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        基于近紅外光譜技術馬鈴薯蛋白質含量定標模型的構建

        2021-02-21 08:54:50高紅秀
        中國馬鈴薯 2021年6期
        關鍵詞:定標馬鈴薯光譜

        李 贊,高紅秀,金 萍,石 瑛*

        (1.江蘇農林職業(yè)技術學院,江蘇 鎮(zhèn)江 212400;2.東北農業(yè)大學農學院,黑龍江 哈爾濱 150030)

        馬鈴薯在全世界范圍內一直是重要的糧食作物之一。隨著人們生活水平的不斷提升,對馬鈴薯的品質要求也逐漸提高,蛋白質含量是研究馬鈴薯品質中重要的指標之一。傳統(tǒng)測試馬鈴薯塊莖蛋白質含量的方法一般采用凱式定氮法,其作為一種國際通用的測試方法,技術比較成熟且標準化,但應用過程中存在一些明顯不足。該方法需要對檢測樣品進行前處理,操作過程消耗時間長(至少需要2 h 才能完成),工作量較大,費工費時,且所使用試劑具有強烈的腐蝕性,對環(huán)境污染大。因此,需要找到一種快速和準確檢測馬鈴薯蛋白質含量的有效方法,為馬鈴薯蛋白質含量的評價提供依據(jù)。

        采用近紅外方法測定蛋白質含量可以大幅度減少操作過程中消耗的各類材料,去掉了很多繁瑣且有危險的工作程序,降低了有害氣體的污染和對操作人員的傷害,大幅提升測試分析的工作效率,并顯著降低測試成本。近紅外光譜分析技術實際上是一個二級分析方法,在對未知樣品進行分析之前,必須選擇一組具有代表性的樣品作為一個定標集,對應其中的每個樣品測量光譜及對應的組分或性質,并采用多元校正的方法將已測量的光譜與對應的性質或組成數(shù)據(jù)關聯(lián),建立該組分的定標模型,然后進行未知樣品光譜數(shù)據(jù)的采集,并將其與校正模型相互對應,計算出此未知樣品的組分。因此,近紅外光譜分析技術的廣泛應用,最重要的是建立定標模型,定標模型的合理性直接影響檢測結果的準確度和穩(wěn)定性。

        近紅外光譜分析技術在測定農副產品(如飼料、谷物、肉、蛋、奶、水果和蔬菜)的品質(包括蛋白質、脂肪、纖維、灰分、氨基酸等)方面得到廣泛使用[1-7],已成為糧食品質分析的重要手段。近年來,已有不少作物利用近紅外技術測定蛋白質含量。研究者利用近紅外光譜技術分別對小麥[8]、水稻[9]、大豆[10]、玉米[11]和食用向日葵子仁[12]中的蛋白質含量進行了定標模型的建立,并取得了良好的效果。由此可見,利用近紅外技術對谷物品質建立定標模型的方法已經相當成熟,并已有相關報道近紅外技術應用于馬鈴薯研究中[13,14],但利用近紅外技術在馬鈴薯蛋白質含量分析測試方法或建立相關模型方面的報道還很少。本研究以不同年份、不同區(qū)域的馬鈴薯塊莖為試驗材料,進行馬鈴薯塊莖蛋白質含量近紅外光譜定標模型的建立,并對其準確性進行驗證,以期提供一種準確、快速、無需預處理測定馬鈴薯塊莖中蛋白質含量的分析方法,為以后的相關研究與應用提供理論指導。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        供試材料為東北農業(yè)大學馬鈴薯育種基地的無性系種質材料,馬鈴薯品種審定區(qū)域試驗、生產試驗的品種(系),來自于克山、訥河等地的馬鈴薯品種(系)。樣品數(shù)目為986 份,按不同年份、地域、生長季節(jié)等條件收集有代表性的馬鈴薯樣品,將新鮮樣品切碎,放在105℃的恒溫箱內殺青30 min,然后將溫度調到70.5℃,繼續(xù)烘干14~16 h,使樣本材料至恒重,將樣品粉碎至30~40 目,裝于小塑料袋中密封保存。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 樣品掃描

        采用福斯公司生產的近紅外分析儀Infraxact對樣品進行光譜掃描,掃描前,先將光譜儀開機預熱1 h。波長范圍570~1 850 nm,每份樣品重復3 次。然后使用WinISI III 軟件對光譜進行平均,生成平均光譜文件。

        1.2.2 蛋白質含量化學值測定

        馬鈴薯蛋白質含量化學測定方法為凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)[15],使用瑞典福斯公司的2300 型全自動凱氏定氮儀進行測定。每個樣品采用雙平行分析,測定結果取平均值。

        1.2.3 剔除超常和過剩樣品,確定定標樣品集

        采用主成分分析技術(聚類分析技術)將光譜數(shù)據(jù)進行壓縮,并分解為主成分和得分矩陣數(shù)據(jù)。然后利用得分矩陣數(shù)據(jù),比較各樣品光譜間的差異,以及某樣品與主組群樣品組間的差異,以此確定相似樣品及超常樣品,從而可確定參與定標的最好樣品。首先,利用光譜文件創(chuàng)建得分文件,計算出數(shù)據(jù)的平均值和每一個樣品到平均值的距離。邊界是數(shù)據(jù)集的3 倍標準偏差。然后從剔除超常樣品后的光譜文件中選擇代表性樣品,即剔除過剩樣品。過剩樣品剔除限是0.6,0.6 的定義為以某一個樣品為中心,在半徑為0.6以內的樣品將被認為是與此樣品相似,其光譜的性質則不能增加定標集樣品的變異范圍,即作為過剩樣品,不可參加定標樣品集。

        1.2.4 定標模型的建立

        首先將測定的樣品化學值輸入到定標集的光譜文件中,使每個樣品的近紅外光譜與化學值一一對應,然后用軟件中的改進最小二乘法(Modified partial least squares,MPLS)回歸技術法建立馬鈴薯蛋白質含量的近紅外分析模型,預處理方法None(無散射處理)和SNV+Detrend(標準正常化+散射處理),導數(shù)處理參數(shù)選擇分別為0.0.1.1、1.4.4.1。觀察統(tǒng)計數(shù)據(jù)列交叉驗證相關系數(shù)(1 minus the variance ratio,1-VR)和交叉驗證誤差(Standard error of cross-validation,SECV),找出1-VR 值最大,而SECV 值最小的即為最佳定標模型,這兩組數(shù)據(jù)基本能反應定標模型對其他未知樣品的預測性能。

        1.2.5 定標模型的驗證

        在定標方程建立后,以一組沒有參與定標的樣品集作為驗證集,對該方程的預測性能進行驗證。驗證樣品集樣品應具有代表性,其成分應覆蓋在一定范圍,并且其傳統(tǒng)實驗室參考數(shù)據(jù)須準確可靠,才能保證驗證結果的合理性[16]。定標驗證工作是通過WinISI 軟件的Monitor Program 程序進行的,其驗證結果表征為實驗室數(shù)據(jù)和近紅外預測數(shù)據(jù)相互比較所計算出的一系列統(tǒng)計結果。

        2 結果與分析

        2.1 馬鈴薯測試樣品的近紅外光譜圖

        在收集樣品光譜后,首先觀察每一樣品的吸收圖譜,對于異常圖譜要重新進行掃描或作剔除處理。樣品的近紅外光譜圖如圖1 所示,馬鈴薯近紅外光譜圖有明顯的吸收峰。

        圖1 馬鈴薯測試樣品近紅外光譜圖Figure 1 Near infrared spectrogram of potato samples

        2.2 確定定標樣品集

        采用主成分分析PCA 法,根據(jù)馬氏距離或相關性去除超常樣品和過剩樣品,超常樣品剔除限是3.0,過剩樣品剔除限是0.6,最終確定定標樣品集為411 份。樣品蛋白質含量分布見圖2,樣品化學含量的梯度分布較均勻,基本覆蓋了馬鈴薯的化學指標含量范圍,有較好的代表性,滿足建標的需要。本試驗隨機選取100 份樣品組成驗證集,其余311 份樣品自動生成定標集,其中最小值為6.77,最大值為23.21。定標樣品集及驗證集蛋白質含量的分布見表1。

        表1 蛋白定標集及驗證集化學分析數(shù)據(jù)Table 1 Chemical analysis of protein content calibration and validation sets

        圖2 馬鈴薯測試樣品蛋白質含量柱形圖Figure 2 Histogram of protein contents of potato test samples

        2.3 定標模型的建立

        將測定的樣品化學值輸入到定標集的光譜文件中,用MPLS 法建立蛋白質含量的近紅外分析模型,預處理方法分別為無散射處理(None)和去散射處理(SNV + Detrend),導數(shù)處理參數(shù)選擇分別為0.0.1.1、1.4.4.1。觀察統(tǒng)計數(shù)據(jù)列1-VR 和SECV,找出1-VR 值最大的,而SECV 值最小的即為最佳定標模型。最終采用一階導數(shù)的數(shù)學處理(1, 4, 4, 1)、去散射處理(SNV + Detrend)組合的預處理方法為最優(yōu)定標模型。馬鈴薯蛋白質定標方程參數(shù)如表2 所示,其定標標準偏差(SEC)、交叉檢驗標準誤差(SECV)和交叉驗證相關系數(shù)(1-VR)分別為0.566、0.632 和0.912,說明所建的定標模型可用于馬鈴薯塊莖蛋白質含量的快速檢測,該模型可代替常規(guī)測試方法使用。

        表2 馬鈴薯蛋白質組分定標模型參數(shù)Table 2 Parameters of calibration model for potato protein contents

        2.4 定標模型的驗證

        定標模型建立后用100 份沒有參與定標的樣品來評估定標方程的預測性能。得到預測結果與常規(guī)方法測定結果及其偏差見表3 以及馬鈴薯蛋白質預測值與化學值相關圖(圖3)。

        在表3中,85號樣品、89號樣品和98號樣品的化學值和預測值之間的差值偏大,視為異常樣品,作剔除處理,剔除異常樣品后對剩下的97個樣品的化學值和預測值進行相關性分析,結果如圖3所示。

        表3 化學法測定值和近紅外預測值的比較Table 3 Comparisons of values measured by chemical analysis and near infrared predicted

        圖3 近紅外預測值與實驗室分析值相關分析Figure 3 Correlation analysis between near infrared predicted value and chemical analysis value

        與常規(guī)化學分析測量結果之間的相關系數(shù)(R)為0.931,斜率為0.986,其斜率和相關系數(shù)均接近于1,結果表明近紅外預測馬鈴薯蛋白質含量與傳統(tǒng)方法結果無顯著差異,所建的模型用于馬鈴薯蛋白質含量檢測是準確可靠的。

        3 討 論

        試驗建立了一個馬鈴薯塊莖蛋白質含量的近紅外定標模型,并對構建的定標方程的預測性能進行了評估。試驗結果表明,馬鈴薯塊莖蛋白質含量定標模型的SECV 值為0.632,而1-VR 值為0.912,蛋白質含量的驗證參數(shù)SEP 值為0.558,R值為0.931(圖3),說明所建模型與凱氏定氮法測定的蛋白質含量無顯著差異,結果可靠、理想,檢測精度高、重復性好,可以用于今后馬鈴薯蛋白質含量的快速測定。

        應用近紅外技術不僅可以大大縮短品質育種工作中的材料篩選時間,而且可以節(jié)省大量的人力、物力和財力,并且減少了很多工序,提高了工作效率,降低了有害氣體的污染和對實驗操作人員的傷害。但是,近紅外光譜技術是通過樣品近紅外光譜與化學值之間的定標模型來預測未知樣品的組分含量,實際上是一個二級分析方法[16]。影響定標準確度的因素很多,如參與定標的樣品數(shù)量不足,不具代表性;定標樣品差異性不顯著造成定標不具代表性;樣品近紅外掃描數(shù)據(jù)差;定標所使用的實驗室數(shù)據(jù)分析不精確;非線性因素對定標的影響等[17]。特別是在定標集的樣品選擇上并不是樣品數(shù)量越多越好,應選擇具有代表性的,蘆永軍等[18]研究表明,采用相似樣品剔除算法從178 個玉米粉樣品中成功提取了94 個優(yōu)選樣品,通過對178 個樣品和94 個優(yōu)選樣品分別進行定標試驗發(fā)現(xiàn)優(yōu)選樣品保持了由原始樣品集參與定標所達到的定標精度,給出了滿意的定標結果。樣本比例分配也應適當,韓春亮等[19]研究表

        明以70%的比例樣本作為定標模型的建立,其余30%比例樣本作為該模型的驗證樣本,可以獲得更好的預測效果。

        定標模型并不是一勞永逸的,由于自然樣品其成分隨著種植季節(jié)、施肥量、降雨量和種植條件的變化而發(fā)生相應變化,因此,定標方程應定期補充新樣品的掃描光譜和化學分析數(shù)據(jù)進行逐步調整或升級,目的是使定標方程不斷適用待測樣品的變化。如果樣品的驗證效果符合要求,則不需要進行定標調整,如果驗證效果不符合要求,則從實驗室成分分析的準確性以及定標模型的適用性等方面尋找問題根源,并進行相應的再次驗證,直到符合定標要求,該模型才可以使用[16]。在定標的過程中如遇到超常樣品,應對超常樣品進行化學分析,然后將樣品添加到原定標樣品系對模型進行升級,對模型進行升級將使模型的預測性能更穩(wěn)定。

        目前,天然樣品近紅外定標最常使用的定標技術為改進最小二乘法回歸(MPLS),很多廣泛應用的商品化軟件中都采用此種建模方式。但當選擇的校正集樣本中出現(xiàn)奇異點(即超常樣品),或個別樣品的性質范圍已經超出校正集樣本的范圍時,則會出現(xiàn)較大偏差的可能。隨著技術的不斷革新,人工神經網絡(ANN)技術解決了定標面臨的吸收非線性問題,適用于處理大樣品數(shù)據(jù)庫,至少需要1 000 份樣品,因此其模型適用范圍廣,可以減少或降低定標模型的調整工作,在很多領域的應用中已取得了良好效果。如全球通用谷物定標開發(fā),即使樣品地域或收購季節(jié)和品種變化時仍然獲得較好結果。但是在光譜模型的構建過程中,必須投入相對較多的材料和時間成本,才能得到更加準確的校正模型。所以,如何實現(xiàn)技術優(yōu)化和更有效的模型共享,仍是將近紅外光譜技術研究及廣泛應用的重要課題。

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