曾珍，胡瑩

·綜述·

CRISPR/Cas系統(tǒng)在抗菌治療領(lǐng)域的研究進(jìn)展

曾珍，胡瑩

650101 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

抗生素能夠有效控制細(xì)菌感染，但隨著抗生素的濫用與細(xì)菌適應(yīng)，細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，已對(duì)全球公共衛(wèi)生與環(huán)境安全構(gòu)成重大威脅[1]。削弱細(xì)菌的耐藥性，防止出現(xiàn)多重耐藥以及耐藥性傳播已經(jīng)成為急需解決的問題。此外，傳統(tǒng)的抗生素一般都是廣譜類抗生素，在對(duì)致病菌進(jìn)行滅殺時(shí)也會(huì)對(duì)其他有益菌造成一定的損害，長期使用可能會(huì)導(dǎo)致菌群失調(diào)并加劇細(xì)菌耐藥[2]。

細(xì)菌在面對(duì)外源遺傳物質(zhì)（如噬菌體和質(zhì)粒）的入侵時(shí)，會(huì)形成一個(gè)抵御這些外源遺傳物質(zhì)的免疫防御系統(tǒng)，即成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及關(guān)聯(lián)基因（CRISPR associated，Cas）組成的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)[3-4]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)于 1987 年由 Ishino 等[5]在大腸埃希菌中首次發(fā)現(xiàn)。之后的研究表明，CRISPR/Cas 系統(tǒng)還分布于 40% 已測序細(xì)菌和 90% 已測序古細(xì)菌的基因組中[6-7]。目前，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經(jīng)被開發(fā)成為一種新型的抗菌劑，它能通過靶向破壞目標(biāo)基因（如抗生素耐藥基因或毒力基因），使細(xì)菌恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感甚至直接致其死亡，同時(shí)限制有害基因在微生物間的轉(zhuǎn)移和流行。此外，有研究已經(jīng)證實(shí)，利用 CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以從混合菌群中選擇性地殺傷某種特定細(xì)菌，而不會(huì)對(duì)周圍其他菌株產(chǎn)生影響，從而為“微生物組編輯”的探索應(yīng)用開辟了一種新的思路和方法。

1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制

近年來，CRISPR/Cas 系統(tǒng)發(fā)展迅猛，除了基因編輯領(lǐng)域，在生物醫(yī)學(xué)及藥物開發(fā)等不同領(lǐng)域中也逐步得到應(yīng)用[8]。目前，CRISPR/Cas 系統(tǒng)根據(jù) Cas 蛋白作用機(jī)制的不同，被劃分為 Type I、Type II 和 Type III 等 3 種不同的類型[9]，并且還可以進(jìn)一步細(xì)分。其中，Type II 型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)（CRISPR/Cas9 系統(tǒng)）具有結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、特異性高等特點(diǎn)，是研究最為深入且應(yīng)用最成熟的一種類別。Type II 型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的位點(diǎn)結(jié)構(gòu)如圖 1 所示，主要由 CRISPR 序列、上游的前導(dǎo)序列（Leader）和 Cas 基因三部分構(gòu)成。其中，CRISPR 序列由多個(gè)短而高度保守的重復(fù)序列（21 ~ 48 bp）和多個(gè)長度相似的間隔序列（26 ~72 bp）組成。在重復(fù)序列中含有長度為 5 ~ 7 bp 的回文序列，可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，它是識(shí)別靶標(biāo)基因的關(guān)鍵元件。間隔序列則是被細(xì)菌俘獲的外源 DNA 序列。CRISPR/Cas 系統(tǒng)發(fā)揮作用的關(guān)鍵之一就是能夠?qū)υ俅稳肭旨?xì)菌的這些外源遺傳物質(zhì)予以精確打擊。前導(dǎo)序列位于 CRISPR 位點(diǎn)的上游，長約 550 bp，它被認(rèn)為是 CRISPR 序列的啟動(dòng)子。上游的 Cas 基因是一個(gè)多態(tài)性的家族基因，包括有 Cas 1 ~ 10 等多種類型，它是 CRISPR 免疫防御途徑中的基本組成成分。此外，Cas 基因編碼的 Cas 蛋白都可以和 CRISPR 序列區(qū)域共同發(fā)生作用。Cas 基因與 CRISPR 序列共同進(jìn)化，最終在細(xì)菌中形成了高度保守的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)[10]。

圖 1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖

在 CRISPR/Cas 系統(tǒng)中，CRISPR 序列通過與 Cas 蛋白進(jìn)行配合來防御外源遺傳物質(zhì)的入侵，其作用機(jī)制可以分為三步。①外源 DNA 的俘獲。當(dāng)病毒入侵時(shí)，CRISPR/Cas 系統(tǒng)需要俘獲一段外源 DNA 序列，然后找到其原間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM），并將鄰近 PAM 的 DNA 序列作為候選的原間隔序列。接著，在 Cas1/2 蛋白復(fù)合物以及其他酶的協(xié)助下，CRISPR/Cas 系統(tǒng)會(huì)從這段外源 DNA 序列中將原間隔序列剪切下來，插入到基因組 CRISPR 位點(diǎn)的 5' 端，從而將其作為新的間隔序列整合到基因組的 CRISPR 序列之中。②crRNA（CRISPR RNAs）的合成。在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，CRISPR/Cas 系統(tǒng)會(huì)在病毒入侵時(shí)轉(zhuǎn)錄出前體 crRNA（pre-CRISPR-derived RNA，pre-crRNA）和反式激活 crRNA（trans-acting crRNA，tracrRNA）兩種類型的 RNA。tracrRNA 的主要功能是作為連接 crRNA 和 Cas 蛋白的橋梁。接著，根據(jù)入侵者的類型同時(shí)在核糖核酸酶 III 的協(xié)助下，pre-crRNA、tracrRNA 以及 Cas9 編碼的 Cas 蛋白組成的復(fù)合體會(huì)選取對(duì)應(yīng)的間隔序列 RNA 并對(duì)其進(jìn)行剪切，crRNA 因此得以形成。為了下一步的剪切，crRNA、Cas9 蛋白以及 tracrRNA 會(huì)進(jìn)一步組合，形成最終的復(fù)合物。③靶向干擾。在病毒的二次感染中，為了能識(shí)別出與 crRNA 互補(bǔ)的原間隔序列，crRNA、Cas9 以及 tracrRNA 組成的復(fù)合物會(huì)對(duì)整個(gè)外源DNA 序列進(jìn)行掃描，同時(shí)定位到 PAM/原間隔序列的區(qū)域。此時(shí)，外源 DNA 的雙鏈將被解開，互補(bǔ)鏈會(huì)與合成的 crRNA 進(jìn)行雜交，同時(shí)另一條鏈保持游離狀態(tài)。隨后，Cas9 蛋白發(fā)揮作用，與 crRNA 互補(bǔ)的 DNA 鏈以及非互補(bǔ)的 DNA 鏈被剪切。最終，Cas9 使 DNA 雙鏈斷裂，沉默外源 DNA 的表達(dá)，入侵者也因此被消滅。

作為一種強(qiáng)大的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以定點(diǎn)且精確地對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行編輯。隨著對(duì) CRISPR/Cas 系統(tǒng)的進(jìn)一步研究，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因敲除、基因替換、基因激活、疾病模型構(gòu)建，甚至是基因治療等領(lǐng)域。

2 CRISPR/Cas 在抗菌治療中的應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas 的抗耐藥菌應(yīng)用

隨著抗生素的濫用以及細(xì)菌適應(yīng)，細(xì)菌多重耐藥以及耐藥性傳播等問題不斷出現(xiàn)，采取必要的措施削弱細(xì)菌的耐藥性已刻不容緩[11]。針對(duì)這一現(xiàn)象，一些新型的非抗生素療法在針對(duì)耐藥菌感染方面的優(yōu)異表現(xiàn)開始得到研究人員的關(guān)注。CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以通過設(shè)計(jì)靶向耐藥相關(guān)基因或耐藥細(xì)菌的基因組 gRNA（guide RNA），然后對(duì)耐藥細(xì)菌特有靶向序列進(jìn)行切割，使耐藥細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感得以恢復(fù)甚至直接致其死亡，在基因水平上為防治細(xì)菌多重耐藥的研究提供了新的方向[12]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)抗耐藥菌的基本原理是利用噬菌體將 CRISPR/Cas 系統(tǒng)相關(guān)基因傳遞到耐藥菌內(nèi)，當(dāng)靶向耐藥基因位于耐藥性質(zhì)粒上時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)靶向耐藥基因的切割會(huì)導(dǎo)致耐藥性質(zhì)粒的丟失，耐藥菌對(duì)抗生素的敏感性能夠被恢復(fù)。當(dāng)靶向耐藥基因位于耐藥細(xì)菌的基因組上時(shí)，CRISPR/Cas 系統(tǒng)切割靶向耐藥基因會(huì)導(dǎo)致 DNA 雙鏈斷裂，從而使得耐藥菌死亡[13]。此外，如果 CRISPR/Cas 系統(tǒng)能夠在耐藥菌中穩(wěn)定存在并且遺傳下來，當(dāng)含有相同靶向耐藥基因的 DNA 片段再次入侵耐藥菌時(shí)，CRISPR/Cas 系統(tǒng)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行防御，并且可以抑制耐藥基因的傳播[14]。

通過 CRISPR/Cas 系統(tǒng)沉默耐藥細(xì)菌的耐藥相關(guān)基因，可以達(dá)到抑制細(xì)菌耐藥性的目的。Kim 等[15]為了恢復(fù)產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamase，ESBL）大腸桿菌對(duì)抗生素的敏感性，利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)靶向超廣譜耐 β-內(nèi)酰胺類抗生素的大腸桿菌中的抗生素抗性基因，成功清除了產(chǎn) ESBL 大腸桿菌內(nèi)的抗生素耐藥性質(zhì)粒。因此，這種對(duì)耐藥性抗生素的重新敏化（ReSAFR）技術(shù)可對(duì)攜帶抗生素耐藥性質(zhì)粒的多藥耐藥性（MDR）細(xì)菌進(jìn)行治療。Citorik 等[16]和 Bikard 等[17]分別以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌體內(nèi)本身所含的抗生素耐藥性質(zhì)粒為靶標(biāo)，同時(shí)利用噬菌粒為載體來傳遞 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。最終，細(xì)菌中的抗生素耐藥性質(zhì)粒被成功清除，耐藥菌對(duì)抗生素的敏感性也得到恢復(fù)。Chen 和 Novick[18]利用噬菌粒介導(dǎo)的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)有效去除了金黃色葡萄球菌中攜帶抗生素抗性基因的耐藥性質(zhì)粒，從而使金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素重新敏感化。

細(xì)菌針對(duì)抗生素不斷出現(xiàn)的耐藥性給臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)，對(duì) CRISPR/Cas 系統(tǒng)的研究為人們解決這一問題迎來了轉(zhuǎn)機(jī)[19]。此外，CRISPR 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能與細(xì)菌的耐藥性密切相關(guān)，對(duì)兩者之間的關(guān)系進(jìn)行深入分析將有助于更好地理解細(xì)菌的耐藥機(jī)制，進(jìn)而為防治細(xì)菌耐藥提供新的方向。

2.2 CRISPR/Cas選擇性靶向細(xì)菌群體

通過對(duì)細(xì)菌生長過程中一些保守的代謝途徑進(jìn)行抑制或破壞，廣譜類抗生素往往能達(dá)到不錯(cuò)的殺菌或抑菌效果，但廣譜類抗生素在殺菌過程中無法有效區(qū)分殺菌對(duì)象，除了滅殺致病菌也會(huì)損害有益菌。長期使用廣譜類抗生素也會(huì)產(chǎn)生一些問題，如導(dǎo)致環(huán)境與人體腸道內(nèi)的菌群失調(diào)、細(xì)菌耐藥性的不斷累積與傳播等。因此，為了維持正常的微生物菌群，能夠在特異性地殺傷某種病原菌時(shí)不會(huì)對(duì)環(huán)境中的其他微生物造成不利影響顯得尤為重要。CRISPR/Cas 系統(tǒng)的出現(xiàn)，使得人們可以設(shè)計(jì)具有特定殺菌作用的CRISPR 抗菌劑。

2014 年，Gomaa 等[20]的研究表明，使用 CRISPR/Cas 系統(tǒng)進(jìn)行基因組靶向可用于個(gè)別細(xì)菌菌株和物種的序列特異性和可滴定去除。此外，還以大腸桿菌中的 I-E 型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為模型，證明了 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的自我靶向作用，同時(shí)成功清除了混合菌株中某一特定的菌株并且使所有其他鄰近的菌株不受影響。為了對(duì)細(xì)菌殺傷的特異性進(jìn)行控制，該研究采用了靶向某個(gè)細(xì)菌獨(dú)有序列的方式，從而為人們實(shí)現(xiàn)選擇性地殺傷混合菌群中某種特定細(xì)菌奠定了堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Bikard 等[17]利用含有CRISPR/Cas 系統(tǒng)的噬菌體侵染金黃色釀膿葡萄球菌后，通過靶向毒力基因，成功殺死了有毒的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）。此外，在小鼠皮膚感染的實(shí)驗(yàn)中，CRISPR/Cas 抗菌素也能夠有效減少小鼠皮膚定植模型中的金黃色葡萄球菌的數(shù)量。Citorik 等[16]以噬菌體作為運(yùn)送載體，將完整的外源性 CRISPR/Cas 系統(tǒng)傳遞到大腸桿菌之中，通過靶向 β-內(nèi)酰胺酶 1（NDM-1）基因和含一個(gè)突變的 gyrA 基因，選擇性殺死了表達(dá)特定靶基因的耐喹諾酮大腸桿菌。

此外，有研究報(bào)道可以應(yīng)用 CRISPR/Cas 技術(shù)來研發(fā)序列特異性的抗生素，這些抗生素發(fā)揮作用的關(guān)鍵是使用單鏈向?qū)NA(single-guide RNA，sgRNA)引導(dǎo) Cas9 核酸內(nèi)切酶選擇性靶向病原體特定的 DNA 序列[16-17]。與常規(guī)的抗生素相比，在選擇好特定的靶基因后，CRISPR/Cas 抗菌劑可以用于與靶基因相匹配的 sgRNA 進(jìn)行編程。因此，在選擇性地殺死含有特定靶基因的細(xì)菌時(shí)，CRISPR/Cas 抗菌劑能夠使周圍其他的細(xì)菌不受影響。因此，CRISPR/Cas 系統(tǒng)為研究者們創(chuàng)造了以序列特異性方式操縱復(fù)雜細(xì)菌種群的機(jī)會(huì)。

3 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的問題及應(yīng)對(duì)措施

由于具有對(duì)病原菌序列高效且特異性清除的優(yōu)點(diǎn)，CRISPR/Cas 抗菌藥具有不錯(cuò)的效果和特異性，能夠成為一種有潛力替代傳統(tǒng)抗生素的新型抗菌武器。但是，將 CRISPR/Cas 系統(tǒng)應(yīng)用于抗菌治療仍然存在一些問題有待解決。

首先，使用 CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為殺菌藥物，需要找到一種安全有效的遞送途徑將 CRISPR/Cas 系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌細(xì)胞內(nèi)。噬菌體天然靶向細(xì)菌的優(yōu)勢能夠有效地將 CRISPR/Cas 系統(tǒng)相關(guān)基因運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌中。但是，利用噬菌體作為 CRISPR/Cas 系統(tǒng)運(yùn)載工具也存在和噬菌體療法相同的缺點(diǎn)，如噬菌體侵染的專一性會(huì)導(dǎo)致其應(yīng)用范圍過窄[21]，細(xì)菌在面對(duì)噬菌體入侵時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致噬菌體入侵的效率降低，噬菌體裂解病原菌造成的內(nèi)毒素釋放，以及噬菌體在應(yīng)用到臨床上時(shí)需要考慮的安全性問題。針對(duì)上述問題，可以采取一些方法解決，一種方法是改造噬菌體讓其能夠適應(yīng)更多的宿主[22]，另一種方法是使用雞尾酒療法，即將多種噬菌體混合在一起然后對(duì)菌群進(jìn)行侵染[23]。此外，還有研究者提出了將細(xì)胞外囊泡作為 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的運(yùn)載工具[24]、采用質(zhì)粒接合的方式運(yùn)輸 CRISPR/Cas 系統(tǒng)等不同方法，不過這些方法在有效性和安全性方面尚有不足，效率也比較低。總之，現(xiàn)有的各種 CRISPR/Cas 系統(tǒng)遞送方法仍有較多的局限和不足，需要不斷進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，同時(shí)還應(yīng)繼續(xù)研究新的遞送方法。

其次，CRISPR/Cas 系統(tǒng)存在一定的脫靶效應(yīng)[25]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)的特異性取決于 sgRNA 上的識(shí)別序列，脫靶效應(yīng)就是CRISPR/Cas 系統(tǒng)設(shè)計(jì)的某個(gè)位點(diǎn)的 sgRNA可能會(huì)識(shí)別其他位點(diǎn)，從而造成在切開靶點(diǎn)位置的同時(shí)存在切開其他位點(diǎn)的可能性。為了盡可能避免脫靶效應(yīng)，需要將 CRISPR 相關(guān)蛋白 Cas9 引導(dǎo)至其基因組中精確靶標(biāo)的 sgRNA。當(dāng) Cas9 與靶基因的序列完美匹配時(shí)，Cas9 的靶向活性和正常功能才能得到保證。有很多工作致力于研究如何檢測 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的脫靶情況，GUIDE-Seq 高通量測序技術(shù)是一種通過高通量實(shí)驗(yàn)手段在全基因組范圍鑒定 CRISPR/Cas 系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的方法，能夠很好地確定脫靶突變的位置以及突變頻率。此外，為了使 CRISPR/Cas 系統(tǒng)有針對(duì)性地避開可能脫靶的位點(diǎn)，降低甚至消除 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，有研究者也開發(fā)了一些輔助軟件幫助 CRISPR/Cas 系統(tǒng)對(duì)特定基因序列的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選[26]。

因此，雖然 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在基因編輯領(lǐng)域中已經(jīng)取得了不錯(cuò)的成果，但仍然還有很多地方需要進(jìn)一步改進(jìn)和完善，如對(duì)現(xiàn)有的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)遞送方法進(jìn)行優(yōu)化，合理設(shè)計(jì) sgRNA 以最大程度地提高靶標(biāo)活性并最小化脫靶效應(yīng)。這些問題如果能夠得到解決，CRISPR/Cas 系統(tǒng)勢必會(huì)迎來更大的發(fā)展。

4 總結(jié)與展望

利用 CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以開發(fā)序列特異性抗生素，選擇性地靶向細(xì)菌的抗生素耐藥基因，從而成為一種十分有潛力替代傳統(tǒng)抗生素的新型抗菌武器[27]。此外，CRISPR/Cas 系統(tǒng)還能夠?qū)Ｒ坏匕邢蛑虏〖?xì)菌，并且使周圍其他的非病原性細(xì)菌群體不受CRISPR/Cas 系統(tǒng)的影響。

人類在與病原菌的斗爭過程中，因?yàn)榭股氐陌l(fā)現(xiàn)和使用而取得了階段性的勝利，但這種斗爭還將持續(xù)下去。目前，傳統(tǒng)抗生素的研發(fā)愈加困難，耐藥菌在不斷出現(xiàn)與傳播，除了對(duì)現(xiàn)有抗生素進(jìn)行規(guī)范化管理和合理使用外，研發(fā)新型的抗菌藥物也迫在眉睫。作為在抗菌治療領(lǐng)域中嘗試的新型療法之一，雖然 CRISPR/Cas 系統(tǒng)依舊面臨著許多問題和挑戰(zhàn)，但是仍然為我們研究開發(fā)新型抗菌藥物提供新的視角和啟示。未來，CRISPR/Cas 系統(tǒng)會(huì)在人類健康和醫(yī)學(xué)發(fā)展方面帶給我們更多驚喜。

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昆明醫(yī)科大學(xué)碩士研究生創(chuàng)新基金（2020S197）；云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃[2019FE001(-229)]

胡瑩，Email：hy2002@126.com

2020-08-02

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.011