李秀宇 董 黎 孫宇涵 李健康 劉曉迪 譚紅巖 Saleem Uddin 李 云

(1北京林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心/國家林業(yè)與草原局刺槐工程技術(shù)研究中心/林木育種國家工程實(shí)驗(yàn)室/北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2河北省平泉市國有黃土梁子林場，河北 平泉 067500)

多倍體植物普遍存在于自然界中，染色體多倍化是植物進(jìn)化的重要因素之一[1]。多倍體育種技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)研究中，在作物[2-3]、園藝[4-5]及林木[6-7]中均取得較大進(jìn)展。

刺槐(Robinia pseudoacaciaL．)，屬豆科蝶形花亞科刺槐屬，耐干旱、瘠薄、耐輕度鹽堿、抗污染能力強(qiáng)，具有良好的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是荒山造林和水土保持先鋒樹種，且具有觀賞、材用、蜜源和飼用價(jià)值[8-10]。刺槐原產(chǎn)于北美洲，19 世紀(jì)末引入我國，經(jīng)引種馴化后廣泛分布于國內(nèi)各地[11]。四倍體刺槐首次在韓國報(bào)道，其由秋水仙素誘導(dǎo)種子獲得[12]。與二倍體刺槐相比，四倍體刺槐的葉片厚度、大小、產(chǎn)量、營養(yǎng)物質(zhì)含量[13-14]，遺傳適應(yīng)性和抗逆性均優(yōu)于二倍體[15-16]。但四倍體刺槐材料較為單一，基因型不夠豐富，沒有可選擇的群體，不利于優(yōu)良品種的選育，更難以滿足在生態(tài)建設(shè)、飼料、生物質(zhì)能源等方面的需求。因此，迫切需要增加四倍體刺槐種質(zhì)資源數(shù)量，構(gòu)建基因型豐富的四倍體刺槐群體，建立四倍體刺槐的種質(zhì)資源庫，為選育優(yōu)良四倍體刺槐無性系，滿足木本飼料產(chǎn)業(yè)，促進(jìn)生物質(zhì)能源發(fā)展，緩解木材短缺問題，加強(qiáng)林業(yè)生態(tài)建設(shè)等方面提供技術(shù)支撐。

目前，對刺槐的無性繁殖、有性生殖、遺傳多樣性及抗逆性的研究較多[17-21]。對四倍體刺槐的研究多集中在抗逆性方面。本研究前期建立了離體條件下高效誘導(dǎo)四倍體刺槐的體系，在此基礎(chǔ)上誘導(dǎo)出一批新型四倍體刺槐單株，通過離體培養(yǎng)技術(shù)獲得了不同基因型的四倍體刺槐無性系[22]。在組培繁殖過程中，本研究前期發(fā)現(xiàn)不同無性系之間的生長差異非常明顯。為了明確這些差異來源，并利用這些差異進(jìn)行苗期早期預(yù)測，建立評(píng)價(jià)刺槐無性系的有效指標(biāo)體系，本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，對二倍體和四倍體刺槐組培苗進(jìn)行了形態(tài)和生理指標(biāo)的測定，篩選育種對應(yīng)的指標(biāo)，并分析上述指標(biāo)的相關(guān)性及差異性，旨在通過對比不同倍性刺槐、不同無性系刺槐之間的生長差異，為篩選四倍體刺槐優(yōu)良無性系提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和培養(yǎng)條件

供試材料為播種獲得的二倍體刺槐(2n ＝2X ＝22)，利用秋水仙素誘導(dǎo)種子獲得的四倍體刺槐(2n ＝4X＝44)。這些種子來自4 個(gè)半同胞家系，共獲得了23 個(gè)無性系。其中，二倍體無性系4 個(gè)，分別為H、J16-32、M26-52、A4；四倍體無性系19 個(gè)，分別為16、38、104、108、124、219、243、464、465、503、513、525、528、545、547、D18-2、D18-8、D18-14、M16-30。

培養(yǎng)基的物質(zhì)配比為：MS+0．2 mg.L-1吲哚丁酸(3-indolebutyric acid， IBA)+30 g.L-1蔗糖+6 g.L-1瓊脂(pH 值5．8)；光照條件為3 410 Lux，每天光照16 h，組培室溫度為25±2℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1．2．1 刺槐二倍體和四倍體形態(tài)指標(biāo)的測定 每個(gè)系號(hào)隨機(jī)選取長勢良好苗齡35 d 的同一批次繼代組培苗9 株，用直尺量取植株最頂端到其根系基部的長度，記為株高。目測植株的叢枝數(shù)并記錄。將植株取出，小心去除培養(yǎng)基，用直尺測量主根長度，并統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)量。每個(gè)系號(hào)隨機(jī)選取長勢穩(wěn)定的9 片葉片，疊在一起用游標(biāo)卡尺測量葉片厚度，重復(fù)3 次，取平均值，并計(jì)算相應(yīng)的單個(gè)葉片厚度。再隨機(jī)選取9 片葉片，用ESPERSSION 1680 臺(tái)式掃描儀(日本愛普森)進(jìn)行掃描，將掃描的圖片存入電腦備用。

于上午9：00，從每個(gè)無性系中隨機(jī)選取長勢良好苗齡35 d 的同一批次繼代組培苗，再從中隨機(jī)選取3片長勢穩(wěn)定的葉片，在葉片背面均勻涂抹一層無色透明的指甲油，葉背朝上置于載玻片上，用鑷子輕輕撕下背面的指甲油膜，滴一滴蒸餾水使撕下的表皮均勻展開，然后用吸水紙吸干水分，使用Olympus BX51 顯微鏡(日本奧林巴斯)觀察測量，每個(gè)葉片隨機(jī)選取一個(gè)視野進(jìn)行觀察(避開葉脈)，每個(gè)視野隨機(jī)選取3 個(gè)氣孔，記錄其長、寬。

1．2．2 刺槐二倍體和四倍體生理指標(biāo)的測定 采用南京建成生物公司的蛋白定量BCA 法測試試劑盒、脯氨酸測試試劑盒、植物丙二醛測試試劑盒測量刺槐可溶性蛋白(soluble protein， SPro)、脯氨酸(proline Pro)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。使用蘇州科銘生物公司的試劑盒(微板法)測定葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b 含量。試驗(yàn)材料選長勢良好苗齡35 d 的同一批次繼代的組培苗，取葉片準(zhǔn)確稱量，置于離心管備用，每個(gè)無性系重復(fù)3 次，試驗(yàn)操作過程參考相關(guān)試劑盒說明書。

1．2．3 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Office Excel 2007 對觀測統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，用SPSS 24．0 進(jìn)行方差分析(鄧肯法)和相關(guān)性分析，并對二倍體和四倍體各性狀差異進(jìn)行t 檢驗(yàn)。使用圖像分析軟件Lamina分析葉片長度、寬度、周長、面積、圓度、葉形指數(shù)相關(guān)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方差分析及t 檢驗(yàn)結(jié)果

對整理后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和t 檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果表明，各性狀組間相應(yīng)的概率值均為0．000，小于極顯著水平0．01，表明所測量的各性狀組內(nèi)之間差異極顯著，有篩選的意義。各測定性狀t 檢驗(yàn)的P值均為0．000，小于極顯著水平0．01，表明各性狀組間存在極顯著差異，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 各無性系形態(tài)指標(biāo)的比較

根據(jù)各無性系形態(tài)指標(biāo)均值可以看出(表1)，不同無性系之間差異較大。同一倍性間各無性系差異明顯，尤其是四倍體，在13 個(gè)形態(tài)指標(biāo)中，最大值和最小值均來自四倍體的指標(biāo)占8 個(gè)。

株高的最大值和最小值均來自四倍體，且最大值約是最小值的2．93 倍。叢枝數(shù)的最大值來自二倍體，最小值來自四倍體，分倍性比較可以看出二倍體的叢枝數(shù)較多，分生能力較強(qiáng)。主根最長的是無性系464，側(cè)根數(shù)最多氣孔的是無性系38，葉片最厚的是無性系528，氣孔長和氣孔寬最大的均為無性系38，葉片面積最大的為無性系465，葉片最圓的是無性系464，上述6 個(gè)無性系均是四倍體。葉形指數(shù)越小表示植株生長越健壯，葉形指數(shù)最小的是四倍體無性系D18-14，最大是二倍體無性系J16-32?？傮w來說，四倍體在上述形態(tài)指標(biāo)的比較中優(yōu)于二倍體，可根據(jù)育種目標(biāo)開展定向選育。

2.3 各無性系生理指標(biāo)的比較

根據(jù)對各無性系生理指標(biāo)均值的分析(表2)，發(fā)現(xiàn)四倍體不同無性系之間仍存在較大差異。6 個(gè)生理指標(biāo)中除丙二醛的最大值為二倍體天性系外，其余指標(biāo)的最大值和最小值均來自四倍體。

SPro 含量的最大值是無性系D18-14，Pro 含量的最大值是無性系D18-2，MDA 含量的最小值是無性系243，這3 個(gè)無性系均是四倍體，相關(guān)生理指標(biāo)的數(shù)據(jù)表明上述無性系具有較強(qiáng)的抗逆性。葉綠素a 含量的最大值是無性系464，葉綠素b 含量和葉綠素總量的最大值是無性系108，且無性系108 葉綠素a 含量僅次

于無性系464，綜合考慮這3 個(gè)指標(biāo)，無性系108 葉綠素含量豐富，具有較強(qiáng)的光合能力。由于葉綠素a 含量較高的無性系464 和108 是四倍體，說明四倍體具有較強(qiáng)的光合能力。

表1 各無性系形態(tài)指標(biāo)均值Table 1 The mean of morphological indexes of each clone

表2 各無性系生理指標(biāo)均值Table 2 The mean of physiological indexes of each clone

2.4 二倍體與四倍體刺槐形態(tài)指標(biāo)的比較

由23 個(gè)無性系的13 個(gè)形態(tài)指標(biāo)的變異分析可知(表3)，對于二倍體和四倍體無性系而言，均是葉片厚度的變異系數(shù)最大，葉片圓度的變異系數(shù)最小。二倍體葉片厚度的變異幅度為0．07～1．00 mm；四倍體葉片厚度的變異幅度為0．07～1．33 mm，表明四倍體葉片的變化幅度較大且葉片較厚。二倍體葉片圓度的變異系數(shù)為4．39%，變異范圍為80．66%～88．19%；四倍體葉片圓度的變異系數(shù)為3．20%，變異范圍為84．25%～92．78%。根據(jù)測定結(jié)果，可以初步認(rèn)為所測定指標(biāo)中的葉片厚度變異較為豐富，葉片圓度較為穩(wěn)定。而且，只有二倍體的氣孔長、葉片長、葉片圓度和四倍體的葉片圓度的變異系數(shù)小于10%，其余指標(biāo)的變異系數(shù)均大于10%，說明所測定指標(biāo)的變異較為豐富，不同倍性刺槐的不同無性系以及不同指標(biāo)之間存在較為豐富的變異，這都有利于育種工作者根據(jù)不同性狀及需求進(jìn)行選擇育種。

表3 二倍體與四倍體刺槐形態(tài)指標(biāo)的變異分析Table 3 Variation analysis of morphological indices of diploid and tetraploid Robinia pseudoacacia L.

2.5 二倍體與四倍體刺槐生理指標(biāo)的比較

根據(jù)對23 個(gè)無性系的6 個(gè)生理指標(biāo)的變異分析可知(表4)，二倍體中SPro 含量的最小值和均值都大于四倍體，但其最大值比四倍體的小，說明對于單個(gè)無性系來說，四倍體刺槐的表現(xiàn)較好，而四倍體無性系之間差異較大。二倍體Pro 含量的最大值比四倍體的小，但其最小值和均值都大于四倍體的。對于MDA 含量，二倍體中最大值、最小值和均值都大于四倍體。二倍體中葉綠素a 含量的最大值、最小值、均值均小于四倍體。葉綠素b 和葉綠素總量則是二倍體的最小值大于四倍體，四倍體最大值和均值較二倍體大。

表4 二倍體與四倍體刺槐的生理指標(biāo)Table 4 Physiological index of diploid and tetraploid Robinia pseudoacacia L.

2.6 二倍體與四倍體刺槐測定指標(biāo)的相關(guān)性分析

通過對二倍體與四倍體刺槐的形態(tài)指標(biāo)及生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析(表5)，發(fā)現(xiàn)氣孔長與氣孔寬呈極顯著正相關(guān)，葉片長與葉片面積、葉片長與葉片周長、葉片寬與葉片面積、葉片寬與葉片周長均呈極顯著正相關(guān)。葉形指數(shù)與葉片圓度呈極顯著負(fù)相關(guān)；葉綠素a 與葉綠素b、葉綠素a 與葉綠素總量、葉綠素b 和葉綠素總量均呈極顯著正相關(guān)。主根長與側(cè)根數(shù)呈顯著相關(guān)，側(cè)根數(shù)與SPro 含量呈顯著相關(guān)，葉片寬與葉綠素a 含量和葉綠素總量均呈顯著相關(guān)。由相關(guān)性分析可知，各指標(biāo)之間存在較為復(fù)雜的相關(guān)關(guān)系，因此，在選育過程中，不能只考慮某一指標(biāo)，還需要綜合考慮與其相關(guān)性極顯著的其他指標(biāo)。

3 討論

對種質(zhì)資源的形態(tài)和生理等指標(biāo)的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，有利于針對不同無性系的特點(diǎn)進(jìn)行定向篩選，為后續(xù)的育種工作奠定理論基礎(chǔ)[23-24]。

本研究對所選的23 個(gè)不同倍性刺槐組培苗無性系的形態(tài)指標(biāo)及生理指標(biāo)進(jìn)行了分析，從形態(tài)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析來看，不同倍性、不同無性系之間的不同指標(biāo)均存在一定差異。除叢枝數(shù)和葉形指數(shù)兩個(gè)形態(tài)指標(biāo)外，二倍體其余形態(tài)指標(biāo)的最大值均小于四倍體。而四倍體中，只有主根長和葉片圓度的最小值大于二倍體。與二倍體叢枝數(shù)的均值相比，四倍體的較小，但是，二倍體的圓度均值小于四倍體。而且，四倍體的葉片面積和周長的均值都大于二倍體。根據(jù)試驗(yàn)觀測，四倍體的株型較二倍體更通直，且葉片較大較圓。這些表型分析對刺槐組培苗倍性的初篩提供了一定依據(jù)。二倍體葉形指數(shù)的最大值、最小值和均值都大于四倍體，而葉形指數(shù)較小是生長健壯的標(biāo)志[25]。四倍體的株高、主根長均值也大于二倍體，由此可以初步斷定四倍體的長勢優(yōu)于二倍體。四倍體的氣孔長和寬均大于二倍體。氣孔是植物與外界進(jìn)行氣體交換的通道，氣孔導(dǎo)度會(huì)影響植物的蒸騰作用和光合作用，進(jìn)而對植株的抗逆性及生態(tài)適應(yīng)性造成影響，這也是四倍體較二倍體抗性較強(qiáng)的原因之一[26]。

SPro 是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，作為一種親水膠體，SPro 可以提高細(xì)胞的持水能力，維持細(xì)胞膨壓，抵御逆境傷害，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及細(xì)胞膜起到保護(hù)作用[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，四倍體SPro含量的最大值比二倍體大，說明SPro 含量最高的無性系來自四倍體，可根據(jù)育種目標(biāo)從四倍體中篩選出抗逆性強(qiáng)的無性系。

表5 二倍體與四倍體刺槐的形態(tài)指標(biāo)及生理指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of morphological and physiological indexes between diploid and tetraploid Robinia pseudoacacia L.

Pro 是植物蛋白質(zhì)的組分之一，植物在逆境條件下(旱、鹽堿、熱、冷)體內(nèi)Pro 含量顯著增加?？鼓嫘詮?qiáng)的品種往往積累較多的Pro，因此Pro 含量可以作為衡量植物抗性的生理指標(biāo)[28]。本試驗(yàn)中，四倍體刺槐Pro 含量的變化范圍較大，最大值也來源于四倍體，說明四倍體刺槐無性系之間差異較大，且抗逆性強(qiáng)于二倍體。此外，還可以根據(jù)不同無性系Pro 含量為抗性育種提供篩選依據(jù)。

MDA 是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，它能加劇膜的損傷，因此通常將MDA 含量作為衡量膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應(yīng)強(qiáng)弱的指標(biāo)，MDA 含量越高，表明細(xì)胞過氧化程度越嚴(yán)重[29]，植物細(xì)胞受到損傷的程度也越嚴(yán)重。本試驗(yàn)表明，四倍體MDA 含量維持在較低水平，其最大值、最小值以及均值都小于二倍體，說明測定的四倍體無性系的抗逆性整體優(yōu)于二倍體。MDA 含量越少說明植物膜傷害程度越輕，光合產(chǎn)物降解越少。試驗(yàn)結(jié)果基本符合葉綠素含量越多，MDA 含量越少的規(guī)律。

光合作用是植物體內(nèi)重要的代謝過程，是干物質(zhì)積累的基礎(chǔ)，關(guān)系到植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[30]。葉片是植物進(jìn)行光合作用和呼吸作用的主要場所，在一定程度上，葉綠素含量可以反映光合作用的強(qiáng)度及生物量[31]。本試驗(yàn)中，四倍體中葉綠素b 含量的最小值小于二倍體，但其余指標(biāo)均大于二倍體，說明四倍體刺槐的葉片具有更強(qiáng)的光合能力。這與蔡力[32]和宋慶安[33]研究結(jié)論一致。

二倍體與四倍體刺槐在形態(tài)和生理指標(biāo)中存在差異，這可能是多倍體重復(fù)基因劑量效應(yīng)造成的，基因劑量增加時(shí)，生化活動(dòng)也隨之加強(qiáng)；也有可能是不同基因型引起的，供試的二倍體與四倍體刺槐遺傳背景差異較大，23 個(gè)無性系來自4 個(gè)刺槐半同胞家系，不同無性系之間的差異由父本和母本以及染色體倍性共同作用引起。根據(jù)二倍體與四倍體刺槐各指標(biāo)的最值，可以篩選出具備單一優(yōu)良性狀的最佳無性系以及具備多個(gè)優(yōu)良性狀的無性系。但是，不同倍性供試的無性系數(shù)量不同，對于二倍體與四倍體之間的評(píng)價(jià)，應(yīng)綜合考慮均值、最大值、最小值、標(biāo)準(zhǔn)誤以及標(biāo)準(zhǔn)差之間的差異。

本研究比較了二倍體與四倍體刺槐組培苗形態(tài)和生理性狀，反映了不同倍性及不同基因型組培苗之間的差異，但是，移栽后生長及各性狀變化還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究以二倍體和四倍體刺槐的組培苗為材料，通過形態(tài)及生理多性狀的比較分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)四倍體刺槐無性系在形態(tài)和生理指標(biāo)方面都優(yōu)于二倍體。可以根據(jù)本研究各無性系的不同性狀表現(xiàn)，結(jié)合育種目標(biāo)，篩選出優(yōu)良四倍體刺槐無性系，豐富四倍體刺槐種質(zhì)資源，為選擇育種工作提供理論依據(jù)，也為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。