李家樵 艾樂樂 朱長(zhǎng)強(qiáng) 張靈玲 王華貴羅藝哲 唐 奇 周 楊 譚偉龍**

(1.東部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210002；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州 350002；3.江蘇宏微特斯醫(yī)藥科技有限公司，江蘇南通 226000)

漢坦病毒(hantavirus，HV)是在上個(gè)世紀(jì) 50 年代首次在朝鮮發(fā)現(xiàn)的，導(dǎo)致3 000 多名聯(lián)合國(guó)士兵患上了“朝鮮出血熱”，后確定為腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)。該病于1993年第二次暴發(fā)于美國(guó)四角地區(qū)，最初被稱為四角病，現(xiàn)在被稱為漢坦病毒肺綜合征(hantavirus pulmonary syndrome，HPS)(Jonssonetal.，2010; Zhangetal.，2015)。HV 是一種人畜共患病病原體，以嚙齒動(dòng)物、蝙蝠、鼴鼠和地鼠等小型哺乳動(dòng)物作為自然宿主和主要傳染源 (Witkowskietal.，2016)，僅在阿根廷的安第斯病毒(ANDV)中證實(shí)了人與人之間的傳播(Martinez-Valdebenitoetal.，2014)，能通過宿主的排泄物或飛沫向人類傳播，其感染傳播的風(fēng)險(xiǎn)覆蓋全球大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)，有報(bào)道表明，目前全球分布的漢城病毒是褐家鼠遷移傳播的結(jié)果(Himsworthetal.，2013)。漢坦病毒引起的病例在全世界每年報(bào)告超過 20 萬例，隨著時(shí)間的推移和自然宿主的大量繁殖，這個(gè)病例數(shù)量還在不斷的增加(Watsonal., 2014)。HFRS 的病死率在 5%～15% 之間，HPS 的病死率則高達(dá)40%(Liuetal., 2019)，HFRS 是由漢灘型 (Hantan virus，HTNV)、漢城型 (Seoul virus，SEOV)、普瑪拉型 (Puumala virus，PUUV)和多不拉伐型 (Dobrava virus，DOBV)等幾種正漢坦病毒引起的，而無名病毒(Sin Nombre virus，SNV)和紐約病毒(New York virus，NYV)與 HPS 有關(guān)(Zelenetal., 2013; Reynesetal., 2015)，其中 HFRS 多發(fā)于歐亞大陸，HPS 多發(fā)于美洲地區(qū)(Lietal.，2011)。在亞洲，主要流行的是漢灘型病毒(HTNV)和漢城型病毒(SEOV)，其中 HTNV 型可分為 9 個(gè)亞型，SEOV 型則有 4～6 個(gè)亞型，其中S4亞型作為6個(gè)已知亞型種類的主要亞型之一，除了西藏高原地區(qū)，分布于我國(guó)國(guó)內(nèi)的大部分地區(qū)，在新疆等沙漠地帶也出現(xiàn)了該亞型引起的病例，并且作為東南沿海地區(qū)的主要HV流行亞型，其危害和肆虐程度在近年來逐漸引起人們的重視。目前，無論是HFRS還是HPS都沒有有效的治療方法，僅有的針對(duì)HTNV或SEOV的全病毒滅活疫苗雖然已經(jīng)在國(guó)內(nèi)實(shí)施接種，但偶爾發(fā)病率還是會(huì)出現(xiàn)一定幅度的波動(dòng)(Tianetal.，2019)。所以及時(shí)發(fā)現(xiàn)并預(yù)防漢坦病毒的傳播就尤為重要，而我國(guó)流行的部分 HV 基因型或相關(guān)亞型尚缺乏快速診斷檢測(cè)方法，不能快速確定人群感染亞型并進(jìn)行病原體溯源，有待對(duì)此建立特異靈敏的檢測(cè)手段。

基因檢測(cè)被廣泛用于檢測(cè)病毒和其他病原微生物(Tomitaetal.，2008)，聚合酶鏈?zhǔn)阶鳛樽畛Ｓ玫臋z測(cè)手段，其復(fù)雜多樣的操作過程卻是一個(gè)不可忽視的缺點(diǎn)。隨著技術(shù)的發(fā)展，近些年已經(jīng)出現(xiàn)了一類成熟的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，不僅在實(shí)驗(yàn)操作和條件上的要求較低，其靈敏度和穩(wěn)定性也非常可靠。酶切探針等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Enzymatic Probe Isothermal Amplification，EPIA)是一種能夠在等溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增的新型分子生物學(xué)檢測(cè)方法，該方法依據(jù)靶序列設(shè)計(jì)特異性的等溫?cái)U(kuò)增引物和 rProbe 探針，其中 rProbe 兩端分別設(shè)計(jì)熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。利用 DNA 聚合酶的活性擴(kuò)增待測(cè)目標(biāo)核酸序列，同時(shí) rProbe 結(jié)合到相應(yīng)的待測(cè)目標(biāo)序列上，形成探針-目標(biāo)核酸雜交雙鏈，再通過 RNaseH 切割探針-目標(biāo)核酸雜交雙鏈中的 RNA 堿基，使得 RNA 堿基及其右側(cè)含有淬滅基團(tuán)的探針片段游離出去，而在 RNA 堿基左側(cè)的含有熒光基團(tuán)的片段仍然保持形成雜交鏈且可作為引物繼續(xù)延伸，同時(shí)熒光基團(tuán)發(fā)出熒光(圖1)。通過判斷擴(kuò)增信號(hào)來指示靶標(biāo)核酸的有無。它具有檢測(cè)效率高、操作簡(jiǎn)便、不依賴于復(fù)雜昂貴的PCR儀等設(shè)備的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，有望成為特異、靈敏的HV檢測(cè)技術(shù)。本文基于該技術(shù)原理，針對(duì)漢城病毒 S4 亞型的核酸保守S區(qū)域設(shè)計(jì)了特異性的等溫?cái)U(kuò)增引物和 rProbe 探針，用靶基因合成質(zhì)粒梯度稀釋對(duì)該方法進(jìn)行靈敏度和重復(fù)性驗(yàn)證，并用人源其他亞型HV進(jìn)行特異性驗(yàn)證。

圖1 EPIA擴(kuò)增原理(Tomita et al., 2008)Fig. 1 Principle of Enzymatic Probe Isothermal Amplification(Tomita et al., 2008)A: 起始結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生; B: 循環(huán)起始復(fù)合物形成; C: 循環(huán)擴(kuò)增階段。A: The creation of the starting structure; B: Cycle initiation complex formation; C: Cycle amplification stage.

1 材料與方法

1.1 樣本選擇及基因合成

采用實(shí)驗(yàn)室保存并完成測(cè)序的SEOV 80～39 的 S、M、L 三段序列作為研究的靶序列，另外從 GenBank 下載 SEOV S4 亞型不同毒株的3段序列，應(yīng)用生物學(xué)軟件分別進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn) S 段由于在3段中保守性最高且序列信息最全，因此選擇漢城 S4 亞型 S 基因作為本檢測(cè)體系的靶基因(GenBank：AY273791.1，位置：850～1 769 bp)。 臨床樣本的驗(yàn)證選用來自實(shí)驗(yàn)室保存的8例陽性病毒作為臨床樣本(表4)。

1.2 主要試劑

Bst X DNA聚合酶(TIANSeq Bst X DNA Polymerase)、dNTP Mixture(10 mmol/L)、RNA 酶(RNaseH)、甜菜堿溶液(PCR級(jí))(5 mmol/L Betaine Solution(PCR Grade))、逆轉(zhuǎn)錄酶(Hiscript II Reverse Transcriptase)和去離子水(deionized water)均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；0. 22 μm針頭濾器和1.5 μL 離心管購(gòu)自 Millipore 公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司；RNA 提取試劑盒(RNeasy RNA 純化試劑組-Mini，Cat no.74106)購(gòu)自QIAGEN公司。

1.3 樣本處理

將編碼 MS2 噬菌體相應(yīng)蛋白的 cDNA 序列連接到原核表達(dá)載體(PET-42a)啟動(dòng)子下游，成功構(gòu)建了表達(dá)載體 pNCCL(pET42-CP)，然后將漢城病毒 80～39 的 cDNA 序列構(gòu)建于表達(dá)載體中的 MS2 噬菌體包膜蛋白基因序列下游。取 50 μL 菌液加入到 5 mL 的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min，震蕩培養(yǎng)3 h到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，向其中加入 IPTG，使其終濃度為 1 mmol/L，37 ℃，200 r/min，孵育 3 h；收集細(xì)胞，加入 0.5 mL 超聲緩沖液，冰上超聲：350 W，停 5 s，超聲 5 s，30 個(gè)循環(huán)。隨即 6 000 r/min，離心 10 min，收集上清，得到假病毒溶液，使用 RNA 提取試劑盒提取具有耐 RNase 特性的內(nèi)含外源 RNA 序列的病毒樣顆粒，用于后續(xù)靶標(biāo)檢測(cè)的驗(yàn)證。

表1 酶切探針等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)使用的引物Tab.1 The primers used in the Enzymatic Probe Isothermal Amplification

表2 用以優(yōu)化篩選結(jié)果的外源內(nèi)參引物探針Tab.2 Exogenous internal reference primer probe to optimize screening results

1.4 引物設(shè)計(jì)與篩選

根據(jù)選定的漢坦病毒 S4 靶序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)8套引物，經(jīng)靈敏度與特異性驗(yàn)證，最終篩出3套引物(表 1)的靈敏度與特異性相較于其他引物具有更好的數(shù)值。并針對(duì)設(shè)計(jì)的3套引物體系設(shè)計(jì)4 條探針，經(jīng)靈敏度和特異性驗(yàn)證，篩選出探針SEOV-S4-S-RNHLB51(5’-GAAAGGAGGCAGTGGACAAC-3’)的靈敏度與特異性好于其他 3 條探針，其靈敏度可以達(dá)到 10 copies/μL，且無非特異擴(kuò)增。

1.5 實(shí)驗(yàn)體系的優(yōu)化

以實(shí)驗(yàn)室已有的外源內(nèi)參體系(表 2)做為體系內(nèi)參，通過內(nèi)參引物的校正作用進(jìn)行優(yōu)化篩選。由于本實(shí)驗(yàn)所用內(nèi)參為外源內(nèi)參，所以在樣本提取時(shí)需要向樣本中加入外源內(nèi)參的假病毒進(jìn)行共提取，最后提取濃度為 2 000 copies/mL 的 RNA，并取3條內(nèi)參引物(WNC-FIP/WNC-BIP/WNC-LB)及1條探針(WNC-RNHP)的形式組建二重檢測(cè)體系里的內(nèi)參擴(kuò)增(表 3)。利用熒光定量 PCR 儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，溫度經(jīng)過前期 EPIA 技術(shù)建立時(shí)在(60～65)℃之間的溫度優(yōu)化，確立了最優(yōu)溫度 63℃，反應(yīng)程序設(shè)置為 63℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)，收集熒光(FAM，CY5)，結(jié)果分析時(shí)根據(jù)其Ct值進(jìn)行判定。結(jié)果判定的規(guī)則：靶標(biāo)陽性：FAM 通道Ct≤ 38，CY5 通道無需參看；靶標(biāo)陰性：FAM通道Ct> 38，且 CY5 通道Ct< 40；檢測(cè)無效：FAM 通道Ct> 38 或者無擴(kuò)增信息，且 CY5 通道無擴(kuò)增信號(hào)，此種情況時(shí)，需要重新提取樣本，進(jìn)行復(fù)測(cè)。

表3 加入外源內(nèi)參組建形成的二重反應(yīng)液體系Tab.3 Double reaction liquid system formed by adding exogenous internal reference

1.6 靈敏度穩(wěn)定性檢測(cè)與特異性檢測(cè)

靈敏度穩(wěn)定性檢測(cè)：將檢測(cè)的靶基因進(jìn)行質(zhì)粒合成，提取質(zhì)粒，計(jì)算濃度后，將其梯度稀釋成10和 5 copies/μL，用體系檢測(cè)質(zhì)粒各梯度稀釋液，觀察其檢測(cè)結(jié)果并篩選優(yōu)化；特異性檢測(cè)：通過所建立的 EPIA 二重反應(yīng)液體系對(duì)人源、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、結(jié)核分枝桿菌、人源冠狀病毒(OC43、NL63、HKU1、229E)等物種與其他病原體的RNA核酸進(jìn)行特異性檢測(cè)，其中包括 6 株漢灘病毒和兩株其他相關(guān)病毒(表4)。

2 結(jié)果

2.1 EPIA檢測(cè)的靈敏度

提取靶基因構(gòu)建質(zhì)粒作為模板在 LOD 處進(jìn)行20次重復(fù)靈敏度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 63 ℃恒溫條件下，隨著時(shí)間的推移，其內(nèi)部反應(yīng)探針均在 35 min內(nèi)開始水解產(chǎn)生熒光，并隨時(shí)間推移強(qiáng)度逐步增加；在 10 copies/μL 下可穩(wěn)定擴(kuò)出結(jié)果。EPIA 技術(shù)為非線性擴(kuò)增，低限檢測(cè)時(shí)，擴(kuò)出Ct值范圍較大，20次最低檢測(cè)限的擴(kuò)增如圖3所示。

表4 八例陽性臨床病毒樣本信息Tab.4 Information on 8 positive clinical virus samples

圖2 假病毒20次重復(fù)靈敏度穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 Fake virus 20 repeated sensitivity and stability test results

圖3 特異性檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Specific test resultsa: 人源基因?qū)φ諜z測(cè)結(jié)果；b: 空白對(duì)照檢測(cè)結(jié)果；c: 8 例陽性臨床樣本檢測(cè)結(jié)果a: Human gene control results；b: Blank control result；c: Results of 8 positive clinical samples

2.2 EPIA檢測(cè)的特異性

利用人源基因組作為對(duì)照驗(yàn)證 EPIA 法的特異性，選取了等量的人源基因組作為模板進(jìn)行特異性檢驗(yàn)(圖3)，另外設(shè)立空白對(duì)照組，同時(shí)對(duì) 8 例陽性臨床樣本進(jìn)行臨床驗(yàn)證(圖4)，靶標(biāo)通道(FAM)均無擴(kuò)出。

圖4 陽性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Positive control test result

2.3 陽性質(zhì)控驗(yàn)證

將獲得的假病毒溶液梯度稀釋后，提取 RNA，選擇 Tt 值在 15～20 的假病毒稀釋度作為陽性質(zhì)控品中假病毒溶液的濃度。將假病毒溶液與內(nèi)參質(zhì)?；旌?，此混合溶液中假病毒溶液的終濃度需與上述的假病毒的稀釋度一致，此混合溶液中內(nèi)參質(zhì)粒的終濃度為 103copies/μL，則此混合溶液即為最終獲得陽性質(zhì)控。利用內(nèi)參引物建立二重檢測(cè)體系，以構(gòu)建的假病毒顆粒作為陽性質(zhì)控提取的 RNA 做為模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，靶標(biāo)通道擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，在 20 min左右的時(shí)間內(nèi)探針開始溶解產(chǎn)生熒光，經(jīng)過校正的陽性信號(hào)從 0 增至 0.42。

3 討論

基因診斷技術(shù)因其靈敏度和特異性高，在被發(fā)明后的數(shù)十年間迅速發(fā)展，已經(jīng)替代基于蛋白質(zhì)的技術(shù)，成為病原體診斷的主流檢測(cè)手段(Gaoetal.，2008)。核酸檢測(cè)不但能夠檢測(cè)微量的 DNA 或 RNA，而且可以對(duì)那些難以用標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)方法培養(yǎng)或確定的生物進(jìn)行有效且準(zhǔn)確的鑒定。相較于抗原和抗體的檢測(cè)，核酸檢測(cè)更具有能夠識(shí)別感染性生物的抗病毒抵抗力和基因組序列的優(yōu)勢(shì)，對(duì)生物領(lǐng)域和預(yù)防控制流行病方面都具有非常重要的意義。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)是目前使用最為廣泛的核酸擴(kuò)增技術(shù)，PCR 技術(shù)包括常規(guī) PCR、nPCR、qPCR 和多重 PCR(Ockeretal.，2016)，但這些方法需要使用 PCR 儀、 電泳儀等儀器，并且在實(shí)驗(yàn)過程中需要對(duì)溫度進(jìn)行升降調(diào)節(jié)，不夠便捷且成本高，難以在條件不充分的現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模快速應(yīng)用，這也是目前普通 PCR 技術(shù)所無法逾越的局限性。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的沉淀和發(fā)展，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Isothermal amplification technology)是一種可在恒定溫度下，通過一些特殊的酶使 DNA 雙鏈解旋，并促使特異性 DNA 片段擴(kuò)增，以達(dá)到核酸體外擴(kuò)增效果的技術(shù)。該技術(shù)消除了對(duì)熱循環(huán)儀的需求，從而簡(jiǎn)化和加快了診斷過程(Huangetal.，2020)，對(duì)于核酸的檢測(cè)具有相當(dāng)高的靈敏度。各種分支技術(shù)包括依賴核酸序列擴(kuò)增(NASBA)、依賴解旋酶擴(kuò)增(HDA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和近年來較為新穎且更具優(yōu)勢(shì)的 RPA 、 RAA等，其中環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在近些年已經(jīng)應(yīng)用于病毒、細(xì)菌和瘧疾等病原體檢測(cè)(Subsoontornetal.，2020)。

中國(guó)是漢坦病毒流行的重要疫區(qū)，在東南沿海廣泛流行的漢城病毒 S4 亞型更是依靠著其地理環(huán)境條件的優(yōu)越性不斷肆虐，由于沿海地區(qū)港口發(fā)達(dá)、社會(huì)發(fā)展迅速和老鼠、蝙蝠等宿主的繁殖擴(kuò)張，病毒的傳播風(fēng)險(xiǎn)也大大增加，其潛在的威脅值得我們?nèi)リP(guān)注。本研究利用酶切等溫探針檢測(cè)技術(shù)的原理，選取了漢城病毒 S4 亞型中序列信息較為保守的 S 片段建立了一種快速檢測(cè)漢城病毒 S4 亞型的方法，該方法的靈敏度可達(dá)到 10 copies/μL，相較于普通的 PCR 方法其檢測(cè)極限要高 100 倍，同時(shí)擴(kuò)增穩(wěn)定且具有反應(yīng)速度快、條件簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。EPIA 技術(shù)的本質(zhì)是酶促反應(yīng)，通過酶的作用來推動(dòng)多重 PCR 中模板鏈的反復(fù)擴(kuò)增。而這個(gè)方法與 LAMP 技術(shù)相類似，由于特殊的設(shè)計(jì)思路，其實(shí)驗(yàn)體系的一套引物中含有多對(duì)引物，分別對(duì)應(yīng)不同的區(qū)域，所以當(dāng)任一對(duì)引物與靶標(biāo)模板不匹配時(shí)，反應(yīng)就無法順利進(jìn)行。而且，反應(yīng)中的環(huán)境和操作等相關(guān)因素也會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，為了減少誤差并校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，避免不必要的假陽性，本研究通過加入外源內(nèi)參引物調(diào)整并降低不同因素所帶來的影響，進(jìn)行二重檢測(cè)體系的優(yōu)化篩選很好的解決了這一問題。

本研究進(jìn)行了靈敏度穩(wěn)定性的檢測(cè)，并對(duì)人源基因和8 例陽性臨床樣本進(jìn)行了特異性驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果除陽性對(duì)照外靶標(biāo)通道(FAM)均無特異性擴(kuò)出(圖3)，表明本體系無人源非特異擴(kuò)出，排除了本設(shè)計(jì)與人源基因組的交叉反應(yīng)。臨床樣本中包含了漢灘病毒和其他相關(guān)病毒，進(jìn)一步表明了該方法檢測(cè)的特異性，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，符合實(shí)際情況。

本研究證實(shí)了 EPIA 法是一個(gè)簡(jiǎn)便高效的針對(duì)漢城病毒 S4 亞型進(jìn)行的檢測(cè)方法。通過科學(xué)地探針設(shè)計(jì)，本技術(shù)還可推廣應(yīng)用至生物傳感器、免疫層析膠體金等多種技術(shù)領(lǐng)域(Gaoetal.，2008)，使該方法在分子生物學(xué)中得到更廣泛的應(yīng)用。