王 玉， 黃 瀟， 郝清玉

(熱帶島嶼生態(tài)學教育部重點實驗室，海南省熱帶動植物生態(tài)學重點實驗室，海南師范大學生命科學學院， ?？?571158)

種子老化是自然界的普遍現(xiàn)象，將導致發(fā)芽率、活力、生活力降低，抑制種胚正常發(fā)育以及幼苗生長[1-2]。種子老化是一個逐漸發(fā)生的過程，一旦成熟，即開始走向老化，而且這一過程是不可逆的[3]。種子老化按發(fā)生方式的不同可以分為自然老化和人工老化等[4]。人工老化是通過高溫、高濕法加速供試種子生理生化劣變，從而更直接、迅速地考察和判定其老化特性[5-6]。自然老化所需時間較長，人工老化時間較短并且可以控制，人工老化效果較好，與種子的自然老化相吻合，故常用人工老化代替自然老化來對種子活力進行研究[7]，但李穩(wěn)香和顏啟傳[8]對雜交水稻自然老化種子與人工老化種子性能差異研究表明，雜交水稻的人工老化與自然老化機制有所不同，表現(xiàn)出細胞膜受損程度、發(fā)芽率、生長性能、植株高度、生育期等有所差異。種子老化速率受溫度、濕度、水分、鹽等環(huán)境因素的影響[7]，并且高溫和高濕共同作用的結果比單一作用更強[4]。種子老化與貯藏環(huán)境相關[9-10]，如果貯藏條件適宜，老化進程較慢，若惡劣，則會加速衰老和劣變[11]。種子也是多種有益菌和病原菌的傳遞載體[12]，在高溫、高濕環(huán)境中，種子攜帶的微生物多樣性更加豐富[13]，若保存條件不佳，會因有害微生物的活動而引起種子生活力的降低和喪失[14-15]，從而加速種子老化。除環(huán)境和微生物影響種子老化外，種子的生物學特性也是決定其抗老化能力的主要因素，如：高溫(45±1)℃、高濕(95%相對濕度)，96 h老化后，3個大豆品種均無發(fā)芽能力，而綠豆和紅小豆所有品種的發(fā)芽率在88%以上，仍然具有種用價值[16]。種子老化機理涉及眾多復雜的生理生化反應過程，其中包括：膜脂過氧化，保護酶鈍化，蛋白質降解，相關基因表達紊亂以及核酸降解等生理生化反應[16-18]，質膜完整性降低，內部保護酶系統(tǒng)活性減弱，有毒有害物質累積等[19]。馬元成和王彥龍[7]在種子老化研究進展中將種子老化理論概況為：氧化損傷理論、脂質過氧化模型和“生命速率”氧化理論。

木麻黃(CasuarinaequisetifoliaL.)具有良好抗旱性能[20]，幼齡階段生長迅速，抗風性能強，且耐土壤貧瘠等，因此木麻黃已成為我國華南和東南沿海地區(qū)重要的生態(tài)防護林和用材林樹種，對沿海沙地的植被恢復起到不可替代的作用[21]。但研究發(fā)現(xiàn)，木麻黃林下存在天然更新困難[22-24]，及無法實現(xiàn)天然更新[25]的問題。研究表明，木麻黃種子雨雨量充足，散播時間長，新鮮種子的萌發(fā)率約為50%，但種子雨的平均萌發(fā)率較低(11.31%)[25]，因此，推測木麻黃自然生境種子雨老化可能是影響木麻黃天然更新的因素之一。目前關于種子老化方面的研究很多，但木麻黃種子老化的研究尚未見報道。本研究以木麻黃自然老化和人工老化相結合的方法，探究木麻黃種子老化的特征及其影響因素，以期為種子老化、天然更新障礙等機理提供基礎理論依據(jù)，為木麻黃海防林植被恢復與重建等提供技術支持。

1 試驗地區(qū)概況及研究方法

1.1 試驗區(qū)域概況

試驗區(qū)域位于海南省?？谑泻笪泊甯浇哪韭辄S沿海防護林，東經(jīng)110°26′30.71″，北緯20°02′36.73″，屬于熱帶季風氣候。全年日照時間長，輻射能量大，年平均日照時數(shù)達2 000 h以上，太陽輻射量可達110 000～120 000卡。年平均氣溫24.3 ℃。年平均降水量2 067 mm，年平均蒸發(fā)量1 834 mm，常年風向以東南風和東北風為主，年平均風速3.4 m·s-1。土壤為濱海沙土，土壤貧瘠，土壤pH值為6.1。木麻黃林分密度為1 750株·hm-2，平均胸徑為7.27 cm，平均樹高為9.33 m，凋落物厚度為6.00 cm，郁閉度為0.80，光照度為11 524 lx。

1.2 研究方法

1.2.1木麻黃種子采集及萌發(fā)

老化試驗所用的木麻黃種子于2019年9月種子成熟期采于試驗區(qū)，采集木麻黃新鮮球果，室內晾干后經(jīng)過脫粒凈種、自然干燥后備用。種子萌發(fā)采用紙間法，將各種老化處理的種子均勻置于鋪有雙層充分濕潤濾紙的培養(yǎng)皿(直徑90 mm)中，培養(yǎng)20 d，每日定量向培養(yǎng)皿補充蒸餾水并記錄萌發(fā)的種子數(shù)。萌發(fā)的種子以胚芽或胚根長度長于種子的長度為準。實驗室自然老化和水分反復脅迫老化試驗每皿50粒，木麻黃原生境種子老化試驗每皿30粒，重復3次。

種子抗老化能力用種子發(fā)芽率來表示，相同老化時間，種子發(fā)芽率越低，表明其抗老化能力越差。另外，隨著老化時間的延長，種子發(fā)芽率的變化曲線等同于種子老化的變化曲線。

1.2.2實驗室自然存放條件下種子老化

將試驗用的種子不經(jīng)任何密封或保存處理，直接放置在實驗室內任其自然老化。試驗期間，每周隨機取種一次，用于萌發(fā)試驗，共持續(xù)27周。

1.2.3木麻黃原生境條件下種子老化

為了探究原生境不同微生態(tài)環(huán)境對木麻黃種子老化的影響，分別將木麻黃種子網(wǎng)袋置于林冠、林緣和林窗中的樹上和樹下的木麻黃凋落物中，種子老化的處理方式詳見表1。其中，對照組為實驗室自然條件下存放，探究良好存放條件下種子的自然老化速率；木麻黃原生境種子老化試驗主要模擬種子雨散落到不同微生境的自然老化速率。為了便于老化種子的回收，將試驗種子裝入(7 cm×5.5 cm)100目尼龍網(wǎng)袋中，熱封網(wǎng)袋口，每袋種子不少于200粒，每個試驗組合10袋，共120 袋。每3天從各處理中取回1袋，共取10次。每次取回的種子，每袋隨機分為兩部分，一半種子取回后立刻進行萌發(fā)，另一半水分平衡24 h后進行萌發(fā)。

表1 種子老化實驗處理方式

1.2.4水分反復脅迫條件下種子老化

水分反復脅迫老化是指種子處于干、濕交替條件下對種子老化的影響，其中用30%的聚乙二醇(PEG)溶液浸泡種子來模擬種子干旱脅迫。種子老化處理分為潮濕、干旱和干、濕交替處理，共計6個處理組，其中1個為對照組，不同處理組的處理時間詳見表2。該老化試驗同樣將種子裝入(7 cm×5.5 cm)100目尼龍網(wǎng)袋中，熱封網(wǎng)口，每袋50粒，每個處理3個重復(3袋)，共18袋。老化結束后，將種子水分平衡48 h后，置于30 ℃培養(yǎng)箱進行種子萌發(fā)。

表2 種子老化處理方法

1.2.5數(shù)據(jù)處理及分析

使用Microsoft Excel 2019軟件及SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，Origin 2017軟件制圖。對種子萌發(fā)率等數(shù)據(jù)間差異顯著性使用一般線性模型單變量方差分析(Duncan 多重比較)，差異顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 實驗室條件下自然老化對種子發(fā)芽率的影響

如圖1所示，在實驗室自然存放的條件下，截止到試驗末期(27周)，發(fā)芽率曲線一直呈小幅波動變化，并沒有出現(xiàn)逐漸遞減的變化趨勢。試驗期內，種子發(fā)芽率的變化范圍為42.0%～72.0%，其中最小值出現(xiàn)在第8周，最大值則出現(xiàn)在第10周。發(fā)芽率最小值雖然顯著低于最大值，但發(fā)芽率最小值僅顯著低于其他8個周次的發(fā)芽率，與其他18個周次的發(fā)芽率則無顯著差異；發(fā)芽率最大值也僅顯著高于其他3個周次的發(fā)芽率，與其他23個周次的發(fā)芽率無顯著差異。

2.2 木麻黃原生境條件下自然老化對種子發(fā)芽率的影響

如圖2 a所示，在原生境自然條件下，處理1的種子發(fā)芽率曲線呈緩慢遞減的趨勢，而ck和處理2的種子發(fā)芽率曲線則呈波動變化趨勢，表明ck和處理2種子尚未出現(xiàn)老化跡象。總體來看，掛在樹上的處理1和處理2發(fā)芽率曲線均明顯高于ck，且試驗期內處理1和處理2的平均發(fā)芽率顯著高于ck(p<0.01)。

從圖2 b～圖2 d可知，放置在林下的木麻黃種子，無論是哪種生境條件下，隨著老化時間的延長，其發(fā)芽率均呈快速遞減的趨勢，表明置于林下的木麻黃種子老化迅速。從發(fā)芽率曲線的變化過程可以看出，木麻黃種子的老化可劃分為快速老化(2周內)和緩慢老化(2周后)2個進程。置于凋落物不同層次的種子發(fā)芽率曲線基本上是腐殖質中的位于最上面，凋落物上的位于最下面，凋落物中的則介于兩者中間，表明種子的老化速度是凋落物上>凋落物中>腐殖質中。另外，與林窗和林緣相比，在林冠下凋落物不同層次的種子發(fā)芽率遞減速度較為緩慢，表明林冠下種子老化速度相對較慢。

試驗期內種子各老化天數(shù)的平均發(fā)芽率結果表明(圖3)，懸掛在樹干上的處理1和處理2的發(fā)芽率較高，分別為63.556%和61.500%，顯著高于ck(54.944%)。置于林下不同凋落物層的種子發(fā)芽率顯著低于ck，其中置于林緣中腐殖質層的處理8種子發(fā)芽率最高，為22.5%，顯著高于其他林下處理；置于林窗下凋落物上的處理3的種子發(fā)芽率最低，僅為6.667%，顯著低于其他林下處理組。結果表明，置于林下凋落物上和凋落物中的種子老化速度明顯，且顯著快于ck和樹上的種子。

林下各處理不同老化時間種子平均發(fā)芽率的結果(圖4)表明，置于林下凋落物中3 d的發(fā)芽率與ck無顯著差異(p<0.01)，但隨著老化時間的延長，6、9 d和15 d的發(fā)芽率發(fā)生快速降低，且彼此之間差異顯著，由3 d的53.457%，降為6 d的27.840%，9 d的15.185%和15 d的6.173%。之后，發(fā)芽率發(fā)生小幅波動，并緩慢降低，30 d時降低到2.963%。

2.3 水分反復脅迫對種子發(fā)芽率的影響

從圖5可知，處理組3和處理4的發(fā)芽率較低，分別為15.33%和19.33%，顯著低于ck(32%)，其中處理3和處理4均為水分反復脅迫處理組，分別為：蒸餾水浸泡(8 h)→PEG溶液浸泡(16 h)→蒸餾水浸泡(8 h)→PEG溶液浸泡(16 h)和蒸餾水浸泡(16 h)→PEG溶液浸泡(8 h)→蒸餾水浸泡(16 h)→PEG溶液浸泡(8 h)。處理1、2和處理5與ck的發(fā)芽率則無顯著差異，表明水分反復脅迫會加速木麻黃種子老化，而連續(xù)2 d的水泡(處理1)，2 d的PEG干旱脅迫(處理2)和1次干濕交替脅迫(處理5)均不會顯著加速種子老化。

3 討論與結論

種子老化不僅影響種子萌發(fā)與幼苗生長，也會影響植物生長后期的產(chǎn)量與品質[1-2]。置于實驗室和懸掛在樹上的木麻黃種子自然老化不明顯，而置于木麻黃林下不同凋落物層中的種子則發(fā)生快速老化，其中老化速度為林窗下>林緣下>林冠下，凋落物上>凋落物中>腐殖質中，這充分表明加速木麻黃種子老化的原因是種子所處的微生態(tài)環(huán)境的異質性，其中，水分生態(tài)因子的急劇變化是一個重要原因。無論是室內還是室外原生境，水分生態(tài)因子相對穩(wěn)定的環(huán)境，如ck組、樹上、林冠下和腐殖質層，有利于木麻黃種子保持活力，而林窗-凋落物表層，因水分生態(tài)因子的激烈波動則會顯著加速種子的老化。高溫和木麻黃化感物質對其老化應該沒有什么直接影響，因為木麻黃凋落物浸提液對種子萌發(fā)沒有顯著影響，設定溫度對種子的發(fā)芽率也沒有顯著影響[26]。濕潤環(huán)境對種子老化的影響也很有限，因為最底層腐殖質層的濕度要高于上面凋落物中和凋落物表層，然而發(fā)芽率則相反。在高溫、高濕及各種微生物共同作用下，霉菌的浸染是否會加速種子的老化，尚有待深入研究。

楊彬等[25]對本研究區(qū)木麻黃種子雨時空動態(tài)研究結果表明，每2周收集一次的種子雨平均發(fā)芽率較低，僅11.31%，且種子雨發(fā)芽率出現(xiàn)大幅震蕩波動，最高發(fā)芽率為30.00%，顯著低于同期新鮮種子的發(fā)芽率(58.43%)。兩者之間的差異可以通過本研究種子老化的原因進行解釋，因為種子雨的收集周期與種子快速老化的周期相重合，且種子雨收集網(wǎng)是直接鋪在木麻黃凋落物上的，因此至少有1/2的種子雨已經(jīng)歷了6 d種子老化的快速期，因而種子雨的平均發(fā)芽率才會如此低。種子雨發(fā)芽率出現(xiàn)大幅波動表明木麻黃原生境生態(tài)因子的異質性，尤其是氣溫，晴天-雨天交替變化導致種子老化速度不同，從而影響種子雨發(fā)芽率。

木麻黃種子在經(jīng)反復水分脅迫后種子萌發(fā)率明顯比其他處理組低，其原因是種子萌發(fā)需要吸水，但是反復脅迫使種子吸水被打斷，使種子萌發(fā)受到抑制或發(fā)芽延遲[27]。在短時間內補水即可恢復萌發(fā)，長時間缺少或者水分反復脅迫會降低種子萌發(fā)率，其中水分反復脅迫對種子萌發(fā)率影響最大。海南降雨較為頻繁，氣溫也較高，種子被雨水浸泡后會因為高溫、陽光直射導致水分蒸發(fā)而受到脅迫，致使木麻黃種子老化加速，推測海南的特殊氣候環(huán)境可能是加速木麻黃種子老化的原因。

綜上所述，木麻黃原生境條件下，種子雨若在短時間內因缺少適宜萌發(fā)的環(huán)境而不能萌發(fā)，則會因快速老化而影響其發(fā)芽率，從而影響木麻黃天然更新。