田剛，李超，翟園園，馮麗，徐佳，包貝華，姚衛(wèi)峰，張麗，丁安偉

(1.濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰州 225411；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

蒲地藍(lán)消炎口服液(PDL)由蒲公英、板藍(lán)根、苦地丁、黃芩組成，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，適用于癤腫、腮腺炎、咽炎、扁桃體炎[1]。臨床上常用于治療急性上呼吸道感染，效果良好[2-4]。近年來，有報(bào)道顯示PDL對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠急性肺炎具有保護(hù)作用，可減輕大鼠急性肺炎模型中肺組織的炎癥反應(yīng)，對肺組織的病理損傷有修復(fù)作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，肺部感染性疾病誘發(fā)的炎癥，與三羧酸(TCA)循環(huán)等能量代謝過程緊密相關(guān)[6-7]。代謝組學(xué)是對生物體內(nèi)代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化相對關(guān)系的研究方式[8]。靶向代謝組學(xué)通過對生物樣品中目標(biāo)的低豐度代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量，能夠更準(zhǔn)確地反映生物系統(tǒng)中代謝分子的濃度變化，是代謝組學(xué)當(dāng)前研究的新熱點(diǎn)[9-11]。PDL在臨床廣泛運(yùn)用于呼吸系統(tǒng)疾病的防治，療效顯著[12]，基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，PDL能夠顯著改善LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺炎[2]，但尚未有對能量代謝方面的研究。本研究以LPS誘導(dǎo)ICR小鼠急性肺炎模型為研究對象，以靶向代謝組學(xué)為技術(shù)手段[10]，探討PDL對LPS誘導(dǎo)的急性肺炎小鼠糖酵解和TCA循環(huán)等機(jī)體能量代謝的影響及其可能的作用機(jī)制，為后續(xù)開展PDL抗急性肺炎的作用機(jī)制研究與臨床用藥提供方向和依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HYQ-3110微量振蕩器渦旋混勻器，低速臺式離心機(jī)TDL-80-2B(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HH-ZK1電熱恒溫水浴鍋，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)，New Classic MS型分析天平(d=0.01 mg)(瑞士Mettlere toledo公司)，KH-500B型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，TSQ 8000型三重四級桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher公司)，色譜柱TG-5MS(美國Thermo Fisher公司)，Infinite 200 pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 藥品與試劑

蒲地藍(lán)消炎口服液(批號：1510313，濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；拜阿司匹林(批號：BJ43097,拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；乙醚(上海馬陸化工廠)；甲醇(德國Merck公司)；1,2-13C2-肉豆蔻酸、吡啶、N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)、甲氧基胺鹽酸鹽(美國Sigma-Aldrich公司)；正己烷(美國ROE Scientific公司)；氯化鈉(江蘇太倉化工廠)。標(biāo)準(zhǔn)品：丙酮酸(SLBP4879V，≥99%)、乳酸(BCBS2643V，≥99.0%)、葡萄糖(WXBC1347V，≥99.5%)、3-磷酸甘油酸(SLBW5317，≥93%)、琥珀酸(SLBR5477V，≥99.0%)、蘋果酸(WXBB0572，98%)、富馬酸(WXBB1420V，99%)、檸檬酸(MKBS5294V，≥98%)和α-酮戊二酸(BCBT6944，≥99.0%)均購自美國Sigma-Aldrich公司；磷酸烯醇式丙酮酸(D1712023，97%)和順式烏頭酸(C1806046，98%)購自阿拉??；異檸檬酸(H06S7B19343，93%)購自源葉生物；IL-10(MBE10477)、NF-κB(MBE10044)和TNF-α(MBE10037)試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。

2 方法

2.1 動物實(shí)驗(yàn)及樣本收集

36只ICR小鼠，體質(zhì)量(20±5)g，雌雄各半，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，許可證號：SCXK(蘇)2012-0004，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組6只，即對照組、模型組、拜阿司匹林組(200 mg/kg)、PDL低劑量組(1.3 mL/kg)、PDL中劑量組(3.9 mL/kg)、PDL高劑量組(11.7 mL/kg)。拜阿司匹林組和PDL各劑量組給予相應(yīng)劑量藥物，每日1次，連續(xù)5 d，空白組和模型組灌胃等體積的生理鹽水。末次給藥1 h后，除空白組外，其余各組構(gòu)建急性肺炎模型，即使用異氟烷麻醉小鼠后，用LPS(2 mg/kg)給小鼠滴鼻造模，空白組滴入相同體積生理鹽水，造模12 h后進(jìn)行取材。各組小鼠摘眼球取血，解剖并取左肺中葉用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后進(jìn)行HE染色，分裝部分血清用于檢測IL-10、TNF-α和NF-κB的含量，剩余血清置于-80 ℃保存，進(jìn)行后續(xù)代謝組學(xué)檢測。

2.2 溶液的配制

精密稱取丙酮酸、乳酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、磷酸烯醇式丙酮酸、順式烏頭酸、3-磷酸甘油酸、檸檬酸、異檸檬酸和葡萄糖對照品，溶解成1 mg/mL的對照品儲備液；精密量取上述對照品儲備液分別稀釋成4、120、16、0.1、0.5、1、0.02、0.01、0.04、2.5、0.16、240 μg/mL的對照品溶液，4 ℃保存。精密稱取1,2-13C2-肉豆蔻酸適量置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋溶解，配制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液，4 ℃保存。吸取內(nèi)標(biāo)儲備液適量，加入甲醇稀釋成濃度為5 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.3 樣本前處理及衍生化反應(yīng)

取50 μL血清，加入200 μL預(yù)冷的含1,2-13C2-肉豆蔻酸(5 μg/mL)的甲醇溶液，渦旋3 min，4 ℃離心10 min(14 000 r/min)，取上清液100 μL置30 ℃真空濃縮儀揮干2 h，加10 mg/mL甲氧胺吡啶30 μL，渦旋5 min，30 ℃振蕩1.5 h后，繼續(xù)加入30 μL BSTFA，渦旋5 min，37 ℃振蕩0.5 h，最后將樣品4 ℃離心10 min，14 000 r/min，取上清進(jìn)樣。

2.4 GC-MS分析條件

色譜條件：載氣為氦氣，流速1.2 mL/min，采用分流進(jìn)樣，分流流速為24.0 mL/min，分流比為20∶1；色譜柱：TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度300 ℃。升溫程序：60 ℃保持1 min，以20 ℃/min升至320 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量為70 eV，離子源溫度為300 ℃，傳輸線溫度為300 ℃。溶劑峰延遲時間為3.8 min；采用全掃描模式，掃描范圍m/z50～500；各代謝物靶向定量測定采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式，碰撞氣為高純氬氣(99.999%)。

2.5 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

吸取一定量的各代謝物的儲備液和內(nèi)標(biāo)儲備液進(jìn)行混合，用甲醇稀釋并揮干，采用“2.3”項(xiàng)下衍生化條件進(jìn)行衍生化并進(jìn)樣，采用全掃模式，對代謝物進(jìn)行測定，確定各代謝物及內(nèi)標(biāo)的出峰時間，然后采用TSQ 8000的Auto SRM分析模式自動優(yōu)化質(zhì)譜儀分析參數(shù)，優(yōu)化后的各物質(zhì)參數(shù)見表1。

表1 靶向代謝物及內(nèi)標(biāo)的SRM分析參數(shù)

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

將GC-MS采集的各物質(zhì)峰高與內(nèi)標(biāo)物峰高比值，與對照品混合溶液中各代謝物的比值進(jìn)行比較，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各靶向代謝物的含量。所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA13.0軟件進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，以偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)進(jìn)一步篩選對組間分類貢獻(xiàn)大的差異變量(VIP>1)，并結(jié)合Excel中t-test函數(shù)的t檢驗(yàn)(P<0.05)以評價代謝物對于分組的重要性。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)觀察

各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示對照組小鼠肺組織呈正常形態(tài)，管壁及周圍組織無明顯炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)無滲出物。模型組小鼠肺組織內(nèi)結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)肺泡、間質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚，肺泡腔水腫并伴有大量炎性滲出物。與模型組相比，PDL各組較模型組總體病變程度均有不同程度的減輕。高劑量組肺泡結(jié)構(gòu)較完整，肺間質(zhì)滲出、出血及間質(zhì)的炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，肺組織結(jié)構(gòu)接近于對照組的形態(tài)；中、低劑量組相較模型組來講，肺組織結(jié)構(gòu)和炎性細(xì)胞浸潤均有所改善；拜阿司匹林組肺泡炎、間質(zhì)性肺炎雖沒有完全消失，但大部分消退，可見部分炎細(xì)胞浸潤。

注：A.對照組；B.模型組；C.拜阿司匹林組；D.PDL低劑量組； E.PDL中劑量組；F.PDL高劑量組

3.2 各組小鼠血清中IL-10、TNF-α和NF-κB水平變化

與對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α和NF-κB水平明顯升高(P<0.01)，IL-10水平明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，各給藥組的炎癥因子水平均有不同程度的改善，其中PDL高劑量組最為顯著，TNF-α和NF-κB明顯降低(P<0.01)，IL-10明顯升高(P<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠血清中IL-10、TNF-α和NF-κB水平測定

3.3 各組小鼠血清中靶向代謝物差異

各靶向代謝物和內(nèi)標(biāo)的提取離子色譜圖見圖2。

圖2 代謝物及內(nèi)標(biāo)的提取離子色譜圖

通過GC-MS結(jié)合對照品單點(diǎn)對照法測定了糖酵解和TCA循環(huán)中12種內(nèi)源性代謝物，為了獲得組間差異信息，采用PLS-DA分析對照組、模型組和PDL高劑量給藥組小鼠血清的靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)(圖3A)，R2X=0.889，R2Y=0.774，Q2=0.744，并對獲得的PLS-DA模型質(zhì)量進(jìn)行200次的置換檢驗(yàn)(圖3B)，R2和Q2的截距分別為0.092 8和-0.229，表明擬合度良好，模型穩(wěn)定可靠。從PLS-DA得分圖中可以看出，模型組和對照組明顯分離，給藥組位于模型組和對照組之間并偏向?qū)φ战M，說明PDL對于肺損傷的能量代謝具有一定的恢復(fù)作用。以PLS-DA的VIP>1結(jié)合t檢驗(yàn)P<0.05，進(jìn)一步尋找對照組和模型組之間的差異性代謝物，并以t檢驗(yàn)P<0.05分析給藥后PDL高劑量組相對模型組的變化趨勢。在糖酵解和TCA循環(huán)的12個主要內(nèi)源性代謝物中，對照組與模型組比較，丙酮酸、乳酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、順式烏頭酸、3-磷酸甘油酸、檸檬酸、異檸檬酸和葡萄糖存在顯著差異;同時乳酸、琥珀酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、異檸檬酸和葡萄糖在PDL高劑量組中存在顯著性回調(diào)。結(jié)果見表3，圖4。

注：綠色.對照組;藍(lán)色.模型組;紅色.PDL高劑量組圖3 小鼠血清靶向代謝物PLS-DA分析得分圖(A)及置換檢驗(yàn)圖(B)

表3 各組小鼠血清中靶向代謝物的比較

注：帶方框的代謝物為檢測的靶向代謝物， 其中紅色代表在PDL高劑量組中顯著回調(diào)的代謝物。

4 討論

蒲地藍(lán)消炎口服液具有清熱解毒、抗炎消腫的功效，臨床常用于呼吸道感染性疾病的治療，如咽炎、扁桃體炎、腮腺炎等，但其抗炎機(jī)制尚不清晰，需要進(jìn)一步深入研究。前期有文獻(xiàn)報(bào)道炎癥反應(yīng)與能量代謝之間可能存在一定關(guān)系[7]，故本文通過PDL對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎的干預(yù)，探討其對包括糖酵解途徑和TCA循環(huán)等機(jī)體能量代謝的影響。

TCA循環(huán)和糖酵解是能量代謝的兩個重要代謝途徑，且TCA循環(huán)是在好氧生物活細(xì)胞中普遍存在的代謝過程，在人類生命活動中發(fā)揮著不可替代的作用，是人類活動的基礎(chǔ)之一[13]。糖酵解是所有生物體在葡萄糖分解代謝時必須通過的階段。兩者都是好氧生物能量合成和細(xì)胞代謝中心生化途徑的重要環(huán)節(jié)[14-15]。細(xì)胞內(nèi)能量通過ATP轉(zhuǎn)移，ATP的產(chǎn)生與細(xì)胞的能量代謝有關(guān)，特別是在TCA循環(huán)和糖酵解中[16]。從表3和圖4中可以看出，靶向定量的代謝物中存在乳酸、琥珀酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、異檸檬酸和葡萄糖等多個顯著性差異代謝物。乳酸是缺氧狀態(tài)中細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，當(dāng)組織器官低血流量灌注或細(xì)胞缺氧時，無氧糖酵解加速，乳酸生成增加，超過肝臟清除能力，從而導(dǎo)致乳酸含量增加。有研究報(bào)道表明急性肺組織損傷會導(dǎo)致血清中乳酸清除率降低，乳酸含量迅速升高，而在疾病得到有效控制后，體內(nèi)的乳酸可很快降低[17]。本研究中模型組乳酸含量顯著性升高，而給藥組相對于模型組乳酸含量顯著性回調(diào)，說明PDL具有提高乳酸代謝能力，從而保護(hù)肺組織的作用。

葡萄糖是肺泡細(xì)胞主要的能源物質(zhì)。正常情況下，肺泡細(xì)胞主要靠葡萄糖有氧代謝獲取能量；而缺氧或炎癥反應(yīng)時，肺泡細(xì)胞主要靠葡萄糖的無氧酵解獲取能量，為了維持肺泡細(xì)胞所需的能量，細(xì)胞需要攝取大量的葡萄糖[18]。琥珀酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、異檸檬酸均屬于TCA循環(huán)的重要中間代謝物。琥珀酸可通過HIF-1α誘導(dǎo)IL-1β炎癥信號[19]，為LPS誘導(dǎo)的炎癥動物模型中重要的代謝標(biāo)記物[20]。蘋果酸是異常肺呼吸期間，尤其是在低氧或炎癥狀況下能量代謝改變產(chǎn)生的代謝物[21-22]。異檸檬酸與α-酮戊二酸均是TCA循環(huán)中重要的中間代謝產(chǎn)物，是連接細(xì)胞內(nèi)碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，也是在巨噬細(xì)胞中關(guān)鍵的抗炎信號[23-24]。本研究中，模型組與對照組比較，琥珀酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、異檸檬酸的濃度顯著性下降，PDL灌胃給藥有效改善小鼠的肺部炎癥，并使琥珀酸水平得到較好的恢復(fù)。

綜上，靶向代謝組學(xué)是代謝組學(xué)研究的重要組成部分，具有特異性強(qiáng)、檢測靈敏度高和定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)。靶向研究的TCA循環(huán)和糖酵解是PDL干預(yù)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的重要代謝通路，乳酸、琥珀酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、異檸檬酸和葡萄糖6個代謝物具有顯著性差異，且均與炎癥反應(yīng)存在一定的關(guān)聯(lián)，為在細(xì)胞和分子水平深入闡明PDL抗呼吸系統(tǒng)炎癥的作用機(jī)制提供了參考。