符真珠,王 銳,張?zhí)┤?,王慧娟,?杰,李艷敏,蔣 卉,王利民,袁 欣,李彥邦,張和臣
(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,河南 鄭州 450002;2. 上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240)
矮牽牛是一類應(yīng)用非常廣泛的花鏡、花壇及家庭園藝植物。其花色非常豐富,具有白色、紅色、粉色、紫色、藍(lán)色、復(fù)色以及黃色等多種類型[1-4]。研究表明,決定矮牽牛花色的主要物質(zhì)是花青苷,主要包含天竺葵、矢車菊和飛燕草等色苷類型,它們分別由F3H、F3’H、F3’5’H等基因控制[5-6]。藍(lán)色是一種稀有色,主要有飛燕草素控制,其花卉種類較少。F3’5’H是合成飛燕草素的主效基因,是細(xì)胞色素P450家族重要成員,該基因的轉(zhuǎn)化應(yīng)用是獲得藍(lán)色花種質(zhì)的關(guān)鍵[7-9]。近幾年,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,月季、康乃馨、菊花等一些重要切花的藍(lán)色花種質(zhì)遺傳改良已經(jīng)獲得突破,一些轉(zhuǎn)基因品種在日本、澳大利亞等已經(jīng)得到了商業(yè)化推廣應(yīng)用[10]。如在康乃馨中共表達(dá)矮牽牛細(xì)胞色素b5和F3’5’H基因,可以使轉(zhuǎn)基因后代株系的飛燕草素苷含量明顯增加[6]。在切花月季中導(dǎo)入三色堇F3’5’H和鳶尾DFR基因,并同時(shí)抑制其內(nèi)源DFR基因的表達(dá),成功創(chuàng)建了呈現(xiàn)藍(lán)色花瓣的月季種質(zhì)[5]。抑制菊花內(nèi)源F3’H,并導(dǎo)入三色堇F3’5’H基因,也成功獲得了藍(lán)色花轉(zhuǎn)基因株系[11]。矮牽牛中花青素苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)被解析,在Petunia inflata、P.axillaris基因組中F3’5’H基因由2 個(gè)基因座編碼,分別是HF1和HF2[12]。本研究對(duì)矮牽牛不同基因型的F3’5’H進(jìn)行了鑒定和功能分析,以期為后續(xù)花色分子育種奠定理論基礎(chǔ)。
矮牽牛材料P. inflata、P. axillaris、P. exserta以及P.hybridaM1(簡(jiǎn)寫為M1,下同)、P.hybridaV30(V30)、P.hybridaR27(R27)等均由荷蘭Ronald Koes教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送,為了便于遺傳轉(zhuǎn)化和性狀分析,對(duì)一些矮牽牛進(jìn)行了雜交,分別為M1×R27(粉色)、M1×V30(紫色)、P.axillaris×R27(紫色)及自交后代F2(白色、粉色、紅色或粉紫色)。矮牽牛植株在光照強(qiáng)度8 000~10 000 lx、光周期16 h 光照/8 h 黑暗、溫度25~30 ℃、相對(duì)濕度50%左右的條件下培養(yǎng)。
矮牽牛F3’5’H基因序列在基因組網(wǎng)站中(https://solgenomics.net/tools/blast/)通過(guò)Blast分析獲得,并將獲得的DNA 序列進(jìn)行內(nèi)含子/外顯子分析。各個(gè)品種(種)或轉(zhuǎn)基因后代的矮牽牛DNA 提取采用2×CTAB 方法;RNA 提取采用Trizol 試劑盒并通過(guò)NanoDrop 2000 進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè),反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行。F3’5’H基 因 克 隆 采 用 高 保 真Taq酶 試 劑 盒PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司],所用引物(5′—3′,下同)如下,HF1-Fw:ATGCTACTTACTGAACTTGCTGC,HF1-Rv:CTATGGTACATAAACATCAAATTG,HF2-Fw:ATGGTGCTACTTAGTGAGCTTG,HF2-Rv:CAAGCTAAAGGTGCATAAACATC。不同矮牽牛HF1和HF2位點(diǎn)編碼基因的基因型分型所用引物為,HF1(F3’5’H1)-Fw:GCTTGGATGGATTTACAAGGGATAG,HF1(F3’5’H1)-Rv:CATAGCTTCAAGAGGGACAGC;HF2(F3’5’H2)-Fw:CTATAACTAACGGCCGGCGTC,HF2(F3’5’H2)-Rv:CTCTCCCCTTCTCTGCTCATATC。
進(jìn)化樹(shù)分析通過(guò)MEGA 6.0 軟件進(jìn)行,將獲得的F3’5’H基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),并通過(guò)Construct/Test maximum Likelihood Tree 程序建立進(jìn)化樹(shù)。所用其他植物的F3’5’H基因編碼氨基酸序列根據(jù)GenBank 序列號(hào)在NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得。氨基酸序列比對(duì)采用DNAMAN軟件進(jìn)行。
以P. axillaris×R27 自交F2代的花瓣為材料,對(duì)F3’5’H及其上游調(diào)控基因AN2、PHZ、DPL、AN4(R2R3-MYB家族成員)的表達(dá)進(jìn)行分析。所用相關(guān)引物如下,F(xiàn)3’5’H-Fw:GCTTGGATGGATTTACAAGGG,F(xiàn)3’5’H-Rv:TGGTTCGTTCGAGATCCTAGG(F3’5’H1和F3’5’H2通 用 引 物);AN2-Fw:GAGGGGACTTCTCTTTGGATG,AN2-Rv:CGATGGTGCTGTTTCCTCATGCAA;PHZ-Fw:GGGACTTCTCTGAGGATGAAGTA,PHZ-Rv:ATCATTTTCGTTGCAGTTAGCTAG;DPL-Fw:GACTTTTGTCCGGAGGAAGTGGAC,DPL-Rv:GCATTCTTGGCCATGGTCCTAATTTC;AN4-Fw:GACTTCTCTCCAGATGAAGTGG,AN4-Rv:TTGAGAGGTTCCGAGGTTGAGG;actin-Fw:CTACGAGGGTTATGCTTTGCC,actin-Rv:GCTGGAATGTGCTAAGGGATG。
將克隆得到的矮牽牛F3’5’H基因采用gateway載體系統(tǒng)首先通過(guò)BP反應(yīng)構(gòu)建至pDNOR207載體,然后通過(guò)LR反應(yīng)構(gòu)建至超表達(dá)載體pK2GW7,并轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌Agl1。載體構(gòu)建所用引物序列如下,F(xiàn)3’5’H1-Fw:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGCTACTTACTGAACTTGCTGC,F(xiàn)3’5’H1-Rv:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTATGGTACATAAACATCAAATTG,F(xiàn)3’5’H2-Fw:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGTGCTACTTAGTGAGCTTG,F(xiàn)3’5’H2-Rv:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAAGCTAAAGGTGCATAAACATC。
矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化所用品種類型為M1×R27,采用葉盤轉(zhuǎn)化法。首先將培養(yǎng)好的矮牽牛葉片在70%乙醇中消毒5 s,然后在0.5%次氯酸鈉中消毒10~12 min,再用無(wú)菌水沖洗5 遍。將沖洗后的矮牽牛葉片切割成10 mm 左右的方塊,在農(nóng)桿菌中浸染10 min。浸染后的葉片在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+20 g/L蔗 糖+10 g/L 葡 萄 糖+0.1 mg/L 萘 乙 酸+1.0 mg/L 玉 米素+2.0 mg/L 6-芐基腺嘌呤+8 g/L 瓊脂粉,pH 值5.7)中培養(yǎng)2 d,然后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基(共培養(yǎng)培養(yǎng)基+100 mg/L 卡那霉素+250 mg/L 頭孢噻肟鈉)中培養(yǎng)40~60 d,獲得矮牽牛轉(zhuǎn)化植株。將轉(zhuǎn)化植株進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(MS+20 g/L 蔗糖+10 g/L 葡萄糖+8 g/L 瓊脂粉+100 mg/L 卡那霉素+250 mg/L 頭孢,pH 值5.7)中培養(yǎng)30 d。將生根后的矮牽牛植株移栽到基質(zhì)中培養(yǎng)至開(kāi)花,進(jìn)行表型和基因型分析。
矮牽?;ò曛谢ㄇ嗨睾繙y(cè)定采用高效液相色譜法(HPLC)。分別采集對(duì)照矮牽牛M1×R27、M1×V30 及每個(gè)F3’5’H轉(zhuǎn)基因后代中10 個(gè)矮牽?;ò辏ㄍ耆归_(kāi)期)進(jìn)行凍存?zhèn)溆茫瑴y(cè)定試驗(yàn)在蘇州科銘生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。測(cè)定的花青素類型包括飛燕草素、矢車菊素、二氫槲皮素和二氫楊梅素。
通過(guò)Blast對(duì)矮牽牛基因組中F3’5’H基因分析表明,P.inflata共有HF1和HF2兩個(gè)位點(diǎn),其中HF1位點(diǎn)有1 個(gè)編碼基因,命名為F3’5’H1inf,HF2位點(diǎn)有2個(gè)基因連鎖在一起,分別命名為F3’5’H2-1inf和F3’5’H2-2inf。P. axillaris基因組也有HF1和HF2兩個(gè)位點(diǎn),但是HF2位點(diǎn)只包含1 個(gè)F3’5’H2axi基因。在編碼區(qū)內(nèi)這些F3’5’H基因都含有2 個(gè)內(nèi)含子,其中第1 個(gè)內(nèi)含子的插入位置相同,但是F3’5’H1axi(F3’5’H1-i)第2 個(gè)內(nèi)含子序列比F3’5’H1inf(F3’5’H1-ii)長(zhǎng)813 bp。同時(shí),對(duì)矮牽牛P. exserta以及R27、V30(不同矮牽牛品種花瓣呈色表型見(jiàn)圖1A)中的F3’5’H基因進(jìn)行了克隆分析。結(jié)果表明,F(xiàn)3’5’H1R27編碼區(qū)的DNA序列長(zhǎng)達(dá)5 099 bp,在第3個(gè)外顯子區(qū)域有1 個(gè)dTPH9轉(zhuǎn)座子的插入(F3’5’H1-iii),而F3’5’H1V30可以正 常 編碼。F3’5’H2與F3’5’H1基因結(jié)構(gòu)和序列長(zhǎng)度類似,都有2 個(gè)內(nèi)含子插入,而且第1 個(gè)內(nèi)含子的插入位置相同(圖1B)。對(duì)基因型分析表明,在P.axillaris、P.exserta、R27 等矮牽牛中都含有1 個(gè)F3’5’H2成員,而在P.inflata中含有2 個(gè)成員,并且緊密連鎖在一起。已有報(bào)道表明,F(xiàn)3’5’H1R27類型的基因在一些矮牽牛園藝品種中被檢測(cè)到,說(shuō)明存在該類型基因的矮牽牛種質(zhì)參與了現(xiàn)代園藝品種的創(chuàng)制[13]。因此,根據(jù)F3’5’H基因內(nèi)含子序列的長(zhǎng)度差異設(shè)計(jì)引物,在不同矮牽牛中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,通過(guò)凝膠電泳可以定向檢測(cè)F3’5’H在不同矮牽牛中的基因型(圖1C)。F3’5’H基因型差異可為后續(xù)進(jìn)行矮牽?;ㄉ肿釉O(shè)計(jì)育種提供重要遺傳依據(jù)。
對(duì)鑒定和克隆得到的F3’5’H基因所編碼的氨基酸序列建立進(jìn)化樹(shù),結(jié)果表明,矮牽牛的HF1位點(diǎn)與HF2位點(diǎn)所在的F3’5’H基因分布在一個(gè)分支單元,屬于典型的CYP75A 基因家族類型,而F3’H屬于CYP75B 型[14]。但是F3’5’H1和F3’5’H2基因在聚類上出現(xiàn)了明顯的分離,它們各自聚類在一起(圖2A),說(shuō)明它們?cè)诎珷颗N锓N分化之前就已經(jīng)產(chǎn)生。對(duì)其編碼的氨基酸序列比對(duì)分析表明,F(xiàn)3’5’H1inf、F3’5’H1axi以及F3’5’H2編碼氨基酸數(shù)目相同,它們之間的序列相似性高達(dá)97.0%以上。F3’5’H1R27基因編碼的氨基酸由于dTPH9轉(zhuǎn)座子的作用,使正常編碼的轉(zhuǎn)錄本多出了2 個(gè)氨基酸(圖2B)。
為了檢測(cè)矮牽牛F3’5’H基因?qū)ò瓿噬淖饔?,?duì)矮牽牛P. axillaris和R27 雜交獲得的F2進(jìn)行表型和基因型分析。由圖3 可知,F(xiàn)2的花瓣呈色表型主要有4類,分別是白色花瓣黃色雄蕊、粉紫色花瓣紫色雄蕊、粉紫色花瓣黃色雄蕊以及紅色花瓣黃色雄蕊(圖3A 的L1、L3、L6、16);占比較多的為粉紫色花瓣紫色雄蕊和粉紫色花瓣黃色雄蕊類型,這2種類型的后代中都含有能正常編碼的F3’5’H1axi基因,說(shuō)明該基因在紫色花瓣的形成中起著重要作用。對(duì)F2中(L1—L20)的F3’5’H1基因型進(jìn)行分析(圖3B),20株后代中,F(xiàn)3’5’H1R27基因型有16個(gè)(純合型2 個(gè)),F(xiàn)3’5’H1axi基因型有13 個(gè)(純合型3個(gè))。對(duì)L2 和L17 兩種類型后代中相關(guān)基因表達(dá)特性的分析結(jié)果表明,F(xiàn)3’5’H基因的表達(dá),在花冠和花管中都是隨著花瓣的發(fā)育(S2—S7,即花瓣露出花萼期至花瓣完全展開(kāi)期)逐漸增強(qiáng),而在雄蕊中的表達(dá)逐漸減弱(圖3C)。F3’5’H基因在雌蕊中盡管也有表達(dá),但是并沒(méi)有呈現(xiàn)花青苷積累的表型。前期研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)3’5’H1基因主要受AN2 和ASRs 等轉(zhuǎn)錄因子的特異性調(diào)控,而F3’5’H2主要受AN4 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[15]。說(shuō)明F3’5’H對(duì)花瓣的呈色作用跟基因型關(guān)聯(lián)密切,并受制于不同R2R3-MYB 基因成員的表達(dá)特性。
在矮牽牛M1×R27中,對(duì)F3’5’H基因的轉(zhuǎn)錄本測(cè)序表明,F(xiàn)3’5’H1R27具有可變剪切現(xiàn)象,其中1 條轉(zhuǎn)錄本可以正常編碼,而另1 條轉(zhuǎn)錄本不能正常編碼。因此,該品種的花瓣中積累以矢車菊素苷為主的花青苷類型,導(dǎo)致花瓣呈現(xiàn)粉色。為了驗(yàn)證不同F(xiàn)3’5’H基因型的分子功能,在矮牽牛M1×R27 中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化(超表達(dá))分析。結(jié)果表明,OE(Over expression)-F3’5’H1inf、OE-F3’5’H1axi、OEF3’5’H2-1inf以及OE-F3’5’H2-2inf都可以使轉(zhuǎn)基因矮牽牛后代中的花瓣呈現(xiàn)明顯的紫色變化趨勢(shì)(圖4A)。與對(duì)照M1×R27 相比,轉(zhuǎn)基因后代的花瓣顏色明顯加深,接近于M1×V30 的呈色表型;但是,OE-F3’5’H1R27卻沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的呈色變化,說(shuō)明該基因編碼的氨基酸不能促使底物向飛燕草素方向有效轉(zhuǎn)化。
對(duì)矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照M1×R27花瓣花青素成分的HPLC 分析表明(圖4B),M1×R27 對(duì)照只有4.03 mg/kg 的飛燕草素,說(shuō)明該品種中的F3’5’H編碼蛋白具有一定的活性,但是較弱,進(jìn)一步驗(yàn)證了F3’5’H1R27的可變剪切事件。轉(zhuǎn)基因矮牽?;ò曛械纳睾?,除了OE-F3’5’H1R27之外,其他轉(zhuǎn)基因植株中的飛燕草素含量明顯增加(57.56~70.23 mg/kg),F(xiàn)3’5’H的直接反應(yīng)產(chǎn)物二氫楊梅素也明顯增加(129.58~152.64 mg/kg);其競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物二氫槲皮素(13.52~20.00 mg/kg)和矢車菊素含量(9.01~21.22 mg/kg)卻明顯減少。說(shuō)明F3’5’H基因?qū)ㄇ嗨睾铣煞较虻母淖兤鸬搅酥匾饔?,使花瓣呈色由粉色向紫色發(fā)生改變。
花青苷成分與含量是決定花瓣呈色的化學(xué)基礎(chǔ)[16-17]。其中飛燕草素類型是紫色和藍(lán)色花瓣的主要色素類型??刂骑w燕草素合成的一個(gè)主效基因是F3’5’H,其分子功能的有無(wú)和強(qiáng)弱直接決定花瓣中飛燕草素的含量[9,18-19]。矮牽牛是研究花瓣呈色的一種重要模式植物[1],對(duì)其F3’5’H基因功能進(jìn)行細(xì)化和系統(tǒng)研究可以揭示紫色、藍(lán)色及粉色花瓣呈色的分子基礎(chǔ)。本研究表明,在矮牽牛中存在HF1 和HF2 兩個(gè)位點(diǎn),分別編碼不同的F3’5’H基因。說(shuō)明該基因在矮牽牛的物種進(jìn)化過(guò)程中非?;钴S。本試驗(yàn)通過(guò)研究矮牽牛不同F(xiàn)3’5’H基因型、表達(dá)特性、轉(zhuǎn)基因表型等,揭示了F3’5’H基因與矮牽?;ò瓿噬g的關(guān)系,即粉色花瓣的呈色主要源于該基因的突變,不能正常編碼行使酶功能;正常編碼的F3’5’H基因可以促使合成飛燕草素,使花瓣呈現(xiàn)紫色。因此,F(xiàn)3’5’H基因能否正常編碼是矮牽?;ò瓿噬町惢闹匾肿踊A(chǔ)之一。該基因的轉(zhuǎn)錄直接受AN2、ASRs、DPL 等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控不同的F3’5’H基因型,F(xiàn)3’5’H1基因主要與花瓣中花冠的呈色直接相關(guān),而F3’5’H2基因主要與雄蕊、雌蕊、花管等呈色相關(guān)[7]。F3’5’H基因型差異可以作為今后矮牽牛分子設(shè)計(jì)育種的一個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn),通過(guò)父母本基因型的標(biāo)記檢測(cè),一定程度上可預(yù)測(cè)雜交后代的花色性狀分離特性。
在花青苷合成基因中,F(xiàn)3H、F3’H和F3’5’H是決定花青苷合成類型的3 個(gè)關(guān)鍵基因,它們分別控制天竺葵素、矢車菊素和飛燕草素。其中F3’H和F3’5’H是細(xì)胞色素P450家族成員,不同植物中,它們的成員數(shù)量、進(jìn)化特性、表達(dá)方式具有很大差異,這些分子特性都是控制下游花青苷差異化的基礎(chǔ)[20]。在矮牽牛中,3 個(gè)類型的基因都存在,但是AN2、ASRs、AN4等基因主要控制F3H和F3’5’H的表達(dá),而F3’H基因的表達(dá)特性并不受R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的影響[21-22]。這些結(jié)果表明,一方面,矮牽?;ò曛谢ㄇ嘬疹愋偷姆e累主要受F3’5’H基因的影響(基因型和表達(dá)特性),另一方面,雖然F3H基因的表達(dá)也同步受到調(diào)控,但是矮牽牛中的DFR(二氫山奈酚4-還原酶)活性可能對(duì)二氫楊梅素具有偏好性,更能促使飛燕草素類的合成[23]。本研究揭示了矮牽牛花瓣呈色的一種重要分子機(jī)制,也為今后研究其他植物的花瓣呈色機(jī)制提供了重要線索。