黃興法 ， 徐 鑫 ， 張 晶 ， 王秀英 ， 劉玉蘭 ， 汪文俊 ， 康 萍

（1.中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074；2.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）

隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大， 如何降低外界環(huán)境因素對(duì)養(yǎng)殖業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失一直是研究者關(guān)注的重點(diǎn)。 環(huán)境中的微生物，如細(xì)菌、真菌和病毒等均會(huì)導(dǎo)致仔豬在飼養(yǎng)過程中產(chǎn)生免疫應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)動(dòng)物炎癥。 脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，在組織細(xì)胞中，能快速誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)（Irtegun 等，2016）。miRNA 是一種約含22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA 分子，在大多數(shù)真核生物中存在高度保守性 （Geng 等，2014）。 許多哺乳動(dòng)物miRNAs 可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng) （Qiu 等，2019；O"connell 等，2012）。 腓腸肌是小腿后面淺層的大塊肌肉，其組織中的蛋白酶體標(biāo)志物、氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體呼吸鏈（MRC）活性、耗氧量等指標(biāo)一直被廣泛研究（Barreiro 等，2016）。 雖然目前對(duì)LPS 刺激后誘導(dǎo)的機(jī)體組織編碼基因關(guān)鍵信號(hào)通路研究很多， 但對(duì)相關(guān)非編碼基因在炎癥反應(yīng)中調(diào)控的研究并不多。因此，本試驗(yàn)旨在研究仔豬腓腸肌相關(guān)miRNA 在發(fā)生炎癥斷奶仔豬的基因表達(dá)情況，為后續(xù)研究miRNA 在肌肉組織中的炎癥調(diào)控作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇體重為（7.1±0.9）kg 的杜×長(zhǎng)×大斷奶仔豬42 頭，飼喂基礎(chǔ)飼糧14 d 后，設(shè)置對(duì)照組（注射 LPS 之前 0 h）和 LPS 組（注射 LPS 之后 1、2、4、8、12、24 h）。分別按體重 100 μg/kg 腹腔注射生理鹽水和LPS，然后屠宰取腓腸肌樣品待測(cè)。

1.2 試驗(yàn)飼糧 飼糧配方采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，參照NRC（1998）仔豬營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制，具體組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)注射LPS 的血清型、來源、配制方法與汪洋等（2019）的一致。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 飼養(yǎng)管理 動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。 本試驗(yàn)飼養(yǎng)管理方法參照陳會(huì)甫等（2018）的方法進(jìn)行。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法 用 RNAiso Plus 試劑（#9108，TaKaRa） 提取腓腸肌組織總 RNA。 根據(jù)PrimeScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser（#RR047A，TaKa-Ra）說明書進(jìn)行基因組 DNA 去除，并用mirVanaTMqRT-PCR 引物套裝（吉瑪基因，上海）和 SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）qPCR Kit （#RR420A，TaKaRa） 進(jìn) 行 成 熟miRNA 定量檢測(cè)。 以 U6 為內(nèi)參，并參照 Livak 等（2001）的 2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s 多重比較，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P ＜0.05 表示差異顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

LPS 刺激對(duì)斷奶仔豬腓腸肌miRNA 相關(guān)基因表達(dá)量的影響結(jié)果見表2。 與對(duì)照組相比，LPS刺激后2 h，仔豬腓腸肌miRNA-10b 的mRNA 表達(dá)量顯著降低 （P ＜ 0.01）；LPS 刺激后 1 h， miRNA-1 和miRNA-206 的mRNA 表達(dá)量顯著降低（P ＜ 0.01）；但 LPS 刺激后 miRNA-133a 的 mRNA表達(dá)量無顯著變化（P ＞ 0.05）。

3 討論

給斷奶仔豬注射一定劑量的LPS 是建立仔豬炎癥的良好模型（Zhu 等，2013）。研究表明，LPS刺激后4 h 可誘導(dǎo)肌肉炎性細(xì)胞因子大量表達(dá)（李先根等，2019）。 還有研究報(bào)道，先天性免疫細(xì)胞可以處于不同的狀態(tài)， 具有不同程度的促炎和抗炎表型（Hanke 等，2013；Stephanie 等，2009），并伴隨著對(duì)宿主防御和炎癥的不同后果（Marrotte等，2010）。 汪洋等（2019）的研究也表明，LPS 刺激激活了炎癥信號(hào)通路， 使炎性細(xì)胞表達(dá)量顯著上調(diào)，并在不同時(shí)間點(diǎn)，這些基因呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的變化。 隨著現(xiàn)在對(duì)miRNA 的深入關(guān)注，發(fā)現(xiàn)不同的miRNA 對(duì)機(jī)體組織炎癥有著不同的調(diào)控功能。 例如：通過有效下調(diào)miRNA-DAB2IP 可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲性，促進(jìn)NF-κB 信號(hào)的激活， 進(jìn)而促進(jìn)促炎癥和促血管生成因子的表達(dá)（Bellazzo 等，2018）。 miRNA-19b 通過抑制胸腺基質(zhì)淋巴生成素下調(diào)小鼠哮喘模型的STAT3 信號(hào)來減少氧化應(yīng)激程度（Ling 等，2017）。 miRNA-125b 上調(diào)可激活NF-κB 途徑促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）炎癥（Zhang 等，2017）。 此外，炎癥相關(guān)的miRNA 在牛乳中的表達(dá)水平受到乳腺炎的影響，牛奶中的miRNA 有可能作為牛乳腺炎的生物標(biāo)志物（Lai 等，2017）。 以上研究表明，機(jī)體內(nèi)這些小分子RNA 雖然不能編碼蛋白質(zhì)，但是其也能夠調(diào)控機(jī)體的炎癥相關(guān)信號(hào)通路。 因此本試驗(yàn)的目的是研究LPS 處理前后不同時(shí)間點(diǎn)不同miRNA的表達(dá)，為后續(xù)研究miRNA 在肌肉組織中的炎癥調(diào)控作用提供科學(xué)依據(jù)。

表2 LPS 處理前后不同時(shí)間點(diǎn)miRNA 表達(dá)

miRNA-10b 是最先被證明在癌癥中有異常表達(dá)的 miRNA 之一（Mal 等，2017）。 迄今為止，已有超過100 項(xiàng)關(guān)于miRNA-10b 與18 種癌癥轉(zhuǎn)移的研究。 Sheedy 和 Medarova（2018）認(rèn)為 miRNA-10b 作為癌癥治療和診斷靶點(diǎn)的潛力是非常重要的。此外，miRNA-10b 還與骨形成呈正相關(guān)，可促進(jìn)體外成骨和抑制體外成脂（Li 等，2018）。 在本研究中，LPS 刺激 2 h 后，miRNA-10b 表達(dá)顯著降低， 說明miRNA-10b 可能對(duì)動(dòng)物早期免疫應(yīng)激后起到了負(fù)調(diào)控的作用。miRNA-1 是最先被證明在肌肉細(xì)胞衍生物中特異表達(dá)的miRNA 之一（Nicholas 等，2005）。 截止到目前，已有 50 余項(xiàng)關(guān)于miRNA-1 在肌肉相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控的研究。Cai 等（2015）認(rèn)為，miRNA-1 與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控多種與心肌電活動(dòng)相關(guān)的離子通道和蛋白有關(guān)。此外，miRNA-1 還對(duì)心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)沉積以及心臟重塑至關(guān)重要 （Luo 等，2018）。 在本研究中，LPS 刺激 1 h 后， 腓腸肌中 miRNA-1 表達(dá)顯著降低， 說明miRNA-1 可能對(duì)動(dòng)物早期免疫應(yīng)激也起到了負(fù)調(diào)控的作用。miRNA-206 是最先被證明在小鼠骨骼肌中有異常表達(dá)的miRNA 之一（Mccarthy 等，2007）。迄今為止，已有 20 余項(xiàng)關(guān)于miRNA-206 在肌肉組織中的研究。 Zhang 等（2019） 認(rèn)為，miR-206 在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中非常重要。此外，miRNA-206 還與乳腺癌有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo) （Xing 等，2016）。 在本研究中，LPS 刺激 1 h 后， 腓腸肌中miRNA-206 表達(dá)顯著降低， 說明 miRNA-206 可能對(duì)動(dòng)物早期免疫應(yīng)激起到了負(fù)調(diào)控的作用。miRNA-133a 首次被證明是在成人骨骼肌中有異常表達(dá)的 miRNA 之一（Mccarthy 等，2007）。 迄今為止， 已有200 余項(xiàng)關(guān)于miRNA-133a 在肌肉中差異表達(dá)的研究。Ramos 等 （2018）認(rèn)為，miRNA-133a 通過耗盡肌肉細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存并釋放其對(duì)靶基因表達(dá)的抑制作用，潛在地介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)的生理適應(yīng)。此外，miRNA-133a 還與腰椎骨密度呈負(fù)相關(guān)，通過促進(jìn)破骨細(xì)胞分化參與了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的調(diào)節(jié)（Zhong 等，2018）。 在本研究中，LPS 刺激 1 h后，miRNA-133a 無顯著變化，說明在仔豬應(yīng)激早期可能沒有參與機(jī)體的炎癥調(diào)控。 綜上， 在本試驗(yàn)中， 通過建立仔豬LPS 炎癥損傷模型顯示，仔豬腓腸肌組織中的 miRNA-10b、miRNA-1、miRNA-206 的基因表達(dá)量均顯著下調(diào)， 但miRNA-133a 的基因表達(dá)量無顯著變化，這表明在LPS 刺激后同一個(gè)miRNA 在不同機(jī)體組織炎癥反應(yīng)中的表達(dá)也不一致。

4 結(jié)論

LPS 刺激下誘導(dǎo)腓腸肌相關(guān)基因miRNA-10b、miRNA-1 和 miRNA-206 在不同時(shí)間點(diǎn)均有顯著降低，表明這些miRNA 可能參與了肌肉炎癥早期相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，可為后續(xù)miRNA 在肌肉組織中具體調(diào)控作用提供科學(xué)依據(jù)。