閆慧芳， 孫 娟

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草地農(nóng)牧業(yè)研究中心， 山東 青島 266109)

種子活力是綜合評價種子質(zhì)量水平的重要指標(biāo)，與休眠、萌發(fā)、壽命、貯藏等生理生化過程密切相關(guān)[1]。種子活力綜合反映了種子(批)貯藏后的發(fā)芽能力保持情況[2]，種子活力越高，其耐貯藏性也越強。金小雯等[3]研究發(fā)現(xiàn)，隨貯藏年限延長，不同品種燕麥(Avenasativa)種子活力變化不盡相同，發(fā)芽率、活力指數(shù)下降速率也不同，表明種子耐貯性和安全貯藏期存在較大差異。王澤等[4]研究貯藏時間、溫度和含水量對吐魯番梭梭(Haloxylonammodendron)種子萌發(fā)活力影響發(fā)現(xiàn)，種子發(fā)芽率和活力指數(shù)變化與含水量密切相關(guān)。Oba等[5]也提出，貯藏中高含水量的種子由于呼吸作用和代謝活性增加而使儲藏物質(zhì)迅速消耗，導(dǎo)致種子發(fā)芽潛力和活力過早喪失。此外，由老化導(dǎo)致的抗氧化酶活性降低和細胞結(jié)構(gòu)損傷也是造成貯藏種子活力下降的重要原因。因此，測定貯藏過程種子活力變化并進行綜合評價，將對種子安全貯藏具有理論指導(dǎo)意義。

大量研究表明，合理控制貯藏環(huán)境溫濕度條件可有效減緩種子老化，延緩活力喪失，保障種子安全貯藏[6]。然而，高標(biāo)準(zhǔn)低溫種質(zhì)庫建設(shè)需要長期持續(xù)消耗大量能源，給物種遺傳多樣性保護和能源可持續(xù)發(fā)展帶來極大挑戰(zhàn)。因此，提高種子抗老化能力和耐貯藏性是種質(zhì)資源長期保存最為直接有效、經(jīng)濟可行的策略。種子抗老化能力具有較高遺傳性，常志遠[7]采用41 ℃、90%相對濕度(RH)老化方法評價了71個常規(guī)粳稻(Oryzasaliva)品種耐貯藏性與種子活力差異，發(fā)現(xiàn)老化12 d時各品種種子發(fā)芽率差異最大，可較好地評價不同品種的耐貯藏特性。錢慧慧[1]則通過評價100份小麥(Triticumaestivum)品種(系)種子活力差異，篩選出高、低活力水平的品種，為高活力和耐貯藏性小麥新品種培育奠定了基礎(chǔ)。種子活力很大程度上影響著種子生產(chǎn)目標(biāo)和實踐，實時準(zhǔn)確地對其進行評價將有助于深入研究種子貯藏性能和壽命相關(guān)事件。

藜麥(Chenopodiumquinoa)是藜科一年生雙子葉兼性鹽生草本植物，富含氨基酸、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)，被譽為“超級谷物”和最適宜的全營養(yǎng)食品[8]。同時，藜麥莖葉鮮嫩多汁、適口性極好，干草粗蛋白含量達10.44%，可作為畜禽優(yōu)質(zhì)青汁飼料在畜牧業(yè)發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。此外，藜麥作為新型作物資源，具有較強的耐旱、耐鹽堿等優(yōu)良特性，使其在改良鹽堿地和改善生態(tài)環(huán)境方面發(fā)揮獨特優(yōu)勢，是沿海灘涂資源開發(fā)利用中具有廣闊應(yīng)用前景的生態(tài)型植物[10]。隨著現(xiàn)代高效農(nóng)業(yè)快速發(fā)展和人們對食品安全的重視，作為最具潛力的“生態(tài)與糧飼”兼用型作物，藜麥的研究、開發(fā)和利用越來越受關(guān)注。近20年，藜麥相關(guān)研究已在引種栽培[11]、耐鹽種質(zhì)篩選與評價[10,12]、營養(yǎng)成分與飼用價值開發(fā)[13-14]等方面取得重要進展。然而，藜麥種子活力水平及耐貯藏性評價研究卻鮮有報道。因此，本試驗采用老化法模擬種子貯藏，研究不同老化時間處理后藜麥種子活力變化，評價不同種質(zhì)材料的抗老化能力及耐貯藏性差異，以期為藜麥種質(zhì)資源保存、耐貯藏性分子機制深入研究、耐貯藏新品種培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藜麥種子共4份，其中3份采購于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，1份受贈于山西億隆藜麥開發(fā)有限公司。4份藜麥種子基本信息如表1，于2019年12月保存于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)實驗室-20 ℃環(huán)境，以備試驗所需。

表1 藜麥種子基本信息

1.2 試驗處理

1.2.1含水量測定與調(diào)整

參照國際種子檢驗協(xié)會種子檢驗規(guī)程[15]進行含水量測定。為保證不同種子批水分一致，避免因初始含水量不同引起的損傷差異，在進行老化處理前，將供試種子含水量調(diào)整至10%～14%[16]。本試驗將供試種子含水量統(tǒng)一調(diào)整至12%。

1.2.2老化處理

將調(diào)整好含水量的4份藜麥種子，置于盛有NaCl過飽和溶液(75%RH)、45 ℃恒溫密閉容器內(nèi)老化處理，分別在老化0(對照)、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7 d進行取樣，種子取出后立即用于發(fā)芽試驗。

1.3 發(fā)芽試驗

選取成熟飽滿、均勻一致的藜麥種子50粒，將其擺入鋪有10 mL蒸餾水潤濕3層濾紙的有蓋培養(yǎng)皿(110 mm×110 mm)后，25 ℃恒溫、黑暗條件下發(fā)芽，期間每天補充蒸餾水以保持濾紙濕潤。每個處理重復(fù)4次。以胚根突破種皮2 mm作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每隔12 h觀察并統(tǒng)計種子發(fā)芽情況，直到發(fā)芽5 d結(jié)束。

發(fā)芽勢為發(fā)芽過程中日發(fā)芽種子數(shù)達到最多時，發(fā)芽種子數(shù)占供試種子總數(shù)的百分比[7]，本試驗中，未老化的藜麥種子在發(fā)芽24 h時日發(fā)芽種子數(shù)最多，故選擇第1天的發(fā)芽種子數(shù)計算發(fā)芽勢。參照Abdul-Baki和Anderson[17]的方法，計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時間，以反映種子老化后的活力水平。參照常志遠[7]的方法，計算種子老化指數(shù)，以反映種子老化后發(fā)芽率的下降程度。

發(fā)芽勢(%)=(n/N)×100%

n為發(fā)芽過程中日發(fā)芽種子數(shù)達到最多時的發(fā)芽種子數(shù)，N為供試種子總數(shù)；

發(fā)芽率(%)=(n/N)×100%

n為前5 d全部發(fā)芽種子數(shù)，N為供試種子總數(shù)；

發(fā)芽指數(shù)=∑(n/t)

n為第t天內(nèi)新發(fā)芽種子數(shù)，t為對應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；

平均發(fā)芽時間(d)=∑nt/∑n

n為第t天內(nèi)新發(fā)芽種子數(shù)，t為對應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)，∑n為全部發(fā)芽種子數(shù)；

老化指數(shù)=[(GPna-GPa)/GPna]×100%

GPna為未處理發(fā)芽率，GPa為老化處理發(fā)芽率。

1.4 種子活力及耐貯藏性綜合評價

參照朱麗偉等[18]的方法，利用模糊隸屬函數(shù)法對老化處理后不同藜麥種質(zhì)的活力水平進行綜合評價。

μ(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中：μ(X)為某個指標(biāo)性狀的模糊隸屬函數(shù)值，當(dāng)指標(biāo)與種子活力呈負相關(guān)時用1-μ(X)表示；X為某一指標(biāo)數(shù)值；Xmax和Xmin分別為所用種子材料所有老化階段某一指標(biāo)的最大值和最小值。再將每份種子材料的各指標(biāo)隸屬函數(shù)值累加并求平均值，值越大表示種子活力水平越高，耐貯藏性越強。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS statistics 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與顯著性分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示；利用單因素方差分析(ANOVA)檢驗和Duncan檢驗比較不同處理平均值(p<0.05)。SigmaPlot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 老化處理對藜麥種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響

隨老化時間延長，4份藜麥種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率均呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢(圖1和圖2)。與對照相比，隴藜4號種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率從老化0.5 d時開始顯著(p<0.05)降低，至老化3 d時降低為0%；而隴藜1號種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率則從老化3 d時才開始顯著(p<0.05)降低，至老化7 d時降低為0%，尤其發(fā)芽率在老化0.5～2 d時無顯著性(p≥0.05)變化，老化2 d后仍為96%。隴藜3號和YL種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率變化居中。此外，老化3 d時，4份藜麥種子的發(fā)芽率均差異顯著(p<0.05)，可將不同藜麥種子材料區(qū)分開。

2.2 老化處理對藜麥種子發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時間的影響

4份藜麥種子發(fā)芽指數(shù)均隨老化時間延長而呈不斷降低趨勢(圖3)。相比于對照，隴藜4號種子發(fā)芽指數(shù)從老化0.5 d時開始顯著(p<0.05)降低，至老化3 d時降低為0；而隴藜3號、YL和隴藜1號種子發(fā)芽指數(shù)均從老化1 d時開始顯著(p<0.05)降低，分別在老化5 d、5 d和7 d時才降低為0。此外，老化2 d和3 d時，4份藜麥種子的發(fā)芽指數(shù)均差異顯著(p<0.05)，而老化4～6 d時，隴藜1號種子發(fā)芽指數(shù)均顯著(p<0.05)高于其他3份種子發(fā)芽指數(shù)。

隨老化時間延長，4份藜麥種子平均發(fā)芽時間均呈逐漸增長趨勢(表2)。與對照相比，隴藜4號種子平均發(fā)芽時間在老化0.5 d時就已顯著(p<0.05)增長，而其他3份種子平均發(fā)芽時間則在老化1.5～2 d時才開始顯著(p<0.05)增長。由于隴藜4號種子在老化3 d后不再有發(fā)芽，平均發(fā)芽時間未被統(tǒng)計，所以本試驗僅比較了老化0～2 d處理后不同種子間平均發(fā)芽時間的差異顯著性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老化1～2 d時，隴藜4號種子平均發(fā)芽時間均顯著(p<0.05)長于其他3份種子平均發(fā)芽時間，而隴藜1號和YL種子的平均發(fā)芽時間最短。

表2 老化處理后藜麥種子平均發(fā)芽時間的變化

2.3 老化處理對藜麥種子老化指數(shù)的影響

4份藜麥種子老化指數(shù)均隨老化時間延長而呈不斷升高趨勢(圖4)。相比于對照，隴藜4號種子老化指數(shù)從老化0.5 d時開始顯著(p<0.05)升高，至老化3 d時達最大；YL、隴藜3號和隴藜1號種子老化指數(shù)則分別從老化1、2 d和老化3 d時開始顯著升高，至老化4、5 d和老化7 d時達最大，且在升高階段的各老化處理間差異顯著(p<0.05)。老化3 d時，4份種子老化指數(shù)之間均差異顯著(p<0.05)，且隴藜4號最高，隴藜1號最低；老化4～6 d時，隴藜1號種子老化指數(shù)顯著(p<0.05)低于其他3份種子。

2.4 藜麥種子活力及耐貯藏性綜合評價

根據(jù)表3隸屬函數(shù)值綜合評價，4份藜麥種子隸屬函數(shù)平均值均隨老化時間延長而降低。相比于對照，隴藜1號種子隸屬函數(shù)平均值在老化1.5 d時顯著(p<0.05)降低，在1.5～7 d各老化時間之間差異顯著(p<0.05)；而隴藜4號種子隸屬函數(shù)平均值早在老化0.5 d時已顯著(p<0.05)降低，至老化3 d時降低為0；隴藜3號和YL種子隸屬函數(shù)平均值變化居中。老化0.5～3 d時，隴藜4號種子隸屬函數(shù)平均值顯著(p<0.05)低于其他3份種子，特別是老化3 d時，隴藜4號種子隸屬函數(shù)平均值最小，隴藜1號種子隸屬函數(shù)平均值最大，且4份種子之間差異顯著(p<0.05)。

表3 不同藜麥種子的活力相關(guān)指標(biāo)模糊隸屬函數(shù)值

3 討 論

種子活力是一項綜合評價和檢驗種子質(zhì)量好壞的指標(biāo)，在種子生產(chǎn)和科學(xué)研究中被廣泛重視。種子活力與其貯藏性能相關(guān)，通常高活力種子表現(xiàn)出更加明顯的生長優(yōu)勢和生產(chǎn)潛能，其貯藏潛力也更強[19]。研究表明，貯藏極大地影響了種子活力，長時間貯藏會因活性氧積累、脂質(zhì)過氧化作用增強、細胞膜系統(tǒng)完整性受損和抗氧化酶活性下降等導(dǎo)致種子老化，從而加速種子活力喪失[20]。本試驗采用老化法模擬種子貯藏，通過分析種子活力變化來評價不同藜麥種子材料的貯藏特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時間和老化指數(shù)各項指標(biāo)在4份藜麥種子材料之間表現(xiàn)出不同的老化響應(yīng)程度，隴藜4號種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)最先出現(xiàn)顯著降低，而隴藜1號種子則最晚表現(xiàn)出下降變化，隴藜3號和YL種子變化程度居中(圖1～圖3)，表明4份藜麥種子活力水平和耐貯藏性因種質(zhì)不同而存在較大差異。邢麗婷[21]研究人工老化對23個花生(Arachishypogaea)品種(系)種子活力影響也發(fā)現(xiàn)，種子活力及耐老化特征與品種的種類相關(guān)，并利用平均隸屬函數(shù)綜合分析并篩選出耐老化品種(NH 23)和老化敏感品種(FH 18)。類似的研究在燕麥中也有報道，如3個品種燕麥種子活力隨貯藏年限延長的變化不盡相同，表現(xiàn)為貯藏4年后，白燕2號和壩莜14號種子發(fā)芽率仍有90%，發(fā)芽指數(shù)為66，而壩莜9號種子發(fā)芽率只有60%，發(fā)芽指數(shù)為48.45[3]。此外，本試驗中，老化處理還導(dǎo)致4份藜麥種子材料的平均發(fā)芽時間和老化指數(shù)表現(xiàn)出不同程度的升高變化趨勢(表2和圖4)，隴藜4號種子平均發(fā)芽時間和老化指數(shù)從老化第0.5天開始顯著升高，至老化第3天時達最大，而隴藜1號種子老化指數(shù)從老化第3天才開始顯著升高，至老化第7天達最大，表明隴藜1號和隴藜4號種子耐老化能力不同，老化后發(fā)芽率下降程度也不同。這一現(xiàn)象可以用朱世楊等[22]提出的種子耐老化能力具有較高遺傳性來解釋，表明不同品種(系)的種質(zhì)因遺傳物質(zhì)存在差異而具有不同耐老化能力。

老化法是研究種子耐貯藏性的重要途徑，可以較好地反映長期貯藏后種子活力變化狀況，被廣泛應(yīng)用于小麥[23]、大麥(Hordeumvulgare)[24]等種子的耐貯藏和抗老化研究中。有關(guān)水稻種子耐貯藏性研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的種子耐貯藏性存在差異，相比于秈稻，粳稻對老化處理響應(yīng)更敏感[25-26]。本試驗中，根據(jù)不同藜麥種子材料的活力相關(guān)指標(biāo)隸屬函數(shù)平均值綜合評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4份藜麥種子耐貯藏性均隨老化時間延長而減弱；老化3 d時4份藜麥種子耐貯藏性差異最顯著，且隨老化時間延長，隴藜1號的強耐貯藏性表現(xiàn)越明顯(表3)，供試藜麥材料中隴藜1號耐貯藏性最強，隴藜4號耐貯藏性最弱，可將二者作為親本材料培育耐貯藏新種質(zhì)。常志遠[7]采用人工老化方法研究了71個常規(guī)粳稻品種耐貯藏性與種子活力變化，指出老化12 d處理后供試水稻品種間發(fā)芽率差異最大，可用于評價不同品種的耐貯藏性。本試驗中，老化3 d時，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、老化指數(shù)和隸屬函數(shù)平均值在4份藜麥材料之間均差異顯著，可有效鑒定藜麥種質(zhì)的耐貯藏性。

不同藜麥材料的種子活力水平及耐貯藏性均隨老化時間延長而下降。相同老化時間下，隴藜1號種子活力和耐貯藏性最高，而隴藜4號種子活力和耐貯藏性最低，說明種質(zhì)或遺傳特性差異是影響藜麥種子活力和耐貯藏性的重要因素。

4 結(jié) 論

老化3 d處理能夠?qū)㈦]藜1號、隴藜3號、隴藜4號和YL種子區(qū)分開，可較好地評價藜麥種子活力水平和有效鑒定藜麥種質(zhì)的耐貯藏性。藜麥種質(zhì)的耐貯藏性存在較大差異，隴藜1號耐貯藏性最強，隴藜4號耐貯藏性最弱，此結(jié)果可為藜麥耐貯藏新種質(zhì)培育提供有效親本，也可為藜麥耐貯藏性分子機制研究提供材料。