姜舒，王冰，郭霞，張蕓，謝亮，羅朝霞，劉贏瀅

·論著·

PD-1敲除及GPC3修飾的嵌合抗原受體T細(xì)胞治療肝癌的實驗研究

姜舒，王冰，郭霞，張蕓，謝亮，羅朝霞，劉贏瀅

518000 深圳市茵冠生物科技有限公司（姜舒、王冰、張蕓、謝亮、羅朝霞、劉贏瀅）；518000 深圳，南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院（郭霞）

構(gòu)建程序死亡受體 1（PD-1）敲除及磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（GPC3）修飾的嵌合抗原受體 T 細(xì)胞（GPC3-PD1gRNA-CART cells），研究其對肝癌細(xì)胞株 HepG2 的體外殺傷作用，以及其對肝癌動物模型的體內(nèi)抗腫瘤作用。制備 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測 PD-1、GPC3 CAR 的表達(dá)情況。體外實驗中，設(shè)立不同的效靶比（1:1、2:1、4:1），用 LDH 法測定刀豆蛋白刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞體外對 HepG2 細(xì)胞株的殺傷率，檢測刀豆蛋白刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞株共孵育 18 h 后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 IFN-γ 的釋放水平。設(shè)置受刀豆蛋白 A 刺激的和未受刀豆蛋白 A 刺激的 GPC3 修飾的 CART 細(xì)胞（GPC3 CART cells）作為對照組。于重度免疫缺陷小鼠（NDG 小鼠）皮下注射 HepG2 細(xì)胞建立肝癌動物模型，觀察 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞體內(nèi)抑瘤作用。實驗分為模型組、實驗組（GPC3-PD1gRNA-CART 組、GPC3 CART組），模型組和實驗組通過皮下注射 1 × 106個 HepG2 細(xì)胞造模，在腫瘤長徑達(dá) 3 mm 后實驗組經(jīng)尾靜脈注射5 × 106個 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞或 GPC3 CART 細(xì)胞，模型組經(jīng)尾靜脈注射 0.9% NaCl，每周注射 1 次，共 3 周，注射體積均為 0.2 ml。每隔 2 天觀測腫瘤體積情況，治療 3 周后取皮下腫瘤組織，HE 染色檢測腫瘤組織情況。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，GPC3 CAR 表達(dá)率為 98.8%。GPC3 CART 細(xì)胞 PD-1 的表達(dá)率為 11.1%，經(jīng)刀豆蛋白 A 刺激后，PD-1 的表達(dá)率上升至 92.1%，而 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞的 PD-1 表達(dá)率僅為 60%，證實了 PD-1 有效敲除。當(dāng)效靶比為1:1、2:1、4:1 時，隨著效靶比的增加，刀豆蛋白刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART細(xì)胞對 HepG2 的殺傷效果和 IFN-γ 的釋放水平也隨著效靶比的增加而增加。相同效靶比的情況下，刀豆蛋白 A 刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞對 HepG2 細(xì)胞的殺傷效果顯著高于刀豆蛋白 A 刺激后的 GPC3 CART 細(xì)胞對 HepG2 細(xì)胞的殺傷效果（< 0.05），且刀豆蛋白 A 刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞共孵育后 IFN-γ 的釋放水平也顯著高于刀豆蛋白 A 刺激后的 GPC3 CART 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞共孵育后 IFN-γ 的釋放水平（< 0.05），證明 PD-1 的敲除可以逆轉(zhuǎn) CART 細(xì)胞的功能抑制。治療 3 周后 GPC3-PD1gRNA-CART 組抑瘤率為 87.30%，與 GPC3 CART 組（69.03%）和模型組相比均有顯著性差異（< 0.05）。腫瘤組織 HE 染色檢測結(jié)果顯示，相比模型組，實驗組腫瘤細(xì)胞顯著減少，GPC3-PD1gRNA-CART 組治療效果優(yōu)于 GPC3 CART 組。GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞可解決腫瘤逃逸問題，能于體內(nèi)外高效靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，為后續(xù)肝癌治療提供技術(shù)基礎(chǔ)。

肝癌； 嵌合抗原受體 T 淋巴細(xì)胞； 基因編輯

目前，我國肝癌的發(fā)病率約為 25.7/10 萬，成為死亡率僅次于胃癌、肺癌的第三大惡性腫瘤，國內(nèi)外肝癌患者五年生存率僅 21%，當(dāng)前的治療效果仍不盡如人意。

嵌合抗原受體 T 細(xì)胞（CART 細(xì)胞）技術(shù)近年來發(fā)展非常迅速，通過基因改造技術(shù)，效應(yīng) T 細(xì)胞的靶向性、殺傷活性和持久性均顯著提高，在血液系統(tǒng)腫瘤的治療上效果顯著，然而針對實體瘤的治療，因缺乏腫瘤特異性抗原、腫瘤抗原表達(dá)下調(diào)、免疫抑制微環(huán)境、腫瘤負(fù)荷大等因素，治療效果仍存在不足。

規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR）是一類獨特的 DNA 串聯(lián)重復(fù)序列，CRISPR 基因座由一個前導(dǎo)區(qū)（Leader）、多個短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)（Repeat）和多個間隔序列區(qū)（Spacer）組成。CRISPR 相關(guān)基因（CRISPR-associated genes）稱為 Cas 基因，Cas 一般位于 CRISPR 基因座附近。Cas9 是由 1409 個氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白，含有 2 個核酸酶結(jié)構(gòu)域：氨基端 RuvC-like 結(jié)構(gòu)域及位于蛋白中間位置的 HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域，HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域可以切割與 CRISPR 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（CRISPR-derived RNA，crRNA）互補配對的模板鏈，切割位點位于原型間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）上游 3 nt（nucleotide，核苷酸）處，RuvC-like 結(jié)構(gòu)域可以對另一條鏈進(jìn)行切割，切割位點位于 PAM 上游 3 ~ 8 nt 處。在 crRNA 與 tracrRNA（trans-activating crRNA）基因形成的雙鏈 RNA 的指導(dǎo)下，Cas9 蛋白對靶位點進(jìn)行切割。CRISPR/Cas 系統(tǒng)是細(xì)菌對噬菌體的長期抗?fàn)庍^程中進(jìn)化產(chǎn)生的一種獲得性免疫防御系統(tǒng)，普遍存在于細(xì)菌與古生菌中。目前，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已作為一種基因組編輯技術(shù)被廣泛研究利用，該技術(shù)利用人工設(shè)計的向?qū)?RNA（single-guide RNA，sgRNA）介導(dǎo)外源表達(dá)的 Cas9 蛋白與基因組靶點特異性結(jié)合，以實現(xiàn)對基因組 DNA 的特異性切割，切割后的基因組 DNA 通過非同源末端連接或同源重組的方式進(jìn)行修復(fù)，從而實現(xiàn)基因的敲除、敲入等[1]。

程序死亡受體 1（PD-1）主要在激活的 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞中表達(dá)，功能是抑制細(xì)胞的激活，這是免疫系統(tǒng)的一種正常的自穩(wěn)機(jī)制，因為過度的 T/B 細(xì)胞激活會引起自身免疫病。但是，腫瘤微環(huán)境會誘導(dǎo)浸潤的 T 細(xì)胞高表達(dá) PD-1 分子，其配體 PD-L1 在多種腫瘤細(xì)胞中均上調(diào)表達(dá)，它與 T細(xì)胞上的 PD-1 結(jié)合，抑制 T 細(xì)胞增殖和活化，使 T 細(xì)胞處于失活狀態(tài)，最終誘導(dǎo)免疫逃逸[2]。截至目前，國內(nèi)外已開展多項體內(nèi)外實驗研究，腫瘤類型涉及血液系統(tǒng)腫瘤和實體瘤，如多發(fā)性骨髓瘤、惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌，均證實了 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除 PD-1 的 T 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更強大[3-6]。

阻斷 PD-1/PD-L1 通路，可上調(diào) T 細(xì)胞的生長和增殖，增強 T 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別，激活其攻擊和殺傷功能，通過調(diào)動人體自身的免疫功能實現(xiàn)抗腫瘤作用。鑒于上述 PD-1/PD-L1 通路的作用機(jī)制和肝癌的治療現(xiàn)狀，本研究通過構(gòu)建 PD-1敲除及磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（GPC3）修飾的CART（GPC3-PD1gRNA-CART）細(xì)胞，探索其應(yīng)用于肝癌治療的效果，為肝癌患者臨床治療方法提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒空載體 pCDH、攜帶 CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)的pAAV-U6-EF1α-Cas9 由本實驗室保存；人肝癌細(xì)胞 HepG2、人胚腎細(xì)胞 293T 購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫；Stbl4 感受態(tài)細(xì)胞購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.1.2 動物 SPF 級 NDG 小鼠 30 只，雌性，5 周齡，購自百奧賽圖（江蘇）基因生物技術(shù)有限公司，動物許可證號 SCXK（蘇）2016-0004。

1.1.3 試劑 OPTI-MEM 無血清培養(yǎng)基（31985-062）、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（L3000015）購自美國Thermo Scientific 公司；胎牛血清（FBS，SV30087.03）、DMEM（SH30243.01）購自美國 Hyclone 公司；EndoFree 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（DP117）購自天根生化科技（北京）有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（C0105）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞毒性檢測試劑盒（G1780）購自美國 Promega 公司；IFN-γ 試劑盒（1110002）購自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司；淋巴細(xì)胞分離液（LTS1077）購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；刀豆蛋白 A（C1139）購自北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司；Anti-PD-1 Antibody-PE（10377-M140-P）購自北京義翹神州科技股份有限公司；XVIVO-10 培養(yǎng)基（04-418Q）購自瑞士 Lonza 公司。

1.1.4 儀器 生物安全柜（AB2-4S1-CN）購自新加坡 ESCO 公司；離心機(jī)（sorvall ST 40R）和CO2培養(yǎng)箱（3111）購自美國 Thermo Scientific 公司；熒光顯微鏡（XDS-1B）購自德國 Zeiss 公司；制備型超速離心機(jī)（OPTIMAL-80XP）購自美國 Beckman 公司。

1.2 方法

1.2.1 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞制備和檢測

1.2.1.1 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒 pCDH-GPC3 CAR-PD1 gRNA-Cas9 構(gòu)建 靶向 PD-1 基因的兩條互補寡聚核苷酸（PD-1_F：CACCGggccaggatggttcttaggt；PD-1_R：AAACacctaagaaccatcctggccC）[7]和 GPC3 CAR 基因均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。寡聚核苷酸的退火及克隆到 pAAV-U6-EF1α-Cas9 載體按文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，經(jīng)測序符合預(yù)期。通過無縫連接方式將靶向 PD-1 基因的 CRISPR-Cas9 片段、GPC3 CAR 基因克隆到慢病毒載體，構(gòu)建的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒 pCDH-GPC3 CAR-PD1 gRNA-Cas9 經(jīng)測序符合預(yù)期。

1.2.1.2 pCDH-GPC3 CAR-PD1 gRNA-Cas9 包裝 在 15 cm 培養(yǎng)皿中鋪入 9 × 106個 293T 細(xì)胞，用含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基在 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日將 pCDH-GPC3 CAR-PD1 gRNA-Cas9 載體和包裝質(zhì)粒 pSPAX2、VSVG 依次按照 4:2:1 的比例加入 1 ml OPTI-MEM 無血清培養(yǎng)基中混勻，質(zhì)?？傎|(zhì)量為 92.3 μg，將 3 倍質(zhì)?？傎|(zhì)量的聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）加入另一管 1 ml OPTI-MEM 無血清培養(yǎng)基中混勻，兩管液體分別室溫孵育 3 min 后混合，旋渦混勻后的復(fù)合物室溫孵育 20 min。將 293T 細(xì)胞培養(yǎng)液換成 37 ℃預(yù)熱的 OPTI-MEM 無血清培養(yǎng)基（14 ml/皿），均勻滴入上述復(fù)合物，培養(yǎng) 4 ~ 6 h 后棄上清，加入30 ml 含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于 48 h、96 h 收取病毒液，1300 r/min 離心 5 min，取上清，采用超速離心機(jī) 20 000 r/min離心 2 h，棄上清，用 PBS 重懸病毒并用 0.22 μm 濾器過濾，分裝凍存于–80 ℃。

1.2.1.3 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞制備和檢測 制備含終濃度 5 μg/ml CD3 抗體、100 μg/ml RetroNectin 的生理鹽水，以 1 ml/孔的用量加入六孔板，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育至少 4 h。取健康志愿者外周血，用 Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液和密度梯度離心法分離得到 PBMC。采用 MACS 分選柱分離純化 CD3+T 淋巴細(xì)胞，用含終濃度 5% FBS、1000 IU/ml IL-2、1000 IU/m IFN-γ 的 XVIVO-10 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計數(shù)，按 2 × 106個/孔將細(xì)胞接種于包被好的六孔板，補加培養(yǎng)基至 2 ml。第二天加入終濃度 5 μg/ml 的聚凝胺及適量病毒液并混勻，將六孔板放入離心機(jī)中 1000 ×室溫離心 30 min 后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，制備 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測GPC3 CAR 表達(dá)情況。用 40 μg/ml 的刀豆蛋白 A 對 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞刺激 72 h 后，采用流式細(xì)胞儀檢測 PD-1 表達(dá)情況。設(shè)置受刀豆蛋白 A 刺激的和未受刺激的 GPC3 修飾的CART（GPC3 CART）細(xì)胞作為對照組。

1.2.2 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞功能活性檢測 收集 HepG2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 1 ×105個/ml，GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞使用終濃度為 40 μg/ml 的刀豆蛋白 A 刺激 72 h 后收集，調(diào)整細(xì)胞密度為 4 × 105個/ml，按效靶比 1:1、2:1、4:1 分別往 96 孔板加入 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞，共孵育 18 h，每個效靶比設(shè) 3 個復(fù)孔。設(shè)置受刀豆蛋白 A 刺激的和未受刺激的 GPC3 CART 細(xì)胞作為對照組。按細(xì)胞毒性檢測試劑盒和 IFN-γ 試劑盒說明操作，檢測 LDH 釋放量和 IFN-γ 水平。

1.2.3 分組和給藥 按隨機(jī)數(shù)字表法將 NDG 小鼠隨機(jī)分為模型組、實驗組（GPC3-PD1gRNA- CART 組、GPC3 CART 組），每組 10 只。模型組和實驗組通過皮下注射 1 × 106個 HepG2 細(xì)胞造模，在腫瘤長徑達(dá) 3 mm 后實驗組經(jīng)尾靜脈注射5 × 106個 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞或 GPC3 CART 細(xì)胞，模型組經(jīng)尾靜脈注射 0.9% NaCl，每周注射 1 次，共 3 周，注射體積均為 0.2 ml。

1.2.4 觀察腫瘤生長情況和腫瘤組織檢測 每2 天用卡尺測量腫瘤體積（V = 長徑 × 短徑2/2）[9]，觀察腫瘤生長情況，抑瘤率=（模型組體積 – 實驗組體積）/模型組體積[10]。治療 3 周后取皮下腫瘤組織，HE 染色檢測腫瘤組織情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞 GPC3 CAR、PD-1 檢測結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，GPC3 CAR 表達(dá)率為 98.8%（圖 1A）。GPC3 CART 細(xì)胞 PD-1 的表達(dá)率為 11.1%，經(jīng)刀豆蛋白 A 刺激后，PD-1 的表達(dá)率上升至 92.1%，而 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞的PD-1 表達(dá)率僅為 60%（圖 1B），證實了 PD-1 有效敲除。

A

Figure 1 Expression rates of GPC3 CAR and PD-1 tested by flow cytometry

LDH 釋放（%）LDH release (%)80 60 40 20 0 –20 4:1 2:1 1:1 4:1 2:1 1:1 4:1 2:1 1:1 刀豆蛋白 A 刺激的 GPC3 CART GPC3 CART 刀豆蛋白 A 刺激的 GPC3-PD1gRNA-CART ConA-stimulated GPC3 CART ConA-stimulated GPC3-PD1gRNA-CART

Figure 2 LDH release [a:< 0.001, compared with stimulated GPC3 CART (4:1) group; b:< 0.05, compared with stimulated GPC3 CART (2:1) group; c:= 0.004, compared with stimulated GPC3 CART (1:1) group]

2.2 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞體外殺瘤效力評估

當(dāng)效靶比為 1:1、2:1、4:1 時，隨著效靶比的增加，刀豆蛋白刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞對 HepG2 的殺傷效果也隨著提高，LDH 和 IFN-γ 的釋放水平均隨著效靶比的增加而增加。相同效靶比的情況下，刀豆蛋白 A 刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞對 HepG2 細(xì)胞的殺傷效果顯著高于刀豆蛋白 A 刺激后的 GPC3 CART細(xì)胞對 HepG2 細(xì)胞的殺傷效果（< 0.05，圖 2），且刀豆蛋白 A 刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞共孵育后 IFN-γ 的釋放水平也顯著高于刀豆蛋白 A 刺激后的 GPC3 CART 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞共孵育后 IFN-γ 的釋放水平（< 0.05，圖 3），證明 PD-1 的敲除可以逆轉(zhuǎn) CART 細(xì)胞的功能抑制。

IFN-γ（pg/ml）6000 4000 2000 0 4:1 2:1 1:1 4:1 2:1 1:1 4:1 2:1 1:1 刀豆蛋白 A 刺激的 GPC3 CART GPC3 CART 刀豆蛋白 A 刺激的 GPC3-PD1gRNA-CART ConA-stimulated GPC3 CART ConA-stimulated GPC3-PD1gRNA-CART

Figure 3 IFN-γ level [a:< 0.001, compared with stimulated GPC3 CART (4:1) group; b:= 0.004, compared with stimulated GPC3 CART (2:1) group; c:< 0.001, compared with stimulated GPC3 CART (1:1) group]

表 1 腫瘤體積情況（mm3，）

注：< 0.05,*與模型組相比，#與GPC3 CART 組相比。

Note:< 0.05,*compared with model group,#compared with GPC3 CART group.

圖 4 皮下腫瘤組織 HE 染色檢測（× 200；A：模型組；B：GPC3 CART 組；C：GPC3-PD1gRNA-CART 組）

Figure 4 Subcutaneous tumor tissues stained by HE (× 200; A: Model group; B: GPC3 CART group; C: GPC3-PD1gRNA-CART group)

2.3 腫瘤體積

造模后第 5 天，模型組和實驗組（GPC3- PD1gRNA-CART 組、GPC3 CART 組）可見明顯腫塊，治療 3 周后，實驗組腫瘤生長受到明顯抑制，GPC3-PD1gRNA-CART 組抑瘤率為 87.30%，GPC3 CART 組抑瘤率為 69.03%，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05），見表 1。

2.4 HE染色檢測腫瘤組織情況

HE 染色可見模型組腫瘤細(xì)胞密集，較多新生血管，毛細(xì)血管淤血擴(kuò)張，出血較多。與模型組相比，實驗組可見腫瘤細(xì)胞片狀壞死，壞死腫瘤細(xì)胞胞核固縮深染或碎裂溶解，出血減少，相比 GPC3 CART 組，GPC3-PD1gRNA-CART 組腫瘤細(xì)胞壞死程度更嚴(yán)重，出血更少，表明 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞治療效果優(yōu)于 GPC3 CART 細(xì)胞，見圖4。

3 討論

免疫檢查點分子屬于免疫調(diào)節(jié)信號分子，可以抑制免疫系統(tǒng)過度反應(yīng)，以保持自我耐受性。PD-1 分子在細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞表面表達(dá)，其配體 PD-L1 主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞表面，PD-1 與 PD-L1 的結(jié)合可導(dǎo)致 T 細(xì)胞功能活性下降[11]。腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境可通過上述機(jī)制，逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[11-12]。敲除腫瘤特異性 T 細(xì)胞表面的免疫檢查點分子，從而規(guī)避腫瘤逃逸的發(fā)生，提高腫瘤殺傷效果，在多項體內(nèi)外研究中已被證實是有效的策略[13-18]。

鑒于 GPC3 CART 細(xì)胞 PD-1 的表達(dá)率為 11.1%，且 PD-1 在活化的 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表面高表達(dá)[19-20]以及刀豆蛋白 A 對 T 細(xì)胞具有活化作用[21]，為了更好地體現(xiàn) PD-1 的敲除效率，采用刀豆蛋白 A 誘導(dǎo)刺激 CART 細(xì)胞活化增殖，經(jīng)刀豆蛋白 A 刺激后，GPC3 CART 細(xì)胞PD-1 的表達(dá)率上升至 92.1%，而 GPC3-PD1gRNA- CART 細(xì)胞因敲除了 PD-1，其 PD-1 的表達(dá)率僅上升至 60%，相比刀豆蛋白 A 刺激的 GPC3 CART 組，PD-1 表達(dá)水平下降了 30% 以上，間接證實了 PD-1 有效敲除。

IFN-γ 是活化的 T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞受刺激后產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其可以增強免疫細(xì)胞對微生物、腫瘤細(xì)胞等的殺傷作用。在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞死亡數(shù)目與細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 LDH 活性成正比，通過測定 LDH 活性可計算出效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷百分率。為了進(jìn)一步驗證 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞的功能活性，檢測其對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率及 IFN-γ 的釋放水平。隨著效靶比的增加，刀豆蛋白刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART 細(xì)胞對 HepG2 的殺傷效果也隨著提高，LDH 釋放量隨著效靶比的增加而增加，IFN-γ 的釋放水平也隨著效靶比的增加而增加。刀豆蛋白 A 刺激后的 GPC3 CART 細(xì)胞發(fā)生了 T 細(xì)胞衰竭，T 細(xì)胞耗竭也伴隨著抑制性受體（包括 PD-1、淋巴細(xì)胞激活基因 3 蛋白即 LAG3 等）的表達(dá)量和多樣性逐漸增加，T 細(xì)胞功能活性顯著下降[22-23]。例如，當(dāng)效靶比為 4:1 時，未受刀豆蛋白 A 刺激的 GPC3 CART 細(xì)胞組 LDH 活性為（49.70 ± 1.53）%，IFN-γ 的釋放水平為（3126.67 ± 110.15）pg/ml，刀豆蛋白 A 刺激的 GPC3 CART 細(xì)胞組 LDH 活性僅為（27.70 ± 2.52）%，IFN-γ 的釋放水平為（1176.67 ± 25.17）pg/ml，而 GPC3-PD1gRNA-CART細(xì)胞因敲除了 PD-1，經(jīng)刀豆蛋白 A 刺激后檢測的 LDH 活性為（71.00 ± 3.61）%，IFN-γ 的釋放水平為（5380.67 ± 235.38）pg/ml。以上實驗結(jié)果證明 PD-1 的敲除可以逆轉(zhuǎn) CART 細(xì)胞的功能抑制。體內(nèi)實驗也進(jìn)一步證實了 PD-1 敲除可有效解除 CART 細(xì)胞受到的功能抑制，有利于 CART 細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。

以上實驗結(jié)果與此前報道的 PD-1 信號通路在免疫抑制中的重要作用[24]一致，為進(jìn)一步優(yōu)化 CART 細(xì)胞、提高腫瘤細(xì)胞殺傷效果提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

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Effect of PD-1 knockout and GPC3 modified chimeric antigen receptor T cells on liver cancer

JIANG Shu, WANG Bing, GUO Xia, ZHANG Yun, XIE Liang, LUO Zhao-xia, LIU Ying-ying

Shenzhen Wingor Biotechnology Co., Ltd, Shenzhen 518000, China (JIANG Shu, WANG Bing, ZHANG Yun, XIE Liang, LUO Zhao-xia, LIU Ying-ying); Shenzhen Hospital of Southern Medical University, Shenzhen 518000, China(GUO Xia)

To study the cytotoxicity of programmed cell death protein 1 (PD-1) knockout and glypican-3 (GPC3) modified chimeric antigen receptor T cells (GPC3-PD1gRNA-CART cells) on the human hepatoma cell line HepG2and the anti-tumor effect of GPC3-PD1gRNA-CART cells on the severe immunodeficiency mouse model of liver cancer.GPC3-PD1gRNA-CART cells were prepared and the expression of GPC3 CARs and PD-1 were analyzed by flow cytometry. Inexperiment, the cytotoxicity of GPC3-PD1gRNA-CART cells stimulated with concanavalin A (ConA) on HepG2 cells was observed by LDH assay, and interferon-γ (IFN-γ) level was tested by ELISA when co-culturing the GPC3-PD1gRNA-CART cells with HepG2 cells for 18 h at different effect/target ratios (4:1, 2:1, 1:1). GPC3 CART and ConA-stimulated GPC3 CART were set up as control. The severe immunodeficiency mice (NDG) subcutaneous tumor model was established to assess anti-tumor effect of the GPC3-PD1gRNA-CART cells. In the subcutaneous tumor model study, there were three groups: the model group and two experiment groups (GPC3-PD1gRNA-CART group and GPC3 CART group), which were received the subcutaneous injection of HepG2 cells (1 × 106). When the diameter of tumor tissue reached 3 mm, GPC3-PD1gRNA-CART, GPC3 CART and model groups were intravenously injected with 5 × 106GPC3-PD1gRNA-CART cells, 5 × 106GPC3 CART and 0.9% NaCl in 0.2 ml respectively, once a week for 3 weeks. The tumor volume was calculated at a 2-day interval and the pathological changes in the tumor tissues were observed for comparison.The GPC3 CAR expression rate of the GPC3-PD1gRNA-CART cells was more than 98.8%. The expression rate of PD-1 in GPC3 CART cells was 11.1%, which was increased to 92.1% after the stimulation with ConA, while the expression rate of PD-1 in GPC3-PD1gRNA-CART cells was only 60%, confirming the effective knockout of PD-1 gene. Inexperiments, the killing effect and IFN-γ level of GPC3-PD1gRNA-CART cells stimulated by ConA on HepG2 cells were gradually increased at the effect/target ratios of 1:1, 2:1 and 4:1. At the same effect/target ratio, the killing effect and the IFN-γ level of the GPC3-PD1gRNA-CART cells stimulated with ConA on HepG2 cells were significantly higher than that of the GPC3 CART cells stimulated by Con A (< 0.05), indicating that PD-1 gene knockout in CART could reverse the inhibitory function of CART cells. The results inexperiments showed that the tumor volumes in GPC3-PD1gRNA-CART group shrank 87.30%, and there was a significant difference when comparing with GPC3 CART group (69.03%) and the model group (< 0.05). The pathological changes of tumor tissues showed that the tumor area in the experiment groups was significantly decreased, and the effect of GPC3-PD1gRNA-CART group was better than GPC3 CART group.GPC3-PD1gRNA-CART cells can effectively kill liver cancer cellsand, providing a potential strategy for liver cancer therapy.

liver cancer; chimeric antigen receptor T cell; genome editing

ZHANG Yun, Email: zhangyun@wingor.net

深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金（JSGG201708161531 17109）

張蕓，Email：zhangyun@wingor.net

2020-09-16

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.004