沈存思，楊福州，項(xiàng)瑩穎，陳古月，紀(jì)建建，張正光

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

肺癌屬于呼吸系統(tǒng)占位性疾病，也是目前全球眾多癌癥中發(fā)病率與死亡數(shù)最高的癌癥類型，且呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。肺癌各年齡段皆有發(fā)生，其中非小細(xì)胞肺癌患者占肺癌患者總數(shù)的80%左右?；熓欠切〖?xì)胞肺癌的基礎(chǔ)治療方案，而近年來靶向治療亦成為臨床常見的治療手段[1]。Gefitinib作為一種口服表皮生長因子受體酪氨酸激酶的抑制劑(EGFR-TKIs)，在非小細(xì)胞肺癌治療領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。然而，許多患者在使用Gefitinib后1年內(nèi)便會產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，這使其臨床應(yīng)用受到了極大限制，是臨床使用Gefitinib治療非小細(xì)胞肺癌的瓶頸之一[2]。

高良姜為雙子葉植物姜科植物高良姜AlpiniaofficinarumHance的根莖，除去葉、須根及鱗片，洗凈，切成小段曬干，即可作為中藥飲片入藥使用。該藥屬于溫里藥物，具有溫胃止吐，散寒止痛的功效。Galangin來源于高良姜，是一種天然黃酮類化合物(圖1)。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，Galangin具有抗菌、抗氧化等多種藥效作用，近年來，Galangin的抗腫瘤作用亦得到廣泛關(guān)注[3]。研究顯示，Galangin通過抑制STAT3所調(diào)節(jié)的NF-κB及Bcl-2/Bax等通路增強(qiáng)順鉑、阿帕替尼等化療藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，具有較好的協(xié)同增效作用[4-6]。提示姜黃素可能具有增加吉非替尼抗癌作用的潛力。本文利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討了Galangin與Gefitinib對抗非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549可能的協(xié)同作用及相關(guān)機(jī)制，為Galangin在抗腫瘤領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供更多的科學(xué)依據(jù)。

圖1 高良姜根莖、飲片及Galangin分子式

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及細(xì)胞

Gefitinib購自于北京索萊寶生物科技有限公司，Galangin購自于成都瑞芬思生物科技有限公司，A549細(xì)胞購自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)耗材

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Thermo Fisher Scientific公司)，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司)，移液器(Thermo Fisher Scientific公司)，EP管(AXYGEN公司)，凍存管(Corning公司)，15、50 mL離心管(Corning公司)，T25、T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)，PVDF膜(Millipore公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)、0.25%胰蛋白酶溶液(不含EDTA)、青霉素-鏈霉素雙抗(100×)(上海源培生物科技有限公司)，胎牛血清(Gibco公司)CCK-8(DOJINDO公司)，Annexin V-Alexa Flour 647/PI凋亡檢測試劑盒(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司)，DMSO(BIOSHARP公司)，ELC化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、DEPC水、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物公司)，脫脂奶粉(安佳)，p-STAT3(Tyr705)抗體、STAT3抗體、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP(Cell Signaling Technology公司)，p-EGFR、EGFR、Bcl-2抗體、Bax抗體、β-actin抗體、HRP*Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Immunoway公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(ACB-4A1，ESCO公司)，常溫離心機(jī)(5702，Eppendorf公司)，倒置顯微鏡(090-135.001，Leica公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO-20AIC，SANYO公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，上海析達(dá)儀器有限公司)，Infinite多功能酶標(biāo)儀(M200 Pro，TECAN公司)，流式細(xì)胞儀(AccuriTMC6 Plus，BD公司)，超聲波細(xì)胞裂解儀(SONOPULS mini 20，Bandelin公司)，高電流電泳儀電源(PowerPac HC，BIO-RAD公司)，垂直電泳槽(VE-180，上海天能科技有限公司)，蛋白印記-多功能成像系統(tǒng)(GelDoc 2000，BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 A549細(xì)胞的培養(yǎng)

將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)在含有10%胎牛血清以及1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法檢測Gefitinib及Galangin對A549細(xì)胞活力的影響

將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為5×104mL-1，以100 μL每孔接種于96孔培養(yǎng)板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用PBS填充96孔板四周空白孔，分別用不同濃度梯度的Gefitinib及Galangin以單用或聯(lián)用的方式處理細(xì)胞。其中Gefitinib濃度梯度為：0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L；Galangin濃度梯度為：1.5、3、6、12、24、48、96、192 μmol/L。培養(yǎng)48 h后，吸去各孔中的溶液，向不同組別各孔中分別加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中孵育1 h左右。用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的OD值，計(jì)算Gefitinib及Galangin單用和聯(lián)用對A549細(xì)胞活性的影響以及相應(yīng)的IC50值。

2.3 Gefitinib及Galangin聯(lián)合指數(shù)的計(jì)算

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，運(yùn)用Chou-talalay法，使用CompuSyn軟件進(jìn)行兩藥聯(lián)合指數(shù)(Combination index，CI)的計(jì)算，研究兩種藥物間的相互作用。以CI<1表示協(xié)同作用；以CI=1表示為疊加作用；以CI>1表示為拮抗作用[7]。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測

將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為5×105mL-1，接種于6孔培養(yǎng)板。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，以合適濃度的Galangin與Gefitinib單用或聯(lián)用的方式處理細(xì)胞24 h。按照Annexin V-Alexa Flour 647/PI凋亡檢測試劑盒的要求，用不含EDTA的胰酶將各組別細(xì)胞消化后，以100 μL稀釋后的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，置于1.5 mL離心管中，分別加入5 μL Annexin V和10 μL PI溶液，于室溫下避光孵育15 min。加入400 μL PBS后，過200目篩，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測，以FlowJo 10.5軟件進(jìn)行分析，繪制凋亡圖。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

使用加入了蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎得到蛋白液。通過BCA定量法測定蛋白液的濃度，將不同組別樣品用RIPA裂解液稀釋至同一濃度。加入蛋白上樣緩沖液，充分混勻后置于干式恒溫器中變性。在配制好蛋白凝膠后，將各組樣品上樣。通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯色的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 Gefitinib及Galangin對A549細(xì)胞活性的影響

CCK-8法檢測Gefitinib與Galangin單用及聯(lián)用對A549細(xì)胞活性的影響。圖2結(jié)果顯示，使用不同濃度的Gefitinib及Galangin單用及聯(lián)用處理A549細(xì)胞48 h后，均對細(xì)胞活性產(chǎn)生了抑制作用。圖3結(jié)果表明，當(dāng)使用1.5、3、6、12、24、48、96、192 μmol/L的Galangin分別聯(lián)合0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L的Gefitinib處理細(xì)胞48 h后，CI值分別為0.558、0.592、0.543、0.372、0.536、0.504、0.462、0.716。當(dāng)Galangin濃度為12 μmol/L，Gefitinib濃度為2 μmol/L時，給藥48 h，其CI值為0.372，提示二者協(xié)同作用最佳，故采用此最佳協(xié)同濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 Gefitinib及Galangin對A549細(xì)胞凋亡的影響

圖4結(jié)果顯示，2 μmol/L Gefitinib 及12 μmol/L Galangin在單用及聯(lián)用時均具有促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的作用，Gefitinib與Galangin聯(lián)用促凋亡作用更明顯，顯著優(yōu)于兩藥單用時產(chǎn)生的促凋亡作用，進(jìn)一步提示二者在促細(xì)胞凋亡方面具有協(xié)同增效作用。

3.3 Gefitinib及Galangin對A549細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

以Western blot檢測各組細(xì)胞中p-EGFR、EGFR、p-STAT3、STAT3以及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Bax、Bcl-2的表達(dá)水平。圖5結(jié)果顯示Gefitinib及Galangin可抑制p-EGFR、p-STAT3和Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Bax的表達(dá)，且二者聯(lián)用對蛋白水平的影響更為顯著。

注：Galangin 12 μmol/L；Gefitinib 2 μmol/L； 與對照組比較，**P<0.01。

注：Galangin 12 μmol/L；Gefitinib 2 μmol/L； 與對照組比較，**P<0.01。

4 討論

近年來，由于空氣污染、吸煙、病毒感染等因素，呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率逐年增高，其中肺癌是我國發(fā)病率及死亡率位列第一的惡性腫瘤[8]。目前主流的保守治療方法以化療為主要手段，通常會采用TKI抑制劑，如Gefitinib，能明顯緩解疾病進(jìn)展，延長患者生存期[9]。然而原發(fā)性及獲得性耐藥降低了Gefitinib的藥物療效。Galangin來源于姜科植物高良姜，是一種具有較好藥理活性的天然黃酮類化合物，其作用包括抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗氧化等。多項(xiàng)研究顯示Galangin對多種呼吸系統(tǒng)疾病，包括哮喘、氣道炎癥、肺部腫瘤等都具有良好的治療效果[10-11]。

STATs蛋白家族介導(dǎo)細(xì)胞生理過程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細(xì)胞生長、分化等過程中發(fā)揮不可或缺的作用[12]。其中STAT3作為多個受體酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase，RTK)信號通路下游一個重要的調(diào)節(jié)因子，其作用廣泛，在細(xì)胞的增殖分化、炎癥發(fā)生發(fā)展及腫瘤微環(huán)境中都扮演著重要角色[13]，也是連接炎癥和腫瘤的關(guān)鍵信號分子。Gefitinib為小分子酪氨酸激酶抑制劑，能夠抑制EGFR及交聯(lián)信號的活化，而STAT3是與EGFR信號有交聯(lián)的重要信號之一。EGFR信號活化后，磷酸化的EGFR及其下游分子可直接磷酸化STAT3，磷酸化后的STAT3自細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控靶基因表達(dá)。STAT3過度活化亦與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。通過抑制STAT3信號活化能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要途徑[14]。凋亡關(guān)鍵蛋白Bcl-2位于線粒體外壁，是STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游靶基因之一，可以通過控制線粒體通透性和抑制細(xì)胞色素c的釋放調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[15]。Bax是與Bcl-2同源的水溶性蛋白，是Bcl-2家族中促細(xì)胞凋亡的蛋白[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Galangin與Gefitinib聯(lián)用具有良好的協(xié)同抗癌作用，能顯著抑制A549細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞中EGFR、STAT3的磷酸化水平有所降低，凋亡關(guān)鍵蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)亦呈顯著變化。而最新研究[17-19]也表明，利用特異性小分子抑制劑靶向STAT3，阻斷STAT3相關(guān)信號通路的激活，能有效抑制腫瘤生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。綜上，本次研究提示了Galangin作為一種具有抗癌作用的中藥活性化合物，通過協(xié)同增加Gefitinib對EGFR/STAT3信號通路相關(guān)蛋白的抑制作用，協(xié)同增強(qiáng)Gefitinib的抗癌效果，深入機(jī)制及臨床適用性仍需進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。