王永洪 王健 賀萬斌 付榆 但杰 朱明杰

（四川省樂山市人民醫(yī)院 樂山 614000）

結(jié)直腸癌（CRC）是常見的胃腸道惡性腫瘤之一，發(fā)病早期臨床癥狀缺乏典型性，具有發(fā)病率高、致死率高等特點[1]。目前，臨床上治療CRC 以手術(shù)切除根治為主，雖然能切除病灶組織，但是30%以上患者確診時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，即發(fā)展為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）（肝臟是CRC 血行轉(zhuǎn)移主要靶器官），mCRC 成為我國居民死亡的重要原因。mCRC 治療中，借助單克隆抗體西妥昔單抗或帕尼單抗能競爭性阻斷表皮生長因子（EGF）和其他配體的結(jié)合，抑制癌細胞的增殖，誘導(dǎo)癌細胞凋亡[2]。循環(huán)游離DNA（cfDNA）是一種天然存在于血細胞中的物質(zhì)，且越來越多的研究證實，實體瘤的基因突變可能是由攜帶循環(huán)腫瘤DNA 的癌癥細胞進入血漿引起。本研究以mCRC 患者為研究對象，探討mCRC 患者外周血及腫瘤組織RAS 基因突變一致性對西妥昔單抗治療療效的影響?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年5 月～2018 年12 月收治的mCRC 患者69 例作為研究對象，男37 例，女32 例，年齡20～84 歲，平均（57.85±5.79）歲；原發(fā)腫瘤部位：左半結(jié)直腸51 例，右半結(jié)腸18 例；轉(zhuǎn)移類型：同時性48 例，異時性21 例；腹膜轉(zhuǎn)移：有9例，無60 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合mCRC 診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)病理學(xué)、影像學(xué)檢查確診；（2）腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶部位明確；（3）均處于姑息性一線或二線化療；（4）具備一個可用的mCRC 用于腫瘤組織突變分析診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）精神異常、凝血功能異常或認知功能異常者；（2）血液系統(tǒng)疾病、嚴重肝腎功能異常或伴有自身免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有患者的腫瘤組織均采用石蠟包埋進行常規(guī)處理，腫瘤組織區(qū)域的選擇由病理學(xué)專家評估。同時應(yīng)考慮腫瘤組織標(biāo)準(zhǔn)化所需樣本量。外周血血漿和血液中制備標(biāo)本如下：入組患者借助DETA 管采集血漿10 ml，60 min 離心，采用兩步血液離心操作進行10 min 離心，速度1 600 rpm，操作完畢后采集上清；將剩余的細胞在室溫下完成10 min 離心，速度3 000 rpm，血漿上清轉(zhuǎn)移到EP 管1.5 ml 中，儲存在-80℃冰箱中，備用。所有患者腫瘤組織經(jīng)石蠟包埋后進行突變分析，并由醫(yī)院病理科專家評估、確認腫瘤細胞數(shù)；10 μm 切片制備前，56℃下利用二甲苯、乙醇提取物對脫蠟面積＞15%腫瘤組織進行過夜，并給予蛋白酶K 消化。

1.2.2 RAS 基因突變分析 采用放射免疫法和實時熒光定量PCR 技術(shù)對血漿和腫瘤組織進行RAS狀態(tài)檢測。從mCRC 患者中的組織中提取DNA，并完成相關(guān)檢測；采用放射免疫法評估RAS 基因突變情況。當(dāng)檢測結(jié)果不一致時，可查詢歷史RAS 檢測報告，若組織可用，再轉(zhuǎn)移時利用SOC 技術(shù)再次完成RAS 基因檢測。（1）DNA 純化。借助循環(huán)核酸試劑盒完成DNA 的提取、純化。采用DNA 純化試劑盒完成FFPE 樣品提取與自動化系統(tǒng)maxwell16 FFPE 濃度測定。采用Nanodrop 1000 分光光度儀完成DNA 濃度提取。（2）腫瘤組織中ctDNA 的BEAMing 技術(shù)。從2 ml 血漿中獲得檢測樣本，利用oncobeam RAS CR 檢測試劑盒檢測。利用流式細胞儀獲得的數(shù)據(jù)通過FCS Express TM 軟件進行分析；突變率＞0.02%～0.04%的樣品為陽性。采用熒光標(biāo)記探針完成敏感基因位點的檢測，并利用流式細胞儀獲得實時熒光定量（PCR）相關(guān)產(chǎn)物，采用FCS Express 軟件比較突變體與野生型等位基因的比例；突變率在1%以上為陽性[3]。

1.2.3 實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測 （1）總RNA的提取。向樣品中加入200 μl 氯仿，15 s 振蕩后進行15 min 離心，速度4 500 rpm。離心完畢后去除上清，加入預(yù)冷乙醇1 ml，常溫下干燥7 min；在A260吸光值下完成總RNA 測定。（2）檢測。采用PCR 法測定RAS 基因突變位點，50 ng 的DNA 被用于外部引物擴增，95℃下連續(xù)完成14 個循環(huán)，每個循環(huán)30 s，根據(jù)相應(yīng)的溫度下進行30 s 退火，最后在72℃下完成RT-PCR 反應(yīng)擴增30 s。擴增的DNA 作為PCR 模板，點突變分析的引物用于探針的檢測[4]。

1.2.4 治療方法及RAS 基因?qū)Ο熜У挠绊?患者均采用西妥昔單抗治療，初始劑量西妥昔單抗注射液（注冊證號S20130004）400 mg/m2，靜脈滴注，之后每周用藥250 mg/m2，每4 天重復(fù)給藥。療程結(jié)束后完成30 個月隨訪。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0 軟件處理，計數(shù)資料行χ2檢驗，采用%表示，計量資料行t檢驗，采用（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mCRC 患者RAS 基因突變檢測分析 69 例mCRC 患者均完成RAS 基因突變檢測，結(jié)果表明：患者中RAS 基因突變26 例，RAS 基因野生型患者17 例，占65.38%，突變型患者9 例，占34.62%。其中，12 號密碼子GGT 突變?yōu)镚TT 10 例，突變?yōu)镚AT 8 例；突變?yōu)锳GT、CGT、TGT、GCT 患者1 例；13 號密碼子GGC 突變?yōu)镚AC 3 例，突變?yōu)門CG 4例。見圖1。

圖1 mCRC 患者RAS 基因突變位點

2.2 mCRC 患者外周血及腫瘤組織中RAS 基因突變一致性分析 所有患者均完成外周血及組織中RAS 基因突變檢測，結(jié)果表明：mCRC 患者組織中RAS 基因突變檢出率高于外周血中（P＜0.05）。見表1。

表1 mCRC 患者外周血及腫瘤組織中RAS 基因突變一致性分析

2.3 不同RAS 基因突變類型mCRC 患者西妥昔單抗療效分析 對所有mCRC 患者均常規(guī)給予西妥昔單抗治療，并對患者進行30 個月隨訪，結(jié)果表明：mCRC 患者中野生型患者利用西妥昔單抗后患者平均生存期為（21.49±5.64）個月，長于突變型患者的（16.23±3.59）個月（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同RAS 基因突變類型mCRC 患者西妥昔單抗生存期比較

3 討論

腫瘤細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)是一個相對復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，RAS 基因則是表皮生長因子受體（EGFR）依賴的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Ras-Raf-MAPK 途徑的重要基因。國內(nèi)學(xué)者研究表明，所有mCRC 患者均應(yīng)進行KARS 基因狀態(tài)檢測，且只有KRAS 野生型患者臨床建議接受EGFR 抑制劑治療[5]。腫瘤細胞發(fā)生凋亡時常伴有遺傳物質(zhì)的釋放，造成血中存在游離的腫瘤DNA，且與原發(fā)腫瘤遺傳信息相同。同時，RAS基因的測定以外周血、組織測定為主，但是臨床上對其一致性存在爭議。本研究中，患者中RAS 基因突變26 例，RAS 基因野生型患者17 例，占65.38%，突變型患者9 例，占34.62%。其中，12 號密碼子GGT突變?yōu)镚TT 10 例，突變?yōu)镚AT 8 例；突變?yōu)锳GT、CGT、TGT、GCT 1 例；13 號 密碼子GGC 突變?yōu)镚AC 3 例，突變?yōu)門CG 4 例，說明RAS 基因在mCRC 患者中突變率較高，且突變類型較多，均會增加臨床診療難度。循環(huán)腫瘤DNA 主要源于腫瘤細胞自主分泌、壞死及凋亡后的DNA 片段，其片段上常攜帶突變信息。本研究中，mCRC 患者組織中RAS 基因突變檢出率高于外周血中（P＜0.05），可以看出mCRC 患者病灶組織中RAS 基因突變率高于外周血中，對于難以獲得結(jié)直腸癌組織或耐藥突變?nèi)巳?，可測定外周血中循環(huán)腫瘤DNA[6]。西妥昔單抗屬于一種針對EGFR 的人鼠嵌合單克隆抗體，主要由鼠的抗EGFR 抗體可變區(qū)和人的IgG1 重鏈與κ 輕鏈的恒定區(qū)組成，藥物與EGFR 具有較強的親和力，能阻斷EGF、EGFR 結(jié)合，引起下游酪氨酸激酶活性降低，阻止腫瘤生長，發(fā)揮腫瘤細胞殺傷作用。本研究結(jié)果說明mCRC 患者外周血及腫瘤組織RAS 基因突變類型會對西妥昔單抗治療效果產(chǎn)生影響，治療前應(yīng)加強患者RAS 基因測定，制定詳細的治療方案，使得患者的治療更具科學(xué)性。

綜上所述，mCRC 患者外周血及腫瘤組織RAS基因突變存在一定的差異，會對患者西妥昔單抗治療療效產(chǎn)生一定影響，應(yīng)根據(jù)RAS 基因突變類型制定針對性治療方案，提高治療療程。