曹瑋瑋，李維平，陳凡帆，黃國棟，陳壘，孟祥寶，李宗陽

（深圳市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 深圳 518035）

多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是成年人最為常見，且惡性程度最高的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占顱腦腫瘤的30% ～ 50%，復發(fā)率居顱內(nèi)腫瘤首位[1]。腫瘤多呈浸潤性生長，手術不易全切，目前仍無確切有效的治療手段，盡管近些年影像學、外科學以及聯(lián)合放、化療的應用使惡性膠質(zhì)瘤患者的診治取得了一定進展，但GBM患者在過去的10年間生存期未明顯提高，其中位生存期少于15個月，而5年生存率更是不足5%[1]。GBM的病因及發(fā)病機制尚未完全明確，但越來越多的證據(jù)表明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasomes system，UPS）和自噬-溶酶體途徑（autophagy-lysosomepathway，ALP）通過調(diào)控促癌/抑癌因子的降解，以及介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激耐受和錯誤折疊蛋白反應，參與了GBM的發(fā)生發(fā)展與耐藥[2-3]。UPS和ALP是2種重要的胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解機制，可通過消除錯誤折疊或未折疊蛋白和調(diào)節(jié)蛋白相互作用影響轉(zhuǎn)錄、DNA損傷和修復、細胞周期進展、內(nèi)吞作用、凋亡等，以維持細胞和組織的平衡[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)UPS和ALP之間，通過共活化因子的招募，以及多聚/寡聚泛素化調(diào)控作用，在自噬體與自噬溶酶體形成與轉(zhuǎn)運過程中存在著多層次的相互調(diào)控機制，2種降解途徑通過相互競爭和相互促進，在GBM的不同進展階段扮演著不同的重要角色，最終促進了GBM的發(fā)生與耐藥[5-6]（見圖1）。

圖1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體途徑之間多層次的相互聯(lián)系Figure 1 Multi-layer interconnections between the ubiquitin-proteasome system and the autophagy-lysosome pathway

1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在多形性膠質(zhì)母細胞瘤中的作用及在研藥物

1.1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在多形性膠質(zhì)母細胞瘤中的作用

典型的UPS包括泛素與蛋白底物共價連接和蛋白酶體的降解過程。泛素分子被E1激活酶活化，在泛素的C端甘氨酸殘基和E1激活酶的半胱氨酸殘基之間形成硫酯鍵，然后通過反硫醇化反應被轉(zhuǎn)移到E2結合酶，最后由E3連接酶介導泛素的C端甘氨酸殘基與蛋白質(zhì)賴氨酸殘基的ε-氨基之間形成異肽鍵[7]。E3連接酶根據(jù)其組裝和作用機制可分為RING指型、U-box型、PHD指型和HECT型[8]。HECT E3連接酶使泛素與E3連接酶的半胱氨酸殘基形成共價硫酸鹽中間體，再將泛素轉(zhuǎn)移到蛋白底物上。RING E3連接酶則通過泛素和蛋白底物相互接近，直接將泛素轉(zhuǎn)移到蛋白底物上[9]。RING E3連接酶構成最大的E3連接酶超家族，可分為CRL（Cullin-Ring ubiquitin ligase complex）和APC/C（anaphase-promoting complex/cyclosome）2個亞組。CRL功能失調(diào)與GBM密切相關[10]。CRL1的F-box底物受體如S期激酶關聯(lián)蛋白2（S-phase kinaseassociated protein 2，Skp2）、含β-轉(zhuǎn)導素重復序列的 蛋 白 質(zhì)（β-transducin repeat-containing protein，β-TrCP）、F-box富含重復WD結構域蛋白7（F-box and WD repeat domain-containing 7，F(xiàn)bw7）和F-box富含亮氨酸重復蛋白3基因（F-box and leucine rich repeat protein 3，F(xiàn)bxl3）在GBM中發(fā)揮著重要作用[11]。β-TrCP受體通過泛素化核因子κB（nuclear factor κ-B，NF-κB）的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB），抑制NF-κB的核定位并抑制其與DNA相互作用。此外，β-TrCP針對β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、含DEP結構域mTOR結合蛋白（dishevelled，Egl-10，and pleckstrin domain-containing mTOR-interacting protein，DEPTOR）和其他底物進行降解，從而抑制其信號通路，在GBM中發(fā)揮關鍵作用。CRL2可對缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）進行降解，后者在GBM血管生成中發(fā)揮關鍵作用[12]。CRL3的BTB蛋白之一是Keap1[13]。Keap1可識別底物核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2），后者在GBM氧化應激中起重要作用[14]。CRL4的損傷特異DNA結合蛋白1（damage-specific DNA binding protein 1，DDB1）參與GBM細胞DNA復制和損傷修復[15]。CRL5通過靶向降解生長激素受體 （growth hormone receptor，GHR），負向調(diào)節(jié)生長激素信號，在GBM中發(fā)揮重要作用[16]。

眾所周知，蛋白泛素化過程是可逆的，從蛋白底物上去除泛素分子則是由一類去泛素化酶（deubiquitinase，DUB）催化。越來越多的證據(jù)表明DUB在GBM發(fā)生發(fā)展中起重要作用。BRCA1關聯(lián)蛋白1（BRCA1 associated protein-1，BAP1）/泛素羧基末端水解酶（ubiquitin carboxy-terminal hydrolase）、泛素羧基末端酯酶L1（ubiquitin carboxyl- terminal esterase L1，UCHL1）/泛素巰基酯酶（ubiquitin thiolesterase）和圓柱瘤63位賴氨酸去泛素化酶（cylindromatosis lysine 63 deubiquitinase，CYLD）等DUB具有致癌或腫瘤抑制活性[17]。泛素特異肽酶22（ubiquitin specific peptidase 22，USP22）參與GBM關鍵表觀遺傳調(diào)控[18]。泛素特異性肽酶 7（ubiquitin specific peptidase 7，USP7）通過切割人雙微基因2（human double minute 2，HDM2）上的泛素鏈，抑制HDM2蛋白酶體降解，導致p53抑制[19]。抑制USP7會觸發(fā)腫瘤細胞中HDM2的降解、p53的穩(wěn)定并激活細胞凋亡通路。泛素特異肽酶28（ubiquitin specific peptidase 28，USP28）可調(diào)節(jié)各種致癌基因或腫瘤抑制蛋白的水平或活性[20]。

1.2 以泛素-蛋白酶體系統(tǒng)為靶點的在研藥物

由于UPS在膠質(zhì)瘤發(fā)生、耐藥與復發(fā)的過程中的重要性，近年來全世界的制藥公司與研究學者，針對泛素系統(tǒng)對促癌/抑癌因子的降解調(diào)作用，開展了大量的藥物開發(fā)與藥理機制研究，諸如lenalidomide通過促進CRBN-CRL4泛素連接酶（E3）所引起的2個淋巴樣轉(zhuǎn)錄因子（IKAROS Family Zinc Finger 1，IKZF1）和IKZF3的選擇性泛素化和降解，并同時促進 cleaved Caspase-3 的表達、抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，顯著誘導GBM細胞的凋亡，目前已進入Ⅰ期臨床試驗階段[21-22]；此外，Nutlin-3作為一種高效且具有選擇性的泛素蛋白連接酶鼠雙微基因2（murine double minute2，Mdm2）抑制劑，也通過調(diào)控p53的降解，在臨床前研究中表現(xiàn)出了對膠質(zhì)瘤顯著的抑制作用[23]。

與此同時，由于蛋白泛素化過程是可逆的，近年來大量針對去泛素化調(diào)控的藥物研究，在GBM的治療領域取得了顯著的進展，諸如BAY 11-7082作為USP7 和 USP21的選擇性抑制劑，通過調(diào)控NF-κB通路，在臨床前研究中表現(xiàn)出了對膠質(zhì)瘤顯著的抑制作用[24-25]。此外，pevonedistat（MLN4924）作 為 Nedd8激 活 酶（NEDD8-activating enzyme，NAE）的小分子抑制劑，通過并產(chǎn)生一個酶催化的共價的NEDD8-MLN4924加合物，產(chǎn)生對Nedd8的抑制作用，進而在抗膠質(zhì)瘤的臨床前研究中表現(xiàn)出了潛在開發(fā)價值[26]。

目前發(fā)現(xiàn)的蛋白酶體抑制劑主要有：肽硼酸鹽類如硼替佐米（bortezomib，BTZ）、ixazomib、delanzomib；肽乙烯砜或肽環(huán)氧酮如carfilzomib、oprozomib；β-內(nèi)酯如 marizomib （MRZ）[27]。臨床上使用最成熟的蛋白酶抑制劑是BTZ。BTZ是首個類內(nèi)二肽硼酸酯蛋白酶體抑制劑。BTZ可逆地抑制蛋白酶體β5亞基的胰凝乳酶樣活性，并部分抑制蛋白酶體β1亞基的胰凝乳酶樣活性[28]。然而，BTZ并不抑制β2亞基。BTZ通過抑制UPS降解IkB，上調(diào)NF-κB的表達，誘導腫瘤細胞凋亡。另外，BTZ可誘導促凋亡蛋白Noxa（APR/PMAIP1）表達增加。Noxa通過增加Caspases的激活，誘導線粒體膜電位改變，線粒體釋放凋亡蛋白，引起抗凋亡蛋白Bcl-xL的磷酸化，使其無法結合Bax，最終導致腫瘤細胞凋亡。

Carfilzomib可共價結合蛋白酶β5亞基，抑制蛋白酶體類糜蛋白酶活性，可通過激活c-Jun-N末端激酶，誘導線粒體膜去極化，增加Noxa的表達水平，激活Caspase-3/Caspase-7，最終促進腫瘤細胞凋亡[29]。Ixazomib為首個口服蛋白酶體抑制劑，能夠可逆地阻斷蛋白酶體β5亞基類糜蛋白酶活性[30]。Delanzomib能夠可逆地抑制蛋白酶體類糜蛋白酶和Caspases活性[31]。Oprozomib能夠不可逆地抑制蛋白酶體類胰凝乳酶活性，可通過激活Caspase 3和poly ADP核糖聚合酶誘導細胞凋亡[32]。MRZ是從海洋放線菌Salinispora tropica中分離出來的一種新型蛋白酶體抑制劑，能夠不可逆地抑制蛋白酶體β1、β2和β5亞基，通過降低NF-κB的表達，激活Caspase-8誘導人膠質(zhì)瘤細胞凋亡[33]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，USP7抑制劑酰胺四氫吖啶衍生物HBX19818可共價結合USP7的催化Cys殘基并穩(wěn)定p53，促進G1阻滯和凋亡[34]。另外，USP7抑制劑P22077對原位神經(jīng)母細胞瘤小鼠異種移植瘤模型具有顯著抑制作用[19]。USP9X抑制劑WP1130通過抑制調(diào)節(jié)蛋白Claspin，影響DNA復制的穩(wěn)定性和DNA損傷檢查點的反應，從而增加腫瘤細胞的放射敏感性[35]。

2 自噬-溶酶體途徑在多形性膠質(zhì)母細胞瘤中的作用及在研藥物

2.1 自噬-溶酶體途徑在多形性膠質(zhì)母細胞瘤中的作用

ALP是一種基于溶酶體的降解程序，可由各種細胞壓力包括營養(yǎng)/能量匱乏、缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞器損傷激活，主要功能是清除受損的細胞器、錯誤折疊蛋白、病原體和適應代謝壓力。ALP功能障礙與GBM、神經(jīng)退行性病變、心血管疾病和衰老等密切相關[36]。ALP在GBM不同發(fā)展階段發(fā)揮著復雜的作用。在GBM的起始階段，ALP會抑制GBM的發(fā)生。然而，GBM細胞能夠利用ALP過程使其在腫瘤微環(huán)境中生存。ALP啟動受Unc-51類自噬激活激酶1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）和 Beclin-1的支配[37]。ULK1被激活后導致多個下游蛋白的磷酸化，觸發(fā)自噬級聯(lián)。ULK1與FIP200、ATG13和ATG101形成復合物[38]，其效應器是磷酯酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）復合物，包含VPS34和Beclin-1、VPS15和 ATG14[39]。ULK1促 進 Ⅲ 類 PI3K 復 合物的激活并招募到自噬體。ULK1和PI3K復合物的亞基可發(fā)生泛素化，其中TRAF6促進ULK1的K63泛素化，增強ULK1的穩(wěn)定性。TRAF6還催化Beclin-1的K63泛素化，從而阻斷Beclin-1與Bcl-2的相互作用，促進自噬[40]。DUB也能影響ULK1和Beclin-1的泛素化。USP20可維持ULK1的水平，促進自噬啟動。USP10和USP13可減少Beclin-1泛素化以防止其降解[41]。Beclin-1控制USP10和USP13的穩(wěn)定性，這表明存在一種反饋機制來維持Beclin-1的水平。Ataxin 3也能從Belcin-1上特異性地去除K11和K48泛素鏈，促進Beclin-1的穩(wěn)定[42]。Beclin-1還受USP33的間接調(diào)控。USP33使Beclin-1的RAS相關GTP結合蛋白B（RAS like proto-oncogene B，RALB）去泛素化，這對于RALB與外囊成分EXO84和Beclin-1的結合非常重要，反過來又推動ULK1和Beclin-1-VPS34復合物的組裝[43]。

ALP在腫瘤細胞中被化療藥物和放療激活，構成了GBM治療的一個潛在靶點[44]。ALP是一把雙刃劍，對化療和放療的腫瘤細胞具有促生存或促死亡作用[45]。ALP為細胞提供代謝底物，有助于維持細胞存活。不受控制的ALP卻是一種細胞死亡機制[46]。在GBM治療中，ALP對化療反應的多種影響仍然是一個非常復雜的問題。由于ALP在化療反應中的雙重作用，調(diào)節(jié)ALP對化療的反應可能具有抗腫瘤效果[47]。

2.2 以自噬-溶酶體途徑為靶點的在研藥物

截至目前，替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是GBM患者使用最廣泛、最有效的一線化療藥物[48]。TMZ化療的耐藥性是GBM治療成功的主要障礙[49]。細胞存活或死亡取決于TMZ的劑量和治療時間、細胞的DNA損傷修復能力、增殖水平和激活DNA修復蛋白的有效性。在低劑量和短期TMZ治療下，ALP是一種生存機制，而在持續(xù)TMZ治療下，ALP失控并誘導細胞自噬性死亡[50]。盡管關于ALP促生存作用或抗腫瘤作用的爭論仍然很激烈，但研究數(shù)據(jù)支持ALP在TMZ治療前的細胞保護作用。用自噬抑制劑如氯喹或抑制自噬基因包括Beclin1和其他ATG基因，可增強治療誘導的細胞凋亡[51]。ALP促進細胞存活，阻斷ALP可提高多種抗腫瘤藥物的療效。然而，在GBM不同階段阻斷自噬的抑制劑如bafilomycin A1、monensin、3-MA、wortmannin等，是否具有與氯喹相同的藥理特性尚不清楚。因此，可能需要開發(fā)誘導自噬以增強其抗腫瘤作用、抑制自噬以誘導凋亡作用的2種抗腫瘤策略。

ULK1抑制劑SBI-0206965是最早針對ULK1的小分子抑制劑之一，但它具有脫靶效應[52]。最近研究表明，許多能夠抑制ULK1的化合物可能也會抑制ULK2和Aurora激酶[53]。一系列基于氯喹的二聚體化合物包括Lys05，DQ661和DC661已顯示出顯著的抗腫瘤活性[54]。最近研究表明，所有這些化合物都能結合并抑制溶酶體酶棕櫚酰蛋白硫酯酶1（palmitoyl protein thioesterase 1，PPT1），PPT1調(diào)節(jié)棕櫚?；閷У拇罅康鞍椎募毎麅?nèi)運輸，包括mTOR蛋白和分泌蛋白[55]。FYVE型鋅指含激酶（FYVE zinc fingers contain kinases，PIKFYVE）抑制劑apilimod可以破壞溶酶體穩(wěn)態(tài)，從而阻斷自噬[56]。

3 結語與展望

UPS和ALP在GBM發(fā)生發(fā)展的關鍵蛋白的表達中發(fā)揮著關鍵作用，阻斷UPS和ALP可能是一種有效的GBM治療策略，可能產(chǎn)生更多的治療選擇性和更少的藥物毒性，該策略已被證明在包括GBM在內(nèi)的實體腫瘤中具有臨床價值。鑒于UPS和ALP在GBM發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的關鍵作用，調(diào)節(jié)UPS和ALP的跨學科研究必將有助于治療和預防GBM。