吳吟秋，王載川，張曉春，蘇兆亮，4，劉延慶，5，侯超,5

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬揚(yáng)州市中醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州 225002；4.江蘇大學(xué)國際基因組學(xué)研究中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；5.國家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點(diǎn)研究室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

肺癌是當(dāng)今我國及世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響人們健康[1-2]。大量研究證實(shí)中醫(yī)藥在肺癌治療中具有重要價(jià)值。國醫(yī)大師周岱翰教授總結(jié)50余年肺癌治驗(yàn)，認(rèn)為肺癌不離“痰、瘀、毒、虛”四字，常以益氣除痰法為主，輔以化瘀解毒、軟堅(jiān)散結(jié)，自擬效驗(yàn)方周氏固金消瘤湯用于非小細(xì)胞肺癌患者的治療，對(duì)抑制癌瘤生長(zhǎng)，放化療的增效減毒，改善生存質(zhì)量及延長(zhǎng)生存期均有一定幫助[3]。JAK2/STAT3通路作為非小細(xì)胞肺癌防治研究領(lǐng)域一個(gè)重要的途徑，與細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為密切相關(guān)[4-5]。為進(jìn)一步證實(shí)周氏固金消瘤湯的抗腫瘤效應(yīng)，本研究擬從人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤血管生成等惡性生物學(xué)行為多種重要途徑及環(huán)節(jié)的影響，多方面探討周氏固金消瘤湯的藥效機(jī)制，旨在為該復(fù)方的開發(fā)及應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 周氏固金消瘤湯由守宮6 g，薏苡仁30 g，人參15 g，百部20 g,干蟾皮10 g,生南星15 g,龍葵20 g,浙貝母20 g組成。藥材購自揚(yáng)州市中醫(yī)院中藥房，經(jīng)張曉春主任醫(yī)師鑒定為正品。

1.1.2 細(xì)胞株 人肺腺癌A549細(xì)胞株及HUVEC細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，人肺腺癌A549細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；HUVEC用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(10%胎牛血清的RPMI1640+1%ECGS)于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 獲取雄性BALB/c-nu裸鼠20只，5～6周齡，體質(zhì)量為(16±2)g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0007。實(shí)驗(yàn)在國家癌癥研究所提供的指導(dǎo)方針下進(jìn)行，已獲揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(YXYLL-2020-110)。

1.1.4 主要試劑 CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所，批號(hào)：NM598)；Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(聯(lián)科生物，批號(hào)：AP105)；Bax、Bcl-2、p-STAT3、STAT3、p-JAK2、JAK2、β-actin抗體(CST，批號(hào)：5023、3498、9145、12640、4406、3230、4970)；VEGF抗體(Affinity Biosciences，批號(hào)：AF5131)；HRP標(biāo)記二抗(CST，批號(hào)：7074)；超敏ECL化學(xué)反應(yīng)發(fā)光試劑盒(新賽美生物科技有限公司,批號(hào)：19091716)；基質(zhì)膠(美國康寧公司，批號(hào)：356234)；ECGS(ScienCell,批號(hào)：#1025)；Transwell小室(美國BD公司,0.4 μm，批號(hào)：3016695)。

1.1.5 主要儀器 3107型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Forma Scientific公司；Ti-U倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司；Synergy HTX多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；DVB膠片，美國Kodak公司；Accuri C6流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 周氏固金消瘤湯凍干粉藥液制備 按周氏固金消瘤湯(ZSGJXLT)處方組成準(zhǔn)確稱取各中藥飲片，經(jīng)煎藥機(jī)煎煮成湯劑(按機(jī)器規(guī)程操作)。60 ℃濃縮成合生藥量2.11 g/mL藥液。嚴(yán)格按照LABCONCO Freeze Dry System凍干機(jī)說明書操作，將藥液凍干為粉，溶解稀釋為5、10、20、40、80 μg/mL的不同濃度藥液。

1.2.2 CCK-8法測(cè)定對(duì)A549細(xì)胞活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，置培養(yǎng)箱中孵育過夜。加入不同濃度的ZSGJXLT藥液，設(shè)定空白對(duì)照組，每組5個(gè)復(fù)孔，藥物分別作用12、24 h及36 h后，每孔加入10 μL的CCK-8，放置培養(yǎng)箱孵育1 h，用酶標(biāo)儀(450 nm波長(zhǎng))測(cè)吸光度值(OD)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)孔-OD空白孔)/(OD對(duì)照孔-OD空白孔)×100%。

1.2.3 Annexin-V/7AAD流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)A549細(xì)胞凋亡影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，每孔3×106個(gè)細(xì)胞,置培養(yǎng)箱中孵育過夜。加入不同濃度(0、5、10、20、40、80 μg/mL)ZSGJXLT培養(yǎng)24 h，每個(gè)劑量設(shè)定3個(gè)平行組。收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，Binding buffer 100 μL重懸，加入5 μL Annexin-V和1 μL 100 μg/mL 7AAD室溫避光孵育15 min，流式上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 體外血管形成實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)血管生成的影響 小室內(nèi)建立共培養(yǎng)體系，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整為5×104個(gè)/孔，接種于共培養(yǎng)小室的上室，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，在加藥組分別給予不同濃度的(0、5、10、20、40、80 μg/mL)ZSGJXLT。同時(shí)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)添加300 μL基質(zhì)膠(下室)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)凝固1 h。待充分凝固后以5×104個(gè)/孔的密度將HUVEC均勻接種于基質(zhì)膠表面。共同孵育24 h后，每個(gè)劑量設(shè)定3個(gè)平行組，拍照保存，統(tǒng)計(jì)封閉管腔形成數(shù)量。

1.2.5 Western blot檢測(cè)對(duì)A549細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 按1.2.3的方法進(jìn)行鋪板，加入不同濃度的ZSGJXLT培養(yǎng)24 h后，加入RIPA裂解液80 μL，冰上裂解30 min，收集細(xì)胞于離心管中，4 ℃下以12 000×g離心15 min，收集上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量，金屬浴變性10 min。SDS-PAGE電泳，冰浴中電壓100 V轉(zhuǎn)膜2 h，取出PVDF膜，7%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，置于一抗稀釋液中，4 ℃脫色搖床上孵育過夜，回收一抗，TBST洗膜，每次15 min，重復(fù)3次，二抗37 ℃孵育2 h后，回收二抗，TBST洗膜，每次15 min，重復(fù)3次，暗房用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.2.6 小鼠A549肺癌移植瘤模型的構(gòu)建和給藥 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化后，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×107mL-1，接種于BALB/c-nu裸鼠腋窩皮下部位，每只接種0.2 mL。約1周左右可在接種處捫及米粒大小瘤體，提示接種成功。根據(jù)小鼠體質(zhì)量隨機(jī)分層分組為模型組，ZSGJXLT低、中、高劑量組和順鉑組。分別予生理鹽水及低、中、高劑量(生藥質(zhì)量濃度分別為0.25、1、4 g/kg)ZSGJXLT灌胃。ZSGJXLT連續(xù)給藥21 d后解剖小鼠，剝離移植瘤，稱取移植瘤質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果

2.1 周氏固金消瘤湯對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，ZSGJXLT對(duì)A549細(xì)胞的活性有明顯的抑制作用，抑制率具有時(shí)間和濃度依賴性(P<0.01)，計(jì)算得到24 h的IC50為40.86 μg/mL。

注：同一時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，

2.2 周氏固金消瘤湯對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

如圖2～3所示，與對(duì)照組相比，ZSGJXLT作用A549細(xì)胞24 h后可明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，并呈濃度依賴性。

圖2 不同濃度ZSGJXLT對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

注：與對(duì)照組比較，

2.3 周氏固金消瘤湯對(duì)肺癌細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，用藥組VEGF、p-STAT3、p-JAK2、STAT3等蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)，Bax/Bcl-2蛋白明顯上調(diào)(P<0.05)，均呈濃度依賴性(圖4～5)。

圖4 各組A549細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 周氏固金消瘤湯對(duì)血管生成的影響

周氏固金消瘤湯對(duì)HUVEC小管形成的影響如圖6～7所示，與對(duì)照組相比，ZSGJXLT組HUVEC環(huán)狀血管結(jié)構(gòu)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且呈濃度依賴性。

圖6 不同濃度ZSGJXLT對(duì)HUVEC體外小管形成的影響

注：與對(duì)照組比較，

2.5 周氏固金消瘤湯抑制A549肺癌荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)

與模型組比較，不同濃度的ZSGJXLT(0.25、1、4 g/kg)可明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)(P<0.05),且呈濃度依賴性，且腫瘤質(zhì)量的下降趨勢(shì)具有明顯的劑量依賴性。ZSGJXLT(0.25、1、4 g/kg)抑瘤率分別為21.66%、35.52%和48.24%。與低劑量實(shí)驗(yàn)組比較，中、高劑量實(shí)驗(yàn)組的抑瘤率升高，且高劑量實(shí)驗(yàn)組高于中劑量實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果表明ZSGJXLT對(duì)A549肺癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用(圖8～10)。

圖8 各組間的腫瘤對(duì)比

注：與模型組比較，

注：各組ZSGJXLT(0.25、1、4 g/kg)之間的比較，**P<0.01。

3 討論

肺癌相當(dāng)于中醫(yī)的“肺積”“息賁”等病名，根據(jù)臟象學(xué)說，在肺癌演變過程中，肺與脾的病理關(guān)系主要表現(xiàn)在生氣不足和水液代謝失調(diào)?！胺螢橹鳉庵畼?，脾為生氣之源”“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”，脾虛痰濕是肺癌的關(guān)鍵病機(jī)。國醫(yī)大師周岱翰教授針對(duì)中晚期肺癌患者，強(qiáng)調(diào)“痰”與“虛”的中醫(yī)病機(jī)，認(rèn)為處于這一特定階段肺癌的病理特征是以“虛”為本，以“痰”為標(biāo)，突出“培土生金”的治療理念，提出“益氣除痰”治療大法[4]。多中心、前瞻性隊(duì)列研究證實(shí)了以益氣除痰方藥為主的中醫(yī)藥綜合治療在延長(zhǎng)Ⅲ、Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌老年患者的中位生存期及延緩腫瘤進(jìn)展方面，均與化療作用相當(dāng)，與化療聯(lián)合應(yīng)用可使患者中位生存期達(dá)12個(gè)月，其中脾虛痰濕型患者可達(dá)到13個(gè)月，對(duì)于復(fù)治和非鱗癌患者，中醫(yī)藥治療較化療具有更好的療效[3，5]。周氏固金消瘤湯是周老基于益氣除痰法而擬定，該復(fù)方由守宮、薏苡仁、人參、百部、干蟾皮、生南星、龍葵、浙貝母組成，其中守宮、薏苡仁除痰散結(jié)為君，人參、百部益氣健脾，潤(rùn)肺止咳，干蟾皮、生南星、龍葵燥濕化痰，散結(jié)解毒，共為臣藥，浙貝母清熱化痰，解毒散結(jié)為佐使。全方寒溫并用，攻補(bǔ)兼施，標(biāo)本同治，共奏益氣除痰，解毒消癥之效。藥理研究已證實(shí)周氏固金消瘤湯組分干蟾皮提取物蟾蜍靈[6]、人參[7]等提取物可通過直接細(xì)胞毒、促凋亡及抗腫瘤血管生成等作用發(fā)揮抑瘤效應(yīng)。

JAK-STAT信號(hào)通路是一條由上游細(xì)胞因子刺激，通過調(diào)節(jié)下游靶基因如Bcl-2、Bax、c-Myc、VEGF及Cyclin D1等表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成等重要生物學(xué)過程的信號(hào)通路[8]。許多腫瘤手術(shù)標(biāo)本均有JAK-STAT信號(hào)通路的異常表達(dá)，尤其STAT3作為一種促進(jìn)細(xì)胞增殖與存活的原癌蛋白，其持續(xù)性激活導(dǎo)致細(xì)胞失控性增生并加速細(xì)胞遷移，如蔡勛全等[9]比較直腸癌病理組織和正常直腸組織相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，直腸癌組織中STAT3、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達(dá)也明顯高于正常直腸組織，且與直腸癌分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。Bcl-2和Bax分別作為Bcl-2家族中的抗凋亡因子及促凋亡因子在腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[10]。VEGF是生理和病理性血管生成所必需的促血管生成因子[11]。STAT3作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族成員之一，其異常激活可上調(diào)VEGF表達(dá)[12]。綜上所述，JAK2/STAT3/VEGF通道在腫瘤增殖、凋亡、血管生成等惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，可作為非小細(xì)胞肺癌防治研究領(lǐng)域一個(gè)重要的干預(yù)途徑，為中藥復(fù)方藥效機(jī)制的研究提供新的思路。