張 野，叢德毓，汲廣成，王宇峰，婁惠娟，張紅石△

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2.吉林省中醫(yī)院，吉林 長春 130021；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院，吉林 長春 130117)

缺血性腦卒中后失眠是臨床常見疾病，缺血性腦卒中患者中有較多患者在不同程度上會出現(xiàn)失眠[1]。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)卒中后患者失眠發(fā)病率為48.67%～68%，相對于正常人群中的失眠發(fā)生率是顯著升高的[2]，失眠是影響卒中治療和恢復(fù)的主要障礙，而且可能會增加卒中的復(fù)發(fā)率和死亡率，同時也會相繼出現(xiàn)抑郁傾向，所以失眠與腦血管病變密切相關(guān)。

大鼠P38絲裂源活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化后可被激活，參與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等，是機(jī)體眾多細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中轉(zhuǎn)站，是各類炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)突觸傳遞信號作用的重要激酶[3]。與坐骨神經(jīng)損傷、褥瘡組織壞死、癡呆、失眠和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等發(fā)生機(jī)制有關(guān)[4]，對腦損傷后各類疾病的影響值得進(jìn)一步研究。有研究表明p38MAPK在阿爾茨海默癥血液與疾病持續(xù)時間呈正相關(guān),且在大腦與學(xué)習(xí)、記憶和睡眠相關(guān)區(qū)域中高度表達(dá)[5]。在各種失眠動物模型中也僅證實(shí)了p38MAPK參與Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的證據(jù)，p38MAPK活性在失眠的病理發(fā)展中起著重要作用，抑制認(rèn)知神經(jīng)元細(xì)胞中p38MAPK的激活是失眠的治療途徑之一[6]。神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)屬于星形膠質(zhì)細(xì)胞變化的標(biāo)記物，受應(yīng)激反應(yīng)變化，腦損傷后一般表達(dá)增加，具有促進(jìn)軸突再生和神經(jīng)重構(gòu)的功能，同時也介導(dǎo)神經(jīng)活性物質(zhì)相關(guān)的多種炎性細(xì)胞因子變化，如TNF-α、GFAP可能是誘導(dǎo)p38MAPK變化的通路之一[7]。β-內(nèi)啡肽(β-EP)是人體一種具有止痛、鎮(zhèn)靜作用的物質(zhì)，有研究認(rèn)為睡眠剝奪會導(dǎo)致β-EP表達(dá)水平下降，β-EP與GFAP常被用于神經(jīng)應(yīng)激反應(yīng)一類的研究[8]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物及分組

從長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司購買SD大鼠30只，體質(zhì)量220～230 g，進(jìn)入長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，隨機(jī)分3組，每組10只，其中兩組進(jìn)行腦卒中后失眠造模，隨機(jī)選擇1組作為頭針聯(lián)合中藥組進(jìn)行頭針和中藥治療，另一組作為模型組不治療，未造模一組作為空白組，飼養(yǎng)間保持溫度為23 ℃、12/12 h光照周期，溫度(55±10)%，并自由飲水。實(shí)驗(yàn)已通過長春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批(20190151)。

1.2 主要儀器及試劑

Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展責(zé)任有限公司)；視頻分析系統(tǒng)Smart version3.0.04；華佗牌一次性針灸針(0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司)；大鼠P38MAPK酶聯(lián)免疫檢測試劑盒96T(血清、血漿)(南京建成)；大鼠β-EP酶聯(lián)免疫檢測試劑盒96T(組織勻漿)(南京建成)；大鼠GFAP酶聯(lián)免疫檢測試劑盒96T(血清、血漿)(南京建成)；大鼠P38MAPK酶聯(lián)免疫檢測試劑盒96T(血清、血漿)(南京建成)；組織勻漿器(美國KONTES)；低溫高速離心機(jī)(德國Eprendorf);Biotek Synergy HTX多功能微孔板檢測儀(biotek寶特伯騰)；10%水合氯醛(北京試劑公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 缺血性腦卒中模型的建立

采用大腦中動脈栓塞灌注造模法，術(shù)前24 h大鼠停止喂養(yǎng)但是可以飲水，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 g/kg)，確保全程無痛。大鼠仰臥固定后消毒。在頸部正中縱切一小口，鈍性分離組織和腺體，撥開肌肉可見左側(cè)頸總動脈，分離左側(cè)頸內(nèi)動脈和頸外動脈，掛線備用，結(jié)扎頸外動脈。再結(jié)扎頸總動脈，夾閉頸內(nèi)動脈。在頸總動脈上距離分叉2 mm處剪一斜口，插入線栓，輕提頸內(nèi)動脈縫合線并松開頸內(nèi)動脈血管夾，沿頸內(nèi)動脈將線栓穿過顱骨直至手下有明顯阻力時(約18 mm)，實(shí)現(xiàn)大腦中動脈阻塞，導(dǎo)致腦缺血。以縫合線結(jié)扎切口并固定住線栓，剪斷多余部分縫合線，縫合傷口后，給予大鼠注射青霉素20萬單位防止感染，完成造模。造模后隨即進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

2.2 卒中后失眠模型的建立

采用失眠動物模型PCPA法造模，卒中模型成功后1 d，腹腔注射400 mg/kg的PCPA懸濁液2 mL，1次/d，連續(xù)注射2 d。大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂，對外界敏感，第3天中午腹腔注射戊巴比妥鈉35 mg/kg，翻正反射試驗(yàn)消失為成功。

2.3 干預(yù)方法

中藥選用益腦復(fù)健方，出自《成方制劑》，為國醫(yī)大師任繼穴創(chuàng)立[9]，臨床應(yīng)用廣泛，方由赤芍、川芎、蒲黃、葛根、槐花、地龍、紅花、豨薟草和三七組成，該方可以活血散瘀、行氣醒神，藥效和緩而少有副作用，適用于中風(fēng)后緩解期局部腦組織缺血后諸證。頭針是取用腦的頂區(qū)及頂前區(qū)，參考于致順教授頭針叢刺理論，結(jié)合《大鼠穴位圖譜》[10]在頂骨正中的百會穴及旁開5 mm處進(jìn)行定位取穴。

聯(lián)合組在造模成功后，首先以益腦復(fù)健方中藥灌胃，按照成人1/30的比例用量，以赤芍、川芎、蒲黃、葛根、槐花、地龍各20 g,紅花12 g,豨薟草30 g,三七18 g，加適量水熬2 h，剩余藥液300 mL。給藥時每只大鼠灌胃5 mL。頭針治療在灌胃后進(jìn)行，先取百會穴，以針灸針(0.25 mm×13 mm)向前斜刺10 mm，再在百會穴兩側(cè)旁開約5 mm處，沿皮朝鼻尖向前斜刺10 mm，進(jìn)針后以捻轉(zhuǎn)方式快速行針30 s，以小塊醫(yī)用膠布(5 mm×10 mm)固定，采取叢刺法和長留針的方式，放入無墊料籠中，配合帶針運(yùn)動，留針6～8 h，1次/d，每周針刺5次，持續(xù)2周。

2.4 大鼠行為學(xué)檢測

Morris水迷宮試驗(yàn)：用于測試大鼠的復(fù)雜記憶能力和空間定位能力。水迷宮(ZS-001moriss)由1個圓柱形水槽和圖像采集分析系統(tǒng)構(gòu)成(DIGITAL CCD CAMERA)，四周圍有遮光簾，從而減少外界干擾，利用動物求生本能，尋找隱藏水中的平臺，記錄每只大鼠所需要的時間和路線。

2.5 血清和腦組織中p38MAPK濃度測定

在治療周期結(jié)束后，分別將空白組、模型組和聯(lián)合組的大鼠以10 %水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 g/kg)，確保大鼠肌肉放松并且無痛，剪開腹腔，腹主動脈取血5 mL，并將血樣本離心(2 000×g，4℃、15 min)，離心后獲得上層血清。大鼠處于麻醉狀態(tài)，取血后斷頭處死，立即剝離腦組織，腦樣本按重量體積比1 g∶9 mL的比例加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液(PH7.4)，用手工或勻漿器將標(biāo)本充分勻漿并離心(2000×g，4 ℃、15 min)，收集上清液體備用。采用ELISA法檢測大鼠血清及腦組織p38MAPK、β-EP和GFAP含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS24.0軟件對所有結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，治療前后對比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 建模結(jié)果

建模后大鼠具有正常生命體征，皆未出現(xiàn)腹膜炎跡象，觀察各組大鼠造模前后的行為學(xué)變化，水迷宮測試結(jié)果顯示造模前3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，造模后兩組與空白組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示造模成功。見表1。

表1 各組大鼠造模前后水迷宮測試時間比較

3.2 各組大鼠p38MAPK濃度比較

大鼠血清中p38MAPK濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；聯(lián)合組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。大鼠腦組織中p38MAPK濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清與腦組織內(nèi)p38MAPK比較

3.3 各組大鼠血清中β-EP、GFAP濃度比較

大鼠血清中β-EP濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；聯(lián)合組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。大鼠血清中GFAP濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，聯(lián)合組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中β-EP、GFAP濃度比較

3.4 治療2周后大鼠行為學(xué)功能比較

觀察3組大鼠在治療前后的行為學(xué)變化。水迷宮測試結(jié)果顯示聯(lián)合組在治療前后比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，治療后模型組分別和空白組、聯(lián)合組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如表4。治療后模型組、空白組和聯(lián)合組大鼠行為學(xué)路線比較，如圖1。

表4 各組大鼠治療前后水迷宮測試時間比較

圖1 各組大鼠治療后水迷宮測試路線比較

4 討論

缺血性腦卒中后的失眠是腦卒中的重要并發(fā)癥，是腦動脈梗死而引起的腦組織缺血和缺氧而導(dǎo)致，尤其以老年患者或有失眠病史者發(fā)病率高，《黃帝內(nèi)經(jīng)》寒熱病篇記載:“足太陽有通頂入于腦者……入腦乃別陰跡、陽跡，陰陽相交，陽入陰出，陰陽交于目銳眥，陽氣盛則瞋目，陰氣盛則瞑目”，論述了頭和睡眠障之間的密切聯(lián)系。在《黃帝內(nèi)經(jīng)》營衛(wèi)生氣篇中也論述:“肌肉枯，氣道澀，五臟之氣相摶，其營氣衰少而衛(wèi)氣內(nèi)伐，故晝不精，夜不瞑”，強(qiáng)調(diào)了肢體經(jīng)脈不通或津液不足會對睡眠造成影響，臨床上卒中后痙攣患者往往出現(xiàn)失眠或者焦慮癥狀，而針刺和中藥屬于傳統(tǒng)的常用方法，臨床聯(lián)用療效顯著，有實(shí)驗(yàn)表明針灸和中藥可以抗血栓、保護(hù)血管，能夠?qū)ρ軆?nèi)皮組織細(xì)胞產(chǎn)生影響[11]，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮再生和重塑，增加側(cè)支循環(huán)。長白山通經(jīng)調(diào)臟手法流派依據(jù)學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)代研究理論，采用頭針聯(lián)合中藥的治療方案進(jìn)行治療，一方面用中藥改善腦部血液循環(huán)，行氣化瘀，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管再生，增加腦內(nèi)氧供給量，另一方面以頭針疏通頭部經(jīng)脈，著重鎮(zhèn)靜安神，調(diào)節(jié)腦內(nèi)氣血逆亂，從而達(dá)到治神與調(diào)形兼顧的效果，應(yīng)用較廣，臨床觀察研究效果確切，在作用機(jī)理方面仍然缺乏足夠認(rèn)識。

頭針聯(lián)合中藥治療方案是基于長白山活血通經(jīng)的傳統(tǒng)治療原則和腦缺血后的血管再生保護(hù)機(jī)制而確立，血管再生是通過血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化增殖轉(zhuǎn)運(yùn)、重組分裂而形成新的血管網(wǎng)絡(luò)，從而改善局部血液循環(huán)和血氧供應(yīng)，與中醫(yī)的活血通經(jīng)理論具有一致性[12]，在以往的臨床治療中具有良好療效，但是缺少理論機(jī)制的研究。腦卒中是由于大腦動脈突然閉塞而導(dǎo)致的腦血流減少，腦組織由于循環(huán)不足、缺少氧氣以及能量不足而導(dǎo)致神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等功能損害，致使失眠等一系列病變[13]。基于《靈樞》“頭有氣街”論述，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“頭氣有街”，頭氣源于自身經(jīng)絡(luò)之氣血，是頭部重要的血?dú)庵?，張景岳也認(rèn)為:“頭面為人之首，凡周身陰陽經(jīng)絡(luò)無所不聚，故氣血皆上行頭面而走諸竅”。所以結(jié)合缺血性腦卒中與頭氣街的聯(lián)系，應(yīng)用頭針的方法對卒中后失眠進(jìn)行治療。治療腦卒中失眠主要選取頂區(qū)和頂前區(qū)以及額區(qū)，并以頭部的重要經(jīng)脈督脈作為縱向維度基準(zhǔn)，既符合頭針分區(qū)理論又兼顧通督調(diào)神的理念。中藥選取赤芍、紅花、川芎和三七化瘀通絡(luò)、緩急消腫；蒲黃、槐花和豨薟草平肝祛風(fēng)、清厥陰熱，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)赤芍、川芎、葛根和地龍皆不同程度上具有解痙鎮(zhèn)靜的作用。故依據(jù)臨床實(shí)踐對于卒中后失眠的治療，并進(jìn)行對腦卒中后失眠大鼠模型治療的實(shí)驗(yàn)，結(jié)合p38MAPK等相關(guān)物質(zhì)探索其作用機(jī)制。

p38MAPK是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的物質(zhì)，能夠參與多條生物刺激信號通路發(fā)生，在腦組織損傷中參與細(xì)胞凋亡的物質(zhì)[14]，在與海馬結(jié)構(gòu)相關(guān)的中樞系統(tǒng)中p38MAPK與學(xué)習(xí)、記憶和睡眠功能相關(guān)[15]，在海馬區(qū)域高度表達(dá)，尤其血管癡呆后大鼠腦內(nèi)p38MAPK升高[16]，可能是與學(xué)習(xí)、記憶和睡眠相關(guān)細(xì)胞生長、凋亡炎癥或反應(yīng)應(yīng)激過程的關(guān)鍵信號[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組的血清內(nèi)檢測p38MAPK濃度高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。造模后模型組的腦組織內(nèi)p38MAPK濃度高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，大鼠血清中β-EP濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；聯(lián)合組治療后與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；大鼠血清中GFAP濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，聯(lián)合組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明腦卒中后失眠大鼠模型的血液及腦組織中p38MAPK濃度皆受到影響，且與之有關(guān)的β-EP、GFAP兩種物質(zhì)在血清中也相應(yīng)變化，從而改善睡眠。Wen LiFang關(guān)于p38MAPK參與Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的研究認(rèn)為腦組織中Aβ大量聚集，會誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，從而導(dǎo)致一系列信號通路紊亂。楊申[18]認(rèn)為p38MAPK在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，其被磷酸化激活后調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)p38-caspase-3促進(jìn)凋亡通路，可以改善其學(xué)習(xí)記憶能力下降。有研究也證明p38MAPK是導(dǎo)致失眠發(fā)生的物質(zhì)之一,且相關(guān)通路具有促進(jìn)神經(jīng)元生長作用[19]。有研究發(fā)現(xiàn)[20]p38MAPK可影響VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。治療后聯(lián)合組血清內(nèi)p38MAPK濃度低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，聯(lián)合組腦組織內(nèi)p38MAPK濃度低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明頭針聯(lián)合中藥的方案能夠通過干預(yù)p38MAPK從而恢復(fù)卒中后大鼠失眠。

5 結(jié)論

綜上,大鼠腦組織和血清內(nèi)p38MAPK濃度升高與大鼠缺血性腦卒中的失眠發(fā)生相關(guān)，大鼠血清和腦組織內(nèi)p38MAPK相關(guān)通路參與卒中大鼠睡眠恢復(fù)過程，頭針聯(lián)合中藥的治療方案可以促進(jìn)卒中后失眠大鼠模型血清及腦組織內(nèi)p38MAPK的濃度降低，可能是促進(jìn)修復(fù)受損傷大鼠模型的空間記憶能力和睡眠功能的重要因素。