有一定的平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰作用,但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。