范震宇，蔡亮亮，王亞格，殷曉芹，朱永紅，陳伯華

(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001；2.河南省洛陽正骨醫(yī)院手外顯微外一科，河南 洛陽 471000)

熱毒寧注射液是由金銀花、青蒿和梔子3味中藥經(jīng)提取精制而成的中藥注射液，具有清熱、疏風(fēng)、解毒之功效，臨床主要用于外感風(fēng)熱所致感冒、上呼吸道感染及急性支氣管炎等[1-5],先后被多個流感、手足口病等診療指南收錄為推薦用藥。熱毒寧注射液現(xiàn)已基本明確了其指紋圖譜中的化學(xué)色譜峰[6]，建立了從原藥材-中間體-成品完整的化學(xué)成分譜質(zhì)量控制體系[7-9]和穩(wěn)定的工藝參數(shù)控制[10-14]，保證了制劑的穩(wěn)定均一，但建立的化學(xué)質(zhì)控體系與制劑臨床藥效間的關(guān)系目前尚不完全清楚。因此，確定指紋圖譜中各色譜峰的藥效，建立活性成分指紋圖譜，將有助于熱毒寧注射液譜-效相關(guān)的質(zhì)量控制體系的建立。

發(fā)熱是機(jī)體的一種自我防御應(yīng)答，也是感染性疾病和全身炎癥共有的一種癥狀，其主要由前列腺素(PGs)，尤其是前列腺素E2(PGE2)所介導(dǎo)[15-16]。內(nèi)源性的PGs合成主要由環(huán)氧化合酶(COX)催化完成，是關(guān)鍵的限速酶，而目前臨床上的退燒藥也主要是非甾體抗炎藥(COX-2酶抑制劑)[17]。本實驗研究了熱毒寧注射液對脂多糖(LPS)發(fā)熱大鼠的解熱和調(diào)節(jié)腦內(nèi)PGE2的作用，并采用巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放PGE2實驗，體外COX-2酶學(xué)實驗評價熱毒寧注射液，以及HPLC指紋圖譜色譜峰指認(rèn)的9個化合物(梔子苷、斷氧化馬錢子苷、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和咖啡酸)[18]的抑制活性，探討化學(xué)質(zhì)控成分與解熱作用間的相關(guān)性，為建立與藥效相關(guān)的指紋圖譜量控制體系提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

熱毒寧注射液(RDN)，規(guī)格:10 mL/支，生藥量2.6 g/mL，批號:190119，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司；熱毒寧凍干粉，由熱毒寧注射液冷凍干燥而成，生藥量43.3 mg/mg；安乃近注射液，規(guī)格2 mL∶0.5 g，批號:1910080121，上?，F(xiàn)代哈森(商丘)藥業(yè)有限公司；脂多糖(LPS，大腸桿菌0111)，貨號:L2660，批號:084M4118V，Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，批號:8113119，Gibco；胎牛血清，批號:121217，浙江天杭生物科技有限公司；PGE2ELISA試劑盒，批號:031212148，Enzo life Science；COX activity kit，貨號:ADI-907-003，Enzo life Sciences；Colorimetric COX inhibitor screening assay kit，貨號:760111，Cayman；新綠原酸(批號:20120815)，斷氧化馬錢子苷(批號:20130725)，異綠原酸A(批號:20120606)，異綠原酸B(批號:20121025)購自上海永恒生物科技有限公司；綠原酸(批號:110753-201214)，咖啡酸(批號:110885-200102)，隱綠原酸(批號:MUST-11112203)，梔子苷(批號:110749-201115)，異綠原酸C(批號:111894-201102)購自中國食品藥物檢定研究所。

1.2 動物與細(xì)胞株

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；SD大鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量160～180 g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(滬)2008-0016。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～25 ℃，相對濕度50%～70%，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)3 d后供實驗。

1.3 儀器

電子溫度計，歐姆龍(大連)有限公司；ME204E電子分析天平，Mettler Toledo；移液器，Eppendorf；EnSpire多功能酶標(biāo)儀，PerkinElmer。

2 方法

2.1 LPS致大鼠發(fā)熱模型的建立

SD大鼠在實驗環(huán)境溫度(23±2)℃中適應(yīng)3 d，自由進(jìn)食、飲水。實驗前2 d，每日模擬實驗操作，體溫計測肛溫1次(插入肛門2 cm)，選取體溫不超過38.5 ℃，且2次體溫變化不超0.5 ℃的大鼠作為實驗對象。

將合格大鼠隨機(jī)分為空白組和LPS組。實驗當(dāng)日，連續(xù)測體溫2次，間隔30 min測1次，以2次體溫作為造模前基礎(chǔ)體溫。LPS組腹腔注射LPS生理鹽水溶液(40 μg/kg)，空白組腹腔注射生理鹽水。以LPS注射完畢記為0，4 h測定體溫，計算2組大鼠體溫的變化(ΔT，℃)。

2.2 實驗動物分組及體溫的測定

將LPS組中升溫幅度超過0.5 ℃的大鼠隨機(jī)分組，每組19只：模型組、安乃近陽性對照組(6 mL/kg)、熱毒寧注射液低劑量組(RDN-L)、熱毒寧注射液中劑量組(RDN-M)、熱毒寧注射液高劑量組(RDN-H)(合生藥量2.54、5.08、10.16 g/kg，相當(dāng)人臨床等效劑量0.5、1、2倍)，給藥組立即腹腔注射給藥，模型組給予等體積生理鹽水。造模后持續(xù)觀察大鼠的體溫變化，每1 h 1次，連續(xù)觀察6 h，記錄體溫并計算升溫幅度。整個實驗過程中由1人采用1個溫度計進(jìn)行測溫。

2.3 下丘腦PGE2含量測定

發(fā)熱高峰6 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭處死，冰浴下迅速取出全腦，于視交叉與灰結(jié)節(jié)間取下丘腦組織，參照文獻(xiàn)報道[19]，稱取50 mg下丘腦組織，加0.5 mL細(xì)胞裂解液，室溫裂解30 min，再超聲裂解1 min，4 ℃ 13 201 r/min離心15 min，取上清，按照試劑盒說明書測定大鼠腦脊液中PGE2的含量。

2.4 LPS刺激RAW264.7細(xì)胞釋放PGE2模型

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整RAW264.7細(xì)胞為1×105mL-1，接種于24孔板，400 μL/孔，實驗設(shè)對照組、模型組、不同濃度的藥物組，每孔重復(fù)3次。將接種的細(xì)胞板，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)24 h，棄去細(xì)胞上清，PBS洗滌2次，藥物組加入495 μL不同濃度的含藥無血清的DMEM培養(yǎng)基，對照組和模型組分別加入同等體積的含0.1% DMSO的無血清培養(yǎng)基，37 ℃預(yù)處理1 h后，除對照組外，其余各組加入LPS的培養(yǎng)基溶液，5 μL/孔(終濃度1 μg/mL)，對照組加入等體積的無血清培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2細(xì)胞孵箱培養(yǎng)18 h，收集細(xì)胞上清，按ELISA試劑盒說明書測定PGE2含量。

2.5 COX-2酶活性實驗

熱毒寧注射液及其化學(xué)質(zhì)控成分對COX-2酶活性的抑制作用是利用COX-2 activity kit的化學(xué)發(fā)光法測定的，COX-2 activity kit中不含COX-2和底物花生四烯酸，由COX Colorimetric inhibitor screening assay kit提供。32.5 μL酶反應(yīng)緩沖液、2.54 μL的Heme溶液和2.5 μL的COX-2酶溶液，室溫孵育5 min，再加入2.5 μL的DMSO或不同濃度藥物的DMSO溶液，混勻，室溫孵育，同時設(shè)酶液對照、空白對照和塞來昔布陽性藥對照。120 min后，加入10 μL化學(xué)發(fā)光探針、5 μL花生四烯酸底物，5 s內(nèi)讀板，采集光信號，按下列計算相對酶活性：

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 熱毒寧注射液對LPS致發(fā)熱大鼠體溫的影響

空白組大鼠腹腔注射生理鹽水后，整個時間段內(nèi)體溫相對恒定(<0.5 ℃)，模型組大鼠腹腔注射液LPS后4 h，平均升溫幅度達(dá)到0.8～1 ℃，提示造模成功。陽性對照藥安乃近腹腔注射液后，體溫明顯下降，6～7 h下降幅度達(dá)到最大，而在8～9 h又逐步回升，但與模型組相比仍有統(tǒng)計學(xué)差異(表1)。致熱后腹腔注射不同劑量的熱毒寧注射液，大鼠體溫迅速下降，且整體趨勢比較平穩(wěn)，提示熱毒寧注射液可持續(xù)穩(wěn)定地降低LPS誘導(dǎo)的發(fā)熱過程，且降溫幅度與劑量相關(guān)(表1)。

表1 熱毒寧注射液對LPS致發(fā)熱大鼠體溫溫差的影響

3.2 熱毒寧注射液對LPS致發(fā)熱大鼠下丘腦中PGE2含量的影響

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)熱達(dá)到高峰時，模型組大鼠下丘腦中PGE2含量明顯高于正常組(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥安乃近組大鼠下丘腦中PGE2含量明顯降低(P<0.01)。同樣，給予熱毒寧注射液腹腔注射的大鼠下丘腦中PGE2含量呈現(xiàn)劑量依賴性的降低，且中、高劑量組具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，

3.3 熱毒寧注射液及其質(zhì)控成分對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放PGE2影響

與正常組相比，LPS刺激后，RAW264.7細(xì)胞釋放的PGE2含量明顯增加(P<0.01)。而在無細(xì)胞毒性的6.3～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，熱毒寧凍干粉呈濃度依賴性地抑制PGE2釋放，IC50為27.07 μg/mL(圖2)。進(jìn)一步的質(zhì)控成分研究證實，異綠原酸A、異綠原酸B、新綠原酸、咖啡酸在無細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)均能不同程度地抑制PGE2釋放，且與模型組比較，存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖2)。上述結(jié)果表明，熱毒寧注射液抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放PGE2的作用一定程度上來自其所含的咖啡?？鼘幩犷惢衔?。

注：與細(xì)胞對照組(C)比較，**P<0.01；與模型組(M)比較，圖2 熱毒寧及其質(zhì)控成分對LPS誘導(dǎo)RAW264.7 釋放PGE2影響

3.4 熱毒寧注射液及質(zhì)控成分對COX-2酶活性影響

COX-2是內(nèi)源性物質(zhì)前列腺素合成的關(guān)鍵限速酶，也是調(diào)節(jié)發(fā)熱時PGE2水平的重要合成酶之一。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱毒寧凍干粉能明顯抑制COX-2酶活性，IC50為418.6 ng/mL，弱于陽性藥塞來昔布(IC50=106.1 nmol/L)(圖3)。進(jìn)一步質(zhì)控成分研究證實，熱毒寧注射液中的咖啡?？鼘幩犷愇镔|(zhì)可濃度依賴性抑制COX-2酶活性(圖3)。上述結(jié)果表明，咖啡酰奎寧酸類物質(zhì)是熱毒寧注射液抑制COX-2酶活性的重要貢獻(xiàn)成分群之一。

圖3 熱毒寧及其質(zhì)控成分對COX-2酶活性影響

4 討論

LPS作用于機(jī)體，激活單核巨噬細(xì)胞等內(nèi)生致熱原細(xì)胞產(chǎn)生和釋放內(nèi)生致熱原(EP)，促進(jìn)PGE2合成和釋放，調(diào)節(jié)體溫中樞，引起機(jī)體發(fā)熱，體溫升高[20]。根據(jù)LPS劑量不同，發(fā)熱表現(xiàn)為雙相或三相熱，并伴有寒戰(zhàn)、精神萎靡和輕微腹瀉等癥狀，與臨床感染性炎癥所致發(fā)熱相似[21]。常用于解熱藥篩選以及炎性發(fā)熱機(jī)制探討，適用于抗炎抗病毒類解熱藥解熱作用評價。實驗結(jié)果表明，大鼠腹腔注射40 μg/kg的LPS可觀察到雙相熱，發(fā)熱整體趨勢與文獻(xiàn)報道一致[21]，熱毒寧注射液能抑制LPS致熱大鼠體溫升高，明顯降低大鼠下丘腦組織中PGE2含量。

PGE2是一種重要的中樞發(fā)熱介質(zhì)，也是外周重要的EP。LPS進(jìn)入機(jī)體激活體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞大量分泌PGE2和IL-6、IL-1β等內(nèi)源性致熱因子，后者調(diào)控COX-2酶表達(dá)，促進(jìn)腦內(nèi)PGE2進(jìn)一步合成釋放，引起機(jī)體發(fā)熱[20]。因此，本實驗考察了熱毒寧注射液及其質(zhì)控成分對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放PGE2和COX-2酶活性的影響。結(jié)果顯示，熱毒寧注射液能明顯抑制巨噬細(xì)胞釋放PGE2(IC50=27.07 μg/mL)，降低COX-2酶活性(IC50=418.6 ng/mL)，表明下調(diào)PGE2含量與熱毒寧注射液降低LPS所致的發(fā)熱大鼠體溫呈正相關(guān)。同樣，在熱毒寧注射液質(zhì)控的9個指標(biāo)中，咖啡酰奎寧酸類成分能不同程度地抑制PGE2釋放和COX-2酶活性，表明這些成分是熱毒寧注射液解熱的主要貢獻(xiàn)成分群之一。

綜上所述，熱毒寧注射液可抑制LPS致熱大鼠體溫升高，降低下丘腦組織中PGE2含量，推測其可能是通過抑制COX-2酶活性，降低PGE2合成與釋放，使體溫降低。熱毒寧注射液解熱作用主要來自化學(xué)質(zhì)控指標(biāo)中咖啡酰奎寧酸類物質(zhì)(異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸和咖啡酸)，提示在生產(chǎn)過程中，控制這些化合物含量在每批產(chǎn)品中的均一性，將有助于保證熱毒寧注射液解熱作用的穩(wěn)定性。