田 璐

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,沈陽 110032)

卵巢癌為女性生殖器官常見惡性腫瘤,發(fā)病率排在女性各類腫瘤的第3 位,而致死率高居第1 位,嚴(yán)重威脅女性生命健康[1-2]。 由于卵巢癌缺少有效準(zhǔn)確的早期診斷方法,加之發(fā)病隱匿,導(dǎo)致確診患者中約70%～80%已為晚期,失去了手術(shù)治療的最佳時期[3]。 化療為晚期卵巢癌的主要治療手段,雖然可暫時緩解病情,但存在嚴(yán)重的毒副作用、耐藥及高復(fù)發(fā)率等缺點[4]。 卵巢癌的轉(zhuǎn)移及侵襲是導(dǎo)致治療失敗和死亡的首要原因,如何抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移及侵襲對提高患者的治愈率和生存率至關(guān)重要[5]。

傳統(tǒng)中藥由于具有多靶點、多途徑、療效確切及低毒副作用等優(yōu)勢,在卵巢癌的治療領(lǐng)域逐漸引起了人們的關(guān)注[6-7]。 扶正抗癌湯為遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑,已廣泛應(yīng)用于非小細胞肺癌等多種腫瘤的治療,取得了很好的臨床療效[8]。 然而關(guān)于扶正抗癌湯對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及侵襲作用的研究報道較少。 因此,本研究以人卵巢癌HO-8910PM 細胞為研究對象,主要觀察扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞轉(zhuǎn)移及侵襲的作用,并進一步探討其能否通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3 通路及影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進程起到抗卵巢癌轉(zhuǎn)移及侵襲的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠,雄性48 只,體重200 ～220 g,6～8 周齡,購于沈陽茂華生物科技有限公司[SCXK(遼)2017-0001]。 SD 大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[SYXK(遼)2019-0004]；本實驗獲我校實驗動物倫理委員會審批(21000092018069),按照實驗動物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 實驗細胞

人卵巢癌HO-8910PM 細胞,購于上海美軒生物科技公司。

1.2 主要試劑與儀器

扶正抗癌湯由紅人參25 g、白術(shù)10 g、甘草10 g、半夏15 g、浙貝母15 g、枳殼15 g、陳皮15 g、半枝蓮10 g、白花舌草50 g、竹茹20 g、茯苓20 g 及生姜5 g 組成；經(jīng)2 次水煎后,合并藥液,并濃縮至含生藥2 g/mL 藥液,過濾,分裝滅菌。 胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶,美國Mediatech 公司；Matrigel 膠,美國BD公司；Transwell 小室,美國康寧公司；纖維連接蛋白(FN)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒,上海酶聯(lián)生物公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時定量PCR檢測試劑盒,日本TaKaRa 公司；轉(zhuǎn)移生長因子-β1(TGF-β1)、磷酸化Smad 同源物蛋白3(p-Smad3)多克隆抗體,美國Cell Signaling 公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體,北京金杉中橋生物公司。 超凈工作臺(型號：SW-CJ1FD,蘇州凈化設(shè)備公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號：3111,美國Thermo 公司)；倒置相差顯微鏡(型號：DFC259,德國Leica 公司)；多功能酶標(biāo)儀(型號：ELX808,美國BioTek 公司)；實時定量PCR 系統(tǒng)(型號：7500,美國ABI 公司)；蛋白電泳儀(型號：DYCZ-24EN,北京六一儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備含藥血清

將48 只SD 大鼠隨機分為正常組及扶正抗癌湯低、中、高劑量組,12 只/組；依據(jù)人與大鼠劑量換算方法,以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量/人的體重×6.3 為高劑量(18.9 g/(kg?d))組,在此基礎(chǔ)上稀釋1 倍(9.45 g/(kg?d))為中劑量組,稀釋2 倍為低劑量(4.725 g/(kg?d))組,灌胃給藥,每天1 次；正常組灌胃等體積蒸餾水,給藥體積為1 mL/100 g,共持續(xù)7 d。 末次灌胃給藥后2 h,經(jīng)后股動脈采血,分離血清；在56℃條件下將補體滅活,用0.22 μm 無菌濾膜過濾,分裝于離心管中在低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基對HO-8910PM 細胞進行培養(yǎng),培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃；使用胰蛋白酶(0.25%)消化細胞及傳代,至對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗研究。

1.3.3 劃痕實驗檢測HO-8910PM 細胞轉(zhuǎn)移能力

在6 孔培養(yǎng)板中接種對數(shù)生長期的HO-8910PM 細胞,用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng),待24 h 細胞貼壁后,倒掉培養(yǎng)基；PBS 漂洗后,用無菌的移液器槍頭沿中軸輕輕劃線。 PBS漂洗,加入DMEM 培養(yǎng)基(分別含10%正常組大鼠血清及10%低、中、高劑量扶正抗癌湯組大鼠含藥血清),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,拍照。 通過給藥前與給藥后的劃痕寬度,計算細胞相對遷移率,細胞相對遷移率(%)＝(1～24 h 劃痕寬度/0 h 劃痕寬度)× 100%

1.3.4 Transwell 實驗檢測HO-8910PM 細胞侵襲能力

將稀釋好的Matrigel 膠加入到Transwell 小室中,37℃下于CO2培養(yǎng)箱中放置1 h,將多余培養(yǎng)基棄掉。 HO-8910PM 細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,離心后用無血清培養(yǎng)基重懸,并調(diào)整密度為每毫升1×106個,取200 μL 細胞懸液加入到Transwell 上室中；下室加入700 μL DMEM 培養(yǎng)基(分別含10%正常組大鼠血清及10%低、中、高劑量扶正抗癌湯組大鼠含藥血清),繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 將多余培養(yǎng)液棄掉,經(jīng)4%多聚甲醛固定,并用結(jié)晶紫染色0.5 h。 顯微鏡下拍照,并計數(shù)細胞穿膜個數(shù)。

1.2.2 q-PCR檢測 將患者的組織標(biāo)本分成二份，一份在液氮下磨碎，并用TRIzol 試劑盒提取RNA，檢測RNA在波長260 和280 nm 處的光密（D）值（使用紫外分光光度儀），逆轉(zhuǎn)錄成為 cDNA 后，再通過引物進行PCR的擴增，測引物序列[6-7]。

1.3.5 ELISA 實驗檢測HO-8910PM 細胞上清液FN 蛋白表達

HO-8910PM 細胞在DMEM 培養(yǎng)基(分別含10%正常組大鼠血清及10%低、中、高劑量扶正抗癌湯組大鼠含藥血清)培養(yǎng)12 h、24 h 及48 h 后,離心,收集各組細胞上清液。 參考FN 檢測試劑盒中的操作步驟,通過ELISA 實驗檢測細胞上清液FN蛋白表達。

1.3.6 實時定量PCR 實驗檢測HO-8910PM 細胞E-Cadherin、vimentin 及N-Cadherin mRNA 表達

HO-8910PM 細胞用DMEM 培養(yǎng)基(分別含10%正常組大鼠血清及10%低、中、高劑量扶正抗癌湯組大鼠含藥血清)培養(yǎng)24 h 后,離心,收集各組細胞。 TRIzol 法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,實時定量PCR 引物由大連寶生物公司合成。E-cadherin 引物：上游5 '-GACACTGGTGCCATTTCC AC-3',下游5'-AGTTCGAGGTTCTGGTATGGG-3'；vimentin 引物：上游5'-AGGCAAAGCAGGAGTCCA CT-3',下游5'-CGTTCCAGGGACTCATTGGT-3'；Ncadherin 引 物： 上 游5'-GCAACGACGGGTTAGTC ACC-3',下游5'-GACACGGTTGCAGTTGACTGAG-3'；GAPDH 引物：上游5'-GCACAGTCAAGGCTG AGAATG-3', 下 游 5 '-ATGGTGGTGAAGACGCC AGTA-3'。 實時定量PCR 反應(yīng)體系為：上、下游引物各1 μL,2×SYBR Green Mix 10 μL,蒸餾水6 μL,cDNA 2 μL,總反應(yīng)體積20 μL。 以GAPDH 作為內(nèi)參基因,通過2-△△Ct法,檢測各組HO-8910PM 細胞E-Cadherin、vimentin 及N-Cadherin mRNA 的表達。

1.3.7 Western blot 實驗檢測HO-8910PM 細胞TGF-β1、p-Smad3 蛋白表達

HO-8910PM 細胞處理方法同“1.3.6”。 細胞總蛋白使用RIPA 裂解液提取,按照BCA 試劑說明書檢測細胞蛋白含量。 每個上樣孔加20 μg 蛋白樣品,10% SDS-PAGE 分離,濕法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉。 分別加入TGF-β1、p-Smad3 抗體,稀釋比例為1∶2500,4℃孵育過夜；TBST 溶液漂洗3 次后,加入稀釋好的二抗(1 ∶5000),4℃孵育1 h。 TBST 溶液漂洗,加入ECL 發(fā)光液顯色,拍照,各組細胞光密度值用Image Lab 軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 扶正抗癌湯含藥血清抑制HO-8910PM 細胞轉(zhuǎn)移

2.2 扶正抗癌湯含藥血清抑制HO-8910PM 細胞侵襲

本研究通過Transwell 實驗檢測了扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞侵襲能力的影響,結(jié)果見表2 及圖2。 與正常組比較,低、中、高劑量扶正抗癌湯組含藥血清處理HO-8910PM 細胞24 h后,HO-8910PM 細胞穿膜細胞數(shù)明顯降低(P＜0.01),且該作用具有劑量依賴性。

2.3 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞FN蛋白表達的影響

FN 蛋白參與EMT 進程,在腫瘤細胞間的黏附、轉(zhuǎn)移及侵襲中發(fā)揮重要作用,本研究采用ELISA 法檢測了扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞FN蛋白表達的影響,結(jié)果見表3。 與正常組比較,低、中、高劑量扶正抗癌湯組含藥血清處理HO-8910PM細胞12 h、24 h 和48 h 后,HO-8910PM 細胞在三個時間點的FN 蛋白表達均明顯降低(P＜0.05 或P＜0.01),且該作用具有時間依賴性及劑量依賴性。

圖1 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞遷移率的影響Note.A, Normal group.B～D, 4.725, 9.45, 18.9 g/(kg?d) FZKAT drug serum groups.Figure 1 Effect of FZKAT drug serum on migration rate of HO-8910PM cells

表1 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞遷移率的影響( ,n＝5)Table 1 Effect of FZKAT drug serum on migration rate of HO-8910PM cells

表1 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞遷移率的影響( ,n＝5)Table 1 Effect of FZKAT drug serum on migration rate of HO-8910PM cells

注：與正常組比較,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group, **P＜0.01.

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表2 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞侵襲能力的影響(,n＝5)Table 2 Effect of FZKAT drug serum on invasion of HO-8910PM cells

表2 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞侵襲能力的影響(,n＝5)Table 2 Effect of FZKAT drug serum on invasion of HO-8910PM cells

注：與正常組比較,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group, **P＜0.01.

組別Groups劑量(g/(kg?d))Dose穿膜細胞數(shù)(個)Wear membrane cell count (number)正常組Normal group 0 154.55±18.02扶正抗癌湯低劑量組FZKAT drug serum low dose group 4.725 105.48±12.67**扶正抗癌湯中劑量組FZKAT drug serum medium dose group 9.450 67.92±8.46**扶正抗癌湯高劑量組FZKAT drug serum high dose group 18.900 48.37±5.13**

圖2 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM細胞侵襲能力的影響Note.A, Normal group.B ～D, 4.725, 9.45, 18.9 g/(kg?d))FZKAT drug serum groups.Figure 2 Effect of FZKAT drug serum on invasion of HO-8910PM cells

2.4 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞ECadherin、vimentin 及N-Cadherin mRNA 表達的影響

EMT 進程在細胞水平上以間質(zhì)特性增強,上皮特性喪失為主要特征,在分子水平上表現(xiàn)為vimentin 和N-cadherin 表達增加,而E-cadherin 表達減少。 本研究采用實時定量PCR 法檢測了扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞E-Cadherin、vimentin 及N-Cadherin mRNA 表達的影響,結(jié)果見表4。 與正常組比較,低、中、高劑量扶正抗癌湯組含藥血清處理HO-8910PM 細胞24 h 后,HO-8910PM 細胞E-cadherin mRNA 表達增加(P＜0.01),而vimentin 和N-cadherin mRNA 表達減少(P＜0.01)。

2.5 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞TGF -β1/Smad3 通路的影響

TGF-β1/Smad3 通路在EMT 發(fā)生和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲過程起著重要調(diào)控作用,本研究采用Western blot實驗檢測了扶正抗癌湯含藥血對HO-8910PM 細胞TGF-β1 及p-Smad3 蛋白表達的影響,結(jié)果見圖3 及表5。 與正常組比較,低、中、高劑量扶正抗癌湯組含藥血清處理HO-8910PM 細胞24 h后,HO-8910PM 細胞TGF-β1、p-Smad3 蛋白表達顯著減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞FN 蛋白表達的影響( ,n＝5)Table 3 Effect of FZKAT drug serum on FN expression of HO-8910PM cells

表3 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞FN 蛋白表達的影響( ,n＝5)Table 3 Effect of FZKAT drug serum on FN expression of HO-8910PM cells

注：與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別Groups劑量(g/(kg?d))Dose纖維連接蛋白(ng/mL)Fibronectin 12 h 24 h 48 h正常組Normal group 0 72.36±8.64 73.12±8.46 71.82±7.23扶正抗癌湯低劑量組FZKAT drug serum low dose group 4.725 63.94±7.20* 59.69±6.87** 54.87±6.76**扶正抗癌湯中劑量組FZKAT drug serum medium dose group 9.450 61.38±7.79** 52.51±5.04** 40.23±5.37**扶正抗癌湯高劑量組FZKAT drug serum high dose group 18.900 55.53±6.05** 41.40±6.38** 33.41±5.22**

表4 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞E-Cadherin、vimentin 及N-Cadherin mRNA 表達的影響(,n＝5)Table 4 Effect of FZKAT drug serum on E-Cadherin, vimentin and N-Cadherin mRNA expressions of HO-8910PM cells

表4 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞E-Cadherin、vimentin 及N-Cadherin mRNA 表達的影響(,n＝5)Table 4 Effect of FZKAT drug serum on E-Cadherin, vimentin and N-Cadherin mRNA expressions of HO-8910PM cells

注：與正常組比較,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group, **P＜0.01.

組別Groups劑量(g/(kg?d))Dose E-鈣黏蛋白E-Cadherin波形蛋白Vimenti N-鈣黏蛋白N-Cadherin正常組Normal group 0 0.30±0.04 0.45±0.06 0.64±0.08扶正抗癌湯低劑量組FZKAT drug serum low dose group 4.725 0.36±0.04** 0.31±0.03** 0.43±0.05**扶正抗癌湯中劑量組FZKAT drug serum medium dose group 9.450 0.42±0.05** 0.27±0.04** 0.39±0.04**扶正抗癌湯高劑量組FZKAT drug serum high dose group 18.900 0.51±0.05** 0.22±0.03** 0.38±0.05**

3 討論

EMT 是指由上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象,其在卵巢癌、骨肉瘤、胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌及乳腺癌等多種腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲中起著關(guān)鍵性作用[9-10]。 FN 蛋白廣泛存在于細胞外液、細胞表面及結(jié)締組織中,是細胞外基質(zhì)的重要組成成分,參與細胞的粘附、遷移及分化；在EMT 進程中FN 表達升高,進而促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲[11]。 Ecadherin 表達減少,vimentin 和N-cadherin 表達增加是腫瘤細胞發(fā)生EMT 的重要證據(jù)。 E-Cadherin 參與維持上皮組織完整性和細胞極性,廣泛存在于上皮組織中,當(dāng)腫瘤細胞E-Cadherin 表達下調(diào)時,可引起侵襲性生長,導(dǎo)致腫瘤細胞的遠端轉(zhuǎn)移[12]。Vimentin 主要負責(zé)維持細胞骨架的完整性,為間充質(zhì)來源細胞中的一種中間纖絲蛋白,vimentin 高表達標(biāo)志著EMT 進程及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲的發(fā)生[13]。 N-cadherin 參與細胞黏附、細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞識別及細胞運動等生物學(xué)過程,其表達量與腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲程度呈正相關(guān)性[14]。

TGF-β1/Smad3 通路在腫瘤細胞的增殖、凋亡、EMT 進程及轉(zhuǎn)移、侵襲中發(fā)揮著重要作用[15]。TGF-β1 存在于多種細胞中,具有抑制免疫監(jiān)視、刺激細胞增殖、分化、遷移及促進炎癥因子表達等作用[16]。 研究發(fā)現(xiàn)[17],在惡性腫瘤細胞中TGF-β1 表達量增加,進而與p-Smad3 形成復(fù)合物并一同進入細胞核內(nèi),介導(dǎo)EMT 進程,引發(fā)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲過程。 阻礙TGF-β1/Smad3 通路活化,影響EMT進程是抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲的關(guān)鍵[18]。 研究發(fā)現(xiàn)[19],白藜蘆醇可以阻斷TGF-β1/Smad3 信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制人肺癌A549 細胞的增殖及EMT 進程,減少A549 細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲。 血根堿也可以干預(yù)TGF-β1/Smad 信號通路,抑制卵巢癌A2780/Taxol細胞的生長及轉(zhuǎn)移[20]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,低、中、高劑量扶正抗癌湯組含藥血清處理HO-8910PM 細胞后,遷移率及穿膜細胞數(shù)均明顯降低,提示扶正抗癌湯具有抑制人卵巢癌HO-8910PM 細胞轉(zhuǎn)移及侵襲的作用；同時,vimentin、N-cadherin mRNA 表達及FN、TGF-β1、p-Smad3 蛋白表達也明顯降低,而Ecadherin mRNA 表達增加,表明扶正抗癌湯抑制人卵巢癌HO-8910PM 細胞轉(zhuǎn)移及侵襲的作用與阻礙TGF-β1/Smad3 通路活化,進而調(diào)節(jié)EMT 進程有關(guān)。

圖3 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM細胞TGF-β1/Smad3 通路的影響Note.A, Normal group.B ～D, 4.725, 9.45, 18.9 g/(kg?d)) FZKAT drug serum groups.Figure 3 Effect of FZKAT drug serum on TGF-β1 and p-Smad3 protein expressions of HO-8910PM cells

表5 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞TGF-β1、p-Smad3 蛋白表達的影響(,n＝5)Table 5 Effect of FZKAT drug serum on TGF-β1 and p-Smad3 protein expressions of HO-8910PM cells

表5 扶正抗癌湯含藥血清對HO-8910PM 細胞TGF-β1、p-Smad3 蛋白表達的影響(,n＝5)Table 5 Effect of FZKAT drug serum on TGF-β1 and p-Smad3 protein expressions of HO-8910PM cells

注：與正常組比較,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group, **P＜0.01.

組別Groups劑量(g/(kg?d))Dose轉(zhuǎn)移生長因子-β1/甘油醛-3-磷酸脫氫酶TGF-β1/GAPDH磷酸化Smad 同源物蛋白3/甘油醛-3-磷酸脫氫酶p-Smad3/GAPDH正常組Normal group 0 1.43±0.17 0.95±0.11扶正抗癌湯低劑量組FZKAT drug serum low dose group 4.725 1.14±0.12** 0.34±0.04**扶正抗癌湯中劑量組FZKAT drug serum medium dose group 9.450 0.42±0.05** 0.23±0.03**扶正抗癌湯高劑量組FZKAT drug serum high dose group 18.900 0.30±0.04** 0.19±0.02**