柳佳佳，朱效鵬，滕佳，趙建民，李成華，單恩翠，張晨，王清

（1.寧波大學(xué)，浙江 寧波 315211；2.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 海岸帶生物資源高效利用研究與發(fā)展中心，山東 煙臺(tái) 264003；3.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗(yàn)站，山東 煙臺(tái) 264117；4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

塑料制品由于輕便、耐用和價(jià)廉等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)及日常生活中。2019 年，全球塑料產(chǎn)量達(dá)到3.7 億噸（Plastics Europe，2020）。每年塑料產(chǎn)量的50%用于制作一次性塑料產(chǎn)品，預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生大量的塑料垃圾（Plastics Europe，2020）。據(jù)估計(jì)，每年約有480 萬(wàn)～1 270 萬(wàn)噸塑料垃圾進(jìn)入海洋（Jambeck et al，2015）。目前世界大部分海域的水體、沉積物以及海洋生物體內(nèi)均已檢測(cè)到微塑料（冉文 等，2018；Farrell et al，2013；Cincinelli et al，2017；Smith et al，2018；He et al，2021；Russell et al，2021）。越來(lái)越多的研究證實(shí)了微塑料對(duì)海洋動(dòng)物的多種毒性效應(yīng)，包括能量?jī)?chǔ)備減少、攝食能力受抑制、炎癥反應(yīng)和代謝紊亂等（Van Cauwenberghe et al，2012；Von Moos et al，2012；Lu et al，2016；Watts et al，2016；Cole et al，2019）。富集在生物體內(nèi)的微塑料能夠沿食物鏈進(jìn)行傳遞，危害生態(tài)系統(tǒng)，甚至對(duì)人類健康產(chǎn)生負(fù)面影響（Farrell et al，2013）。微塑料還會(huì)從環(huán)境中吸附重金屬和有機(jī)污染物，從而成為有毒有害化學(xué)物質(zhì)的載體（Browne et al，2013）。因此，微塑料已成為海洋環(huán)境中廣泛存在的一類污染物，引起了世界各國(guó)特別是沿海國(guó)家的高度重視。

多環(huán)芳烴類化合物（PAHs）因其具有生物蓄積性、高毒性、長(zhǎng)期殘留性、半揮發(fā)性和可長(zhǎng)距離運(yùn)輸性在國(guó)際上備受關(guān)注。PAHs 主要來(lái)源包括森林火災(zāi)、石油泄漏以及礦物燃料等的不完全燃燒（Sun et al，2012）。近年來(lái)，研究人員在海水、河流、沉積物和海洋生物體中均已檢測(cè)到PAHs 的存在（Zhi et al，2015；Nemr et al，2016；Jafarabadi et al，2017；Wang et al，2019；Liu et al，2021；Pichler et al，2021；Yuan et al，2021）。海洋環(huán)境中的PAHs 主要通過(guò)海洋生物的攝食以及皮膚滲透等途徑進(jìn)入生物體中，其對(duì)海洋生物構(gòu)成的威脅不容忽視（Collier et al，2013；Pulster et al，2021）。例如，苯并（a）芘（BaP）能通過(guò)激活MAPKs 從而抑制櫛孔扇貝（Chlamys farreri） 血細(xì)胞的免疫防御能力（劉靜，2009）。Wessel 等（2007）調(diào)查發(fā)現(xiàn)，BaP、琢-乙炔基雌二醇和硫丹暴露對(duì)長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）具有胚胎發(fā)育毒性和遺傳毒性，且胚胎畸形率和DNA 損傷水平具有明顯的相關(guān)性。

PAHs 具有較高的親脂性，與水相比，微塑料的疏水表面使其更容易濃縮PAHs，并且二者對(duì)生物的脅迫作用可能會(huì)相互影響（Teuten et al，2009；Gouin et al，2011；Koelmans et al，2016）。研究表明，小眼長(zhǎng)臂鰕虎魚（Pomatoschistus microps）暴露于吸附芘的微塑料96 h，其代謝酶活力被抑制，免疫力下降（Oliveira et al，2013）。當(dāng)貽貝（Mytilus spp.）暴露于聚苯乙烯中（含或不含熒蒽）時(shí)，聯(lián)合暴露組貽貝組織病理學(xué)損傷和抗氧化標(biāo)記物水平最高（Paul-Pont et al，2016）。研究表明，與單獨(dú)暴露于微塑料的斑馬魚（Danio rerio）相比，多氯聯(lián)苯、溴化阻燃劑和甲基汞等污染物共存會(huì)導(dǎo)致斑馬魚肝和腦中的生物標(biāo)志物基因過(guò)表達(dá)，器官穩(wěn)態(tài)顯著改變（Rainieri et al，2018）。Tang 等（2020）發(fā)現(xiàn)微塑料的存在提高了雙酚A 對(duì)泥蚶（Tegillarca granosa）的免疫毒性和神經(jīng)毒性。由此可見(jiàn)，微塑料和PAHs 聯(lián)合作用可能會(huì)對(duì)海洋生物產(chǎn)生更大的毒性效應(yīng)，因此，亟待開(kāi)展微塑料與PAHs 的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究。

菲律賓蛤仔是沿海灘涂重要的經(jīng)濟(jì)貝類，在生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用。菲律賓蛤仔是濾食動(dòng)物，生命周期長(zhǎng)，對(duì)鹽度和溫度的高波動(dòng)具有耐受性，對(duì)污染物具有高蓄積能力，符合作為生物指示物 種的 標(biāo) 準(zhǔn)（Tanguy et al，2008；Sacchi et al，2013）。有研究報(bào)道，菲律賓蛤仔能從其生活環(huán)境中攝取并積累大量的微塑料（Davidson et al，2016；Cho et al，2019）。但迄今為止，關(guān)于微塑料的毒性研究大多集中于牡蠣和貽貝（Von Moos et al，2012；Avio et al，2015；Sussarellu et al，2016；Ribeiro et al，2017；Teng et al，2021）。因此，在本研究中，我們探討了兩種不同粒徑聚苯乙烯微球和芘單一及聯(lián)合暴露（21 d）對(duì)菲律賓蛤仔的毒性效應(yīng)，在個(gè)體（如肥滿度和攝食率）、組織（如氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化水平）和細(xì)胞（如血淋巴免疫調(diào)節(jié)）水平探討兩種污染物對(duì)菲律賓蛤仔的毒性效應(yīng)。同時(shí)，運(yùn)用綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)法（IBR）評(píng)價(jià)了微塑料和芘對(duì)菲律賓蛤仔的毒性作用，以期為微塑料和有機(jī)污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及國(guó)家制定相關(guān)應(yīng)對(duì)策略與政策提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在山東省煙臺(tái)沿海（36毅16憶N—38毅23憶N，119毅34憶E—121毅57憶E） 采集了1200 只殼形完整、大小相近的野生菲律賓蛤仔（殼長(zhǎng)3.5依1.0 cm，殼高2.6 依0.8 cm，n= 30），在實(shí)驗(yàn)室用過(guò)濾海水洗凈。菲律賓蛤仔置于玻璃罐（60 cm伊60 cm伊100 cm）中，暫養(yǎng)14 d。在暫養(yǎng)期內(nèi)，每天更新所有海水并連續(xù)充氣，投喂螺旋藻溶液，濃度為4.3 伊107cells/mL。每天使用YSI 設(shè)備（YSI 型號(hào)85，Yellow Springs，OH，USA）測(cè)定所有玻璃缸中的水質(zhì)參數(shù)，水溫為19.6 依0.3 益，pH 為8.1 依0.1，鹽度為31.8 依0.4。

聚苯乙烯微球原料分散體是乳濁液（2.5%w/v，10 mL），含有0.05%的NaN3，購(gòu)自天津倍思樂(lè)中心，通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）（S-4800，Hitachi）檢查聚苯乙烯的尺寸和形貌（圖1）。其直徑為0.34 依0.008 滋m 和6.34 依0.087 滋m。芘（CAS：129-00-0）購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司，由于芘在水中的溶解度低，因此，在二甲亞砜（DMSO，MP Biomedicals，USA）中制備芘的儲(chǔ)備溶液。各芘處理組的溶劑DMSO 濃度均保持在0.001%，預(yù)計(jì)該濃度不會(huì)對(duì)菲律賓蛤仔產(chǎn)生不利影響（Venier et al，1997；Zhang et al，2019）。已有研究表明，吸附BaP的聚苯乙烯暴露對(duì)紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）的毒性要高于單獨(dú)聚苯乙烯暴露；與大尺寸聚苯乙烯（4.5 滋m）相比，小尺寸聚苯乙烯（0.5 滋m）對(duì)紫貽貝具有更高的毒性（Gonz佗lez-Soto et al，2019）。因此，為探討不同尺寸微塑料對(duì)菲律賓蛤仔的毒性效應(yīng)及差異，本研究選擇微米級(jí)（6 滋m）和納米級(jí)（0.3 滋m）兩種尺寸聚苯乙烯微塑料開(kāi)展暴露試驗(yàn)。

圖1 掃描電子顯微鏡（SEM）表征聚苯乙烯微塑料

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)單一暴露處理組，包括兩種尺寸的聚苯乙烯（0.3滋m（SMPs）和6滋m（BMPs））和兩個(gè)濃度的芘溶液（10 滋g/L（L-pyrene）和100 滋g/L（H-pyrene））。在單一暴露組的基礎(chǔ)上設(shè)置2 伊2 雙因素設(shè)計(jì)，共計(jì)4 個(gè)聯(lián)合暴露處理組（SMPs+Lpyrene、SMPs+H-pyrene、BMPs+L-pyrene、BMPs+H-pyrene）。同時(shí)設(shè)置潔凈海水和溶劑（DMSO）對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的芘暴露濃度10 滋g/L 為環(huán)境相關(guān)濃度（Zhang et al，2019），高濃度100 滋g/L是為了探究芘對(duì)貝類的毒性效應(yīng)，并且已有室內(nèi)研究報(bào)道了類似濃度會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生毒性效應(yīng)（Tang et al，2020）。微塑料暴露濃度設(shè)置為20 滋g/L，該濃度高于現(xiàn)實(shí)環(huán)境濃度，但預(yù)測(cè)未來(lái)在部分海域可能會(huì)出現(xiàn)（Everaert et al，2018），相關(guān)研究也表明類似暴露濃度會(huì)對(duì)一些海洋生物產(chǎn)生毒性效應(yīng)（Oliveira et al，2013；Skdokur et al，2020）。

微塑料的原液懸浮液在去離子水中配制，濃度為0.25 g/L 并在使用前進(jìn)行超聲波處理。芘溶液采用DMSO 配制成質(zhì)量為10 mg/L 的母液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用過(guò)濾海水進(jìn)行稀釋。每個(gè)玻璃缸養(yǎng)殖60 只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（100 L）。實(shí)驗(yàn)期間養(yǎng)殖條件與適應(yīng)期一致，每天定時(shí)投餌，更換海水，換水后重新添加芘和微塑料至設(shè)定濃度。每天重投暴露介質(zhì)后2 h 內(nèi)不投喂螺旋藻，以避免藻類與塑料顆粒之間發(fā)生相互作用（Teng et al，2021；Wang et al，2021）。此外，注意調(diào)節(jié)氣石的位置和曝氣強(qiáng)度，使暴露介質(zhì)和餌料在海水中分布相對(duì)均勻。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

各暴露組隨機(jī)選取8 只菲律賓蛤仔，解剖后將殼和全部軟組織置于60 益烘箱烘至恒重。計(jì)算樣品干肉重與干殼重的比例（FW/SW 伊100%）來(lái)獲得菲律賓蛤仔的肥滿度指數(shù)（Condition Index，CI）。

根據(jù)Coughlan（1969）之前所述的方法測(cè)定攝食率（Clearance Rate，CR）。每組20 只菲律賓蛤仔轉(zhuǎn)移到100 L 海水的玻璃缸暫養(yǎng)1 h，然后加入初始濃度為4.3 伊107cells/mL 的螺旋藻液。期間連續(xù)充氣，使藻液在海水中分布相對(duì)均勻。測(cè)定開(kāi)始時(shí)，在玻璃缸中取20 mL 水樣進(jìn)行分析，隨后分別在30 min、60 min、90 min 和120 min 采集水樣。使用數(shù)字流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（VS-IV，F(xiàn)luid Imaging Technology，USA） 測(cè)定藻類細(xì)胞濃度。CR 通過(guò)以下公式計(jì)算：

CR=V 伊（lnC0-lnCt）/N 伊t

其中，CR 是攝食率（L/h），災(zāi)是測(cè)試容器中海水的體積（蘊(yùn)），C0是初始藻細(xì)胞濃度（cells/mL），Ct是賊時(shí)間后藻細(xì)胞濃度（cells/mL），暈為容器中菲律賓蛤仔數(shù)量，賊是實(shí)驗(yàn)時(shí)間（h）。

1.4 血細(xì)胞免疫指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用無(wú)菌注射器抽取1.5 mL 血淋巴細(xì)胞，用雙層300 目篩絹過(guò)濾到Eppendorf 離心管，迅速與等體積預(yù)冷的抗凝劑混合，以防止血細(xì)胞聚集。各組樣品分裝兩份，分別用于菲律賓蛤仔血淋巴細(xì)胞凋亡率和吞噬活性的測(cè)定。利用臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5804R，Eppendorf，Germany） 進(jìn)行預(yù)處理。將分裝好的血淋巴在2000 g 條件下離心10 min，棄去上清，加入1 mL PBS 緩沖液重懸血淋巴，重復(fù)重懸一次。加入各指標(biāo)相應(yīng)的緩沖液來(lái)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

血淋巴細(xì)胞凋亡率測(cè)定方法簡(jiǎn)述如下：使用500 滋L 緩沖液重懸血淋巴細(xì)胞。按照試劑盒（Annexin V-FITC/PI，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明，先加入5 滋L Annexin V-FITC，18 益避光孵育5 min，再加入5 滋L PI，18益避光孵育5 min。對(duì)經(jīng)過(guò)上述處理后的樣品用流式細(xì)胞儀（FACSAriaTM，Becton，Dickinson and Company）進(jìn)行分析（FL-1 通道檢測(cè)Annexin V-FITC 綠色熒光，F(xiàn)L-2 通道檢測(cè)PI 紅色熒光）。各樣品中血淋巴細(xì)胞凋亡率的結(jié)果用FITC 陽(yáng)性和PI 陰性細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)目的百分比來(lái)表示。

血淋巴細(xì)胞吞噬活性測(cè)定方法簡(jiǎn)述如下：用500 滋L PBS 重懸血細(xì)胞，加入PBS 稀釋成2.3%的熒光微球（YG 2.0 微米，Polysciences，Germany），使其終濃度為0.3%，18 益避光孵育1 h 后加入400 滋L 6%的福爾馬林溶液中止反應(yīng)，并用流式細(xì)胞儀分析（微球綠色熒光用FL-1 通道檢測(cè)）。血細(xì)胞吞噬活性用吞噬3 個(gè)或3 個(gè)以上微球的血細(xì)胞數(shù)目占血細(xì)胞總數(shù)的百分比來(lái)表示。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

暴露結(jié)束后，分別稱取菲律賓蛤仔的消化腺和鰓組織各0.1 g 左右。按照1 頤10（w/v）的比例加入勻漿介質(zhì)。使用IKA 勻漿機(jī)（T10 Ultra Turrax basic，IKA，Germany）完全均質(zhì)化（6000 r/min 勻漿4 次，每次20 s）。待勻漿液冷卻后，在4 益，10 000 g 下離心15 min，收集上清液即為10%組織勻漿。菲律賓蛤仔組織內(nèi)丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒中描述的方法進(jìn)行測(cè)定。組織總蛋白濃度采用BCA 法測(cè)定，參照碧云天生物公司相關(guān)試劑盒進(jìn)行，單位為mg/L?？寡趸富钚缘幕盍挝粸閁/mg 蛋白。脂質(zhì)過(guò)氧化水平以組織內(nèi)的MDA 含量表示，單位為nmol MDA/mg 蛋白。

1.6 綜合生物標(biāo)志物分析

為了將鰓和消化腺組織所有測(cè)量到的生物標(biāo)志物反應(yīng)整合到一個(gè)通用的“應(yīng)激指標(biāo)”中，按照Sanchez 等（2013）建立的綜合生物標(biāo)志物分析法（Integrated Biomarker Response，IBR），評(píng)價(jià)微塑料和芘單一及聯(lián)合暴露對(duì)菲律賓蛤仔的毒性效應(yīng)。該方法根據(jù)Belieff 等（2002）介紹的IBR 指數(shù)法基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果顯示為平均值依標(biāo)準(zhǔn)偏差。分別使用Shapiro-Wilk 和Levene 檢驗(yàn)對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差的正態(tài)性和齊性檢驗(yàn)。使用單因素方差分析（ANOVA）評(píng)估所有暴露組中生物學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)方差的正態(tài)性和齊性不滿足時(shí)，使用非參數(shù)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)和Mann-Whitney U 檢驗(yàn)來(lái)分析數(shù)據(jù)。顯著性水平設(shè)定為0.05。使用SPSS 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 研究結(jié)果

2.1 生理指標(biāo)

研究發(fā)現(xiàn)，除了聯(lián)合暴露組（SMPs+H-pyrene）外，其余暴露組菲律賓蛤仔的CI 與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異，并且SMPs+H-pyrene 暴露組菲律賓蛤仔的CI 顯著高于H-pyrene 暴露組（p <0.05）。單一微塑料暴露組CR 顯著低于對(duì)照組（p <0.05），但與聯(lián)合暴露組相比沒(méi)有顯著差異。聯(lián)合暴露組CR 低于單一芘暴露組，說(shuō)明微塑料的存在增加了芘的毒性效應(yīng)（圖2）。

圖2 微塑料和芘暴露對(duì)菲律賓蛤仔生理指標(biāo)（a：肥滿度；b：攝食率）的影響

2.2 免疫指標(biāo)

微塑料和芘暴露后，菲律賓蛤仔血細(xì)胞免疫指標(biāo)結(jié)果如圖3 所示。各暴露組血細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，其中，在SMPs 和高濃度芘存在的條件下，血細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組水平顯著增加了6.93%（p <0.05），并且二者聯(lián)合暴露組血細(xì)胞凋亡率最高。在單一芘暴露組，細(xì)胞凋亡率隨芘劑量的增加從10.94%增加到14.45%。對(duì)血細(xì)胞吞噬活性而言，各暴露組吞噬活性均低于對(duì)照組，其中，除BMPs 暴露組外，其他各暴露組較對(duì)照組水平均有顯著變化（p <0.05）。

圖3 微塑料和芘暴露對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)（a：細(xì)胞凋亡率；b：細(xì)胞吞噬活性）的影響

2.3 抗氧化反應(yīng)

微塑料和芘單一及聯(lián)合暴露對(duì)菲律賓蛤仔鰓和消化腺組織抗氧化酶和脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響如圖4所示。SMPs 和SMPs+H-pyrene 暴露組菲律賓蛤仔鰓組織MDA 含量較對(duì)照組水平分別顯著增加0.37和0.44 mmol/mg 蛋白（p <0.05）；SMPs 暴露組鰓組織MDA 含量較BMPs 組含量增加0.32 mmol/mg蛋白（p <0.05）；SMPs 和兩種濃度芘聯(lián)合暴露組菲律賓蛤仔消化腺組織MDA 含量較對(duì)照組水平分別顯著增加0.61 和0.57 mmol/mg 蛋白（p <0.05）。SMPs 和微塑料+L-pyrene 暴露組菲律賓蛤仔鰓組織CAT 活性顯著高于對(duì)照組（p <0.05）；在消化腺組織中，單一芘暴露組的CAT 活性顯著高于對(duì)照組（p < 0.05） 且聯(lián)合暴露組的CAT 活性低于單一暴露組。菲律賓蛤仔鰓組織SOD 活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；微塑料+H-pyrene 聯(lián)合暴露組的消化腺SOD 活性較對(duì)照組顯著降低12.17 U/mg 蛋白和9.59 U/mg 蛋白（p <0.05）。聯(lián)合暴露組和H-pyrene 單一暴露組鰓組織GST 活性均顯著低于對(duì)照組（p <0.05）；在消化腺組織中，聯(lián)合暴露組和單一芘暴露組GST 活性顯著高于對(duì)照組（p<0.05）。

圖4 微塑料和芘暴露對(duì)菲律賓蛤仔鰓和消化腺中的抗氧化酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響

2.4 綜合生物標(biāo)志物指數(shù)

采用綜合生物標(biāo)志物指數(shù)法，對(duì)菲律賓蛤仔鰓和消化腺組織的抗氧化酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化水平生物標(biāo)志物的響應(yīng)值進(jìn)行分析。結(jié)果如圖5 所示，在鰓組織中，聯(lián)合暴露組和單一芘暴露組的GST 活性變化幅度最大，微塑料單一暴露組的MDA 含量變化幅度最大。而在消化腺組織中，聯(lián)合暴露組和微塑料單一暴露組的MDA 含量變化幅度最大，低濃度芘單一暴露組的CAT 活性變化幅度最大，高濃度芘單一暴露組中的GST 活性變化幅度最大。所有暴露組的IBR 值較對(duì)照組水平均有所升高，其中SMPs 單一暴露組最高。微塑料和芘聯(lián)合暴露能夠引起比單一壓力源（芘和BMPs）更高的IBR值。根據(jù)IBR 值計(jì)算結(jié)果，微塑料和芘對(duì)消化腺組織的總體影響高于鰓組織。

圖5 微塑料和芘暴露后菲律賓蛤仔生物標(biāo)志物星狀圖和綜合生物標(biāo)記物響應(yīng)指數(shù)

3 討論

3.1 生理指標(biāo)

肥滿度指數(shù)（CI）作為生物體健康狀況的指標(biāo)，可以直接用于評(píng)估環(huán)境壓力（Tejeda-Vera et al，2007；Luna-Acosta et al，2017）。在本研究中，除了高濃度芘暴露組，其余暴露組菲律賓蛤仔CI與對(duì)照組相比都沒(méi)有顯著差異。同樣，Gonz佗lez-Soto 等（2019）發(fā)現(xiàn)暴露于聚苯乙烯和BaP（7 d和26 d）的貽貝（M.galloprovincialis）CI 與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異。此外，蛤類（Scrobicularia plana）暴露于1 mg/L 粒徑為20 滋m 的聚苯乙烯14 d，其CI 也沒(méi)有發(fā)生顯著變化（Ribeiro et al，2017）。聯(lián)合暴露組（SMPs+H-pyrene）菲律賓蛤仔CI 顯著高于H-pyrene 暴露組，說(shuō)明芘對(duì)菲律賓蛤仔CI 的影響大于微塑料。如圖2（b）所示，SMPs+H-pyrene暴露組CR 低于H-pyrene 暴露組，這可能是由于復(fù)合暴露組菲律賓蛤仔攝入吸附芘的微塑料較少，從而導(dǎo)致其CI 高于H-pyrene 暴露組。

微塑料單一或聯(lián)合暴露都顯著抑制了菲律賓蛤仔的攝食率（CR）。前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著聚氯乙烯微塑料暴露濃度的增加，貽貝（Mytilus edulis）的CR 降低（Rist et al，2016）。雙殼類有較強(qiáng)的濾水能力，因此，其鰓組織易受到海水中污染物的影響。一方面，雙殼類會(huì)根據(jù)環(huán)境中食物顆粒的數(shù)量和水質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)瓣膜的開(kāi)度，CR 的大幅度降低可能是因?yàn)槲⑺芰项w粒引起菲律賓蛤仔鰓瓣膜關(guān)閉；另一方面，微塑料可能通過(guò)損傷上皮細(xì)胞或引起堵塞而對(duì)生物造成潛在的傷害，從而導(dǎo)致CR 被抑制（Bacon et al，1998）。本研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合暴露組菲律賓蛤仔的CR 低于單一暴露組，表明微塑料和苯并芘聯(lián)合脅迫效應(yīng)更為明顯。有研究表明，比起單獨(dú)暴露于微塑料和鉻，兩種污染物聯(lián)合暴露下，小眼長(zhǎng)臀鰕虎（Pomatoschistus microps）幼魚捕食性能顯著下降（Lu侏s et al，2015）。Green 等（2017）發(fā)現(xiàn)暴露于25 滋g/L 的聚乳酸或高密度聚乙烯微塑料的貽貝（M. edulis） CR 下降，但牡蠣（Ostrea edulis）的CR 增加。不同的暴露時(shí)間、微塑料和污染物類型以及生物生活方式可能會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果的差異。因此，需要開(kāi)展更多的研究，以確定相關(guān)的研究結(jié)果是否在雙殼類動(dòng)物中普遍適用。

3.2 血淋巴免疫指標(biāo)

在本研究中，微塑料和芘單獨(dú)或聯(lián)合暴露均能誘導(dǎo)菲律賓蛤仔血細(xì)胞凋亡率的增加，并且聯(lián)合暴露組血細(xì)胞凋亡率高于單一暴露組，表明聯(lián)合暴露下菲律賓蛤仔免疫系統(tǒng)受到的損害更為嚴(yán)重。與本研究結(jié)果類似，經(jīng)聚苯乙烯微塑料和多溴聯(lián)苯醚暴露后，櫛孔扇貝（Chlamys farreri）血細(xì)胞細(xì)胞凋亡率增加，并且微塑料會(huì)增強(qiáng)多溴聯(lián)苯醚對(duì)櫛孔扇貝（C.farreri）的免疫毒性（滕瑤，2018）。Sendra 等（2020）研究聚苯乙烯對(duì)紫貽貝（M.galloprovincialis）不同血細(xì)胞亞群的免疫毒性，發(fā)現(xiàn)微塑料暴露導(dǎo)致凋亡信號(hào)增加以及吞噬活性降低。本研究結(jié)果顯示，SMPs 暴露組細(xì)胞凋亡率高于BMPs 暴露組。Browne 等（2008）研究發(fā)現(xiàn)小于9.6 滋m 的聚苯乙烯顆粒可從貽貝（M.edulis）腸道轉(zhuǎn)移到血細(xì)胞內(nèi)；顆粒大小影響聚苯乙烯的轉(zhuǎn)移能力，在體腔液中，較小的（3.0 滋m）顆粒比較大的（9.6 滋m）顆粒多60%。因此，SMPs 暴露組細(xì)胞凋亡率增加可能是小粒徑（0.3 滋m）微塑料在血細(xì)胞大量積累所致。

在貝類免疫反應(yīng)中，吞噬作用是貝類血細(xì)胞的主要防御手段，當(dāng)異物和病原體入侵機(jī)體的時(shí)候，血細(xì)胞主要通過(guò)吞噬過(guò)程清除外來(lái)物（吳芳麗等，2016）。微塑料和芘單獨(dú)或聯(lián)合暴露對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞的吞噬活性有抑制作用，與相應(yīng)劑量的微塑料和芘單獨(dú)暴露相比，聯(lián)合暴露可降低菲律賓蛤仔的吞噬活性，說(shuō)明這兩種污染物對(duì)菲律賓蛤仔具有明顯的免疫毒性。聚苯乙烯被證實(shí)會(huì)影響紫貽貝（M. galloprovincialis） 血細(xì)胞溶酶體膜的穩(wěn)定性（Canesi et al，2015），從而抑制吞噬作用（Sun et al，2017；Su et al，2018）。李佳娜（2019） 發(fā)現(xiàn)微塑料暴露組血細(xì)胞吞噬活性都低于對(duì)照組，但沒(méi)有顯著性差異，僅有雌二醇和微塑料聯(lián)合暴露組血細(xì)胞吞噬活性顯著低于對(duì)照組，預(yù)示著兩種污染物的聯(lián)合暴露會(huì)導(dǎo)致毒性增強(qiáng)。Tang 等（2020） 也發(fā)現(xiàn)暴露于微塑料和雙酚A 的泥蚶（T. granosa）體內(nèi)血細(xì)胞總數(shù)減少，顆粒細(xì)胞比例下降并且細(xì)胞類型組成改變。顆粒細(xì)胞是最具吞噬活性的血細(xì)胞（Liu et al，2016），因此，聯(lián)合暴露組泥蚶血細(xì)胞吞噬活性被顯著抑制。前期研究也表明，雙殼貝類暴露于污染物（如微塑料）可能會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞數(shù)量減少（Von Moos et al，2012；Tang et al，2020）。本研究中菲律賓蛤仔血細(xì)胞凋亡率的增加可能會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞數(shù)量的降低，具有吞噬功能的細(xì)胞數(shù)量降低可能會(huì)引起血細(xì)胞吞噬率降低。因此，暴露組菲律賓蛤仔血細(xì)胞凋亡率升高可能是吞噬活性降低的原因之一。濃度也是污染物對(duì)生物體產(chǎn)生毒性效應(yīng)的重要影響因素。在芘單獨(dú)暴露組中，血細(xì)胞吞噬活性隨芘劑量的增加而降低，表明芘可能以劑量依賴的方式引起血細(xì)胞免疫反應(yīng)的變化。Croxton 等（2012）研究發(fā)現(xiàn)5 滋g/L 芘和BaP 均能輕微誘導(dǎo)牡蠣（Crassostrea virginica）血細(xì)胞的吞噬活性增加，但隨著濃度的增加，吞噬活性降低。貽貝（M.edulis）暴露于PAHs 濃度為500 滋g/L 的餌料兩周后，其血細(xì)胞吞噬能力顯著降低（Grundy et al，1996）。

3.3 抗氧化酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化水平

當(dāng)機(jī)體受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，通常會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（ROS）。ROS 的過(guò)量產(chǎn)生能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)、DNA 和膜脂質(zhì)發(fā)生氧化損傷，并伴隨著脂質(zhì)過(guò)氧化程度加?。℉emnani et al，1998；Winterbourn et al，2008；Lushchak et al，2011）。生物體內(nèi)存在復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)，主要包括酶類抗氧化劑（SOD、CAT、GST 等）和低分子量的活性氧清除分子，以保護(hù)機(jī)體免受活性氧的損傷。因此，測(cè)定清除ROS 的抗氧化酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化水平，可以評(píng)估生物體受到氧化脅迫的程度（Hu et al，2015；Velez et al，2016；Zhang et al，2016；Coppola et al，2017）。

MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，生物體內(nèi)的MDA 含量可以反映海洋生物體內(nèi)氧化損傷程度（Damiens et al， 2007； Tomanek et al， 2011；Ferreira et al，2019）。在本研究中，所有脅迫暴露組的MDA 含量均高于對(duì)照組水平。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因是生物體的抗氧化防御機(jī)制不足以保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激脅迫，從而導(dǎo)致了機(jī)體產(chǎn)生更高水平的脂質(zhì)過(guò)氧化。研究表明，微塑料和污染物均能導(dǎo)致海洋生物體內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化損傷（Vlahogianni et al，2007；于慶云 等，2013；Yu et al，2018）。本研究中SMPs 暴露組鰓組織MDA 含量顯著高于BMPs 暴露組，表明小粒徑微塑料對(duì)菲律賓蛤仔的氧化損傷程度大于大粒徑微塑料，這可能是由于小粒徑微塑料更容易在生物組織內(nèi)富集所導(dǎo)致（Deng et al，2017；Hariharan et al，2021；Wright et al，2013）。除了SMPs 暴露組，鰓組織的BMPs 和芘聯(lián)合暴露組MDA 含量均高于單一暴露組。Sheng等（2021）研究也發(fā)現(xiàn)，暴露于微塑料和三氯生的斑馬魚體內(nèi)也檢測(cè)到脂質(zhì)過(guò)氧化，并且二者對(duì)肝臟MDA 含量的聯(lián)合作用表現(xiàn)為相加效應(yīng)。

通常情況下，SOD 和CAT 是抗氧化防御系統(tǒng)的第一條防線，用以清除生物體內(nèi)因污染脅迫產(chǎn)生的ROS（Miller et al，2008）。SOD 可以催化超氧自由基（·O2-） 轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫（H2O2） 和分子氧（O2），然后CAT 可以催化H2O2分解產(chǎn)生氧氣（O2）和水（H2O） （Lesser et al，2006）。GST 具有清除體內(nèi)自由基及解毒的雙重功能，能夠催化谷胱甘肽與進(jìn)入體內(nèi)的外源性物質(zhì)相結(jié)合，最終促使這類物質(zhì)排出生物體（Sheehan et al，2001）。微塑料和芘暴露對(duì)菲律賓蛤仔體內(nèi)不同抗氧化酶的影響具有一定差異性。在鰓組織中，微塑料單獨(dú)或和芘聯(lián)合暴露導(dǎo)致CAT 活性升高。與之類似，Magara 等（2018） 發(fā)現(xiàn)微塑料暴露會(huì)影響貽貝（M. edulis）鰓的氧化應(yīng)激系統(tǒng)，使CAT 活性增加。本研究中單一暴露組鰓組織中SOD 活性低于微塑料和芘聯(lián)合暴露組，表明當(dāng)兩種污染物同時(shí)存在時(shí)，鰓組織氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。SOD 和CAT 活性上升可能是由于污染物在菲律賓蛤仔體內(nèi)的代謝過(guò)程中出現(xiàn)過(guò)多自由基，組織反饋性增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)酶活性，以清除多余的自由基。Magara 等（2019）發(fā)現(xiàn)，微塑料和熒蒽暴露后貽貝（M.edulis）鰓組織SOD 活性變化和本研究呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。Webb 等（2020）發(fā)現(xiàn)貽貝（Perna canaliculus）暴露于添加三氯生的微塑料時(shí)，其鰓組織SOD 活性升高。在聯(lián)合暴露下，菲律賓蛤仔鰓組織GST 活性被抑制，而除H-pyrene 處理組，其余單一暴露組菲律賓蛤仔鰓組織GST 活性升高。有研究表明，短時(shí)間低劑量污染物暴露可導(dǎo)致機(jī)體GST 活性的誘導(dǎo)表達(dá)，但長(zhǎng)時(shí)間或者高劑量的脅迫則能夠抑制GST 的活性或表達(dá)（任加云等，2006）。

聯(lián)合暴露組消化腺組織CAT 和SOD 活性低于單一暴露組。Skdokur 等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，在微塑料和汞聯(lián)合暴露條件下，菲律賓蛤仔（R.philippinarum）消化腺組織CAT 活性被抑制，而鰓組織CAT 活性受到誘導(dǎo)升高，這與我們的研究結(jié)果類似。CAT 和SOD 活性被抑制可能是因?yàn)槁?lián)合脅迫產(chǎn)生了更多的自由基蓄積，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)損傷和補(bǔ)償機(jī)制的喪失。微塑料和芘暴露激活了菲律賓蛤仔消化腺組織的GST 活性。Gehringer 等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，有毒物質(zhì)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，主要通過(guò)肝臟的谷胱甘肽還原機(jī)制解毒，這可能是GST在本研究中活性較高的原因之一。然而，GST 活性的增加可能并不足以防止氧化損傷，因?yàn)楸狙芯堪l(fā)現(xiàn)消化腺脂質(zhì)過(guò)氧化增加。此外，在單一微塑料暴露下，消化腺GST 活性與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差 異。 前 期 研 究 發(fā) 現(xiàn)， 紫 貽 貝 （M.galloprovincialis）在1.5 g/L 微塑料（<100 滋m）暴露7 d 后，其消化腺組織GST 活性并未發(fā)生變化（Avio et al，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于L-pyrene暴露組，H-pyrene 暴露組中，脂質(zhì)過(guò)氧化水平增加且消化腺CAT 和SOD 活性以及鰓組織CAT 和GST 活性均下降?？梢?jiàn)，鰓和消化腺組織抗氧化酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化水平的反應(yīng)并不一致，可能是由于污染物的生物利用度差異導(dǎo)致。

3.4 綜合生物標(biāo)志物分析

綜合生物標(biāo)志物分析已被廣泛應(yīng)用于污染物對(duì)水生動(dòng)物的綜合毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)（Damiens et al，2007；Raftopoulou et al，2010），高IBR 值表明被測(cè)生物體遭受了較高的脅迫壓力（Turja et al，2014）。在本研究中，消化腺的IBR 值高于鰓，表明污染物對(duì)消化腺的毒性作用更大。Teng 等（2021）運(yùn)用IBR 定量評(píng)價(jià)了聚乙烯（PE）和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）脅迫后，牡蠣（C.gi原gas）鰓和消化腺組織中生物標(biāo)志物的變化情況，發(fā)現(xiàn)消化腺組織對(duì)微塑料脅迫響應(yīng)值大于鰓組織。本研究中，H-pyrene 暴露組IBR 響應(yīng)值高于Lpyrene 暴露組。Kim 等（2016）發(fā)現(xiàn)鯉魚（Cypri原nus carpio）暴露于PAHs 時(shí)，IBR 值隨PAHs 濃度的增加而增加。同樣，李磊等（2018） 通過(guò)IBR評(píng)價(jià)了BaP 暴露后脊尾白蝦（Exopalaemon carini原cauda） 的生物標(biāo)志物響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IBR 值與BaP 暴露濃度存在劑量依賴效應(yīng)，且肌肉和肝胰臟組織對(duì)BaP 脅迫響應(yīng)存在差異性，表明IBR 可作為評(píng)價(jià)多個(gè)生物標(biāo)志物對(duì)PAHs 暴露響應(yīng)的定量工具。BMPs 和芘聯(lián)合暴露組的IBR 值高于單一暴露組，這表明BMPs 和芘對(duì)菲律賓蛤仔復(fù)合毒性效應(yīng)表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。

4 結(jié)論

本文以菲律賓蛤仔為研究對(duì)象，探討了微塑料和芘對(duì)其生理活動(dòng)、免疫防御和氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微塑料的存在顯著抑制了菲律賓蛤仔的攝食率。微塑料和芘暴露均能導(dǎo)致菲律賓蛤仔出現(xiàn)不同程度的氧化應(yīng)激現(xiàn)象，聯(lián)合暴露對(duì)菲律賓蛤仔的氧化損傷程度高于單獨(dú)暴露且能夠顯著抑制血細(xì)胞的吞噬活性。相較于較大粒徑微塑料（6 滋m），小粒徑微塑料（0.3 滋m）加劇了鰓組織的脂質(zhì)過(guò)氧化程度和芘對(duì)血細(xì)胞的免疫毒性。由此可見(jiàn)，微塑料和有機(jī)污染物聯(lián)合作用可能會(huì)對(duì)海洋生物產(chǎn)生更大的毒性效應(yīng)。因此，開(kāi)展微塑料與有機(jī)污染物的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究，將是今后微塑料毒性評(píng)價(jià)的重要方向之一。