田 雪， 劉 剛， 車 前， 嚴(yán)偉敏， 歐全宏， 時有明

(1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院， 昆明 650500；2.曲靖師范學(xué)院物理與電子信息學(xué)院， 云南 曲靖 655011)

種子活力即種子的健壯度，是種子發(fā)芽和出苗率、幼苗生長的潛勢、植株抗逆能力和生產(chǎn)潛力的總和，是種子品質(zhì)的重要指標(biāo)[1]。隨著貯藏時間的延長會發(fā)生種子活力喪失的不可逆變化，因此認(rèn)識種子老化過程中的活力變化，是確保貯藏種子保持較高活力的前提和基礎(chǔ)[2]。老化種子劣變表現(xiàn)為種子變色、內(nèi)部膜系統(tǒng)破壞、逐漸喪失產(chǎn)生與萌發(fā)有關(guān)的激素的能力、發(fā)芽率低、發(fā)育遲緩和抗逆力弱等特點。種子活力是衡量種子老化程度的綜合指標(biāo)[3]，高活力種子具有產(chǎn)量高、抗性強等特點。因此，研究種子老化、種子活力對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重要意義。

測定種子活力及品質(zhì)的傳統(tǒng)方法主要依據(jù)氣味、顏色、形狀和表面紋理[4]等屬性進行辨別，存在一定的主觀性。其余方法包括標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗、酶活性測定等化學(xué)方法、氣相色譜法、機器視覺技術(shù)、近紅外光譜技術(shù)、高光譜成像技術(shù)和電子鼻探測技術(shù)[4-10]等。但是這些方法在應(yīng)用過程中都存在一定的缺點，如化學(xué)檢測方法耗時且具有破壞性；氣相色譜法操作繁瑣且成本高；機器視覺技術(shù)對測量環(huán)境要求高、計算量大且檢測正確率低；近紅外光譜技術(shù)易受其他環(huán)境因素干擾且建模工作量大；高光譜成像技術(shù)分析處理過程中數(shù)據(jù)冗余量大，繁瑣且模型構(gòu)建復(fù)雜；電子鼻探測技術(shù)需重復(fù)建模且工作量大[11]。因此，建立簡便、有效的種子活力檢測方法非常必要。

FT-IR通過光與物質(zhì)的相互作用，反映出物質(zhì)的分子官能團振動信息，依據(jù)分子振動揭示樣品的結(jié)構(gòu)成分，具有快速、簡便和低成本的特點，已應(yīng)用于大豆、水稻、玉米和小麥等[12-14]農(nóng)作物種子的檢測，但現(xiàn)階段對老化后谷子種子活力的相關(guān)研究鮮見報道。由于種子自然老化所需時間較長，為了縮短老化時間、提高效率，采用人工老化處理，模擬老化后種子的生命狀態(tài)。本研究以龍山小米種子(濟谷25號和濟谷1165號)為材料，采用高溫高濕法對其進行人工加速老化處理，測定其活力指標(biāo)，利用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)結(jié)合統(tǒng)計分析方法對老化處理后谷子種子的萌發(fā)能力進行初步研究，以期建立一種簡便、快速研究種子活力的有效方法。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

供試谷子為2020年收獲的龍山小米種子(濟谷25號和濟谷1165號)，購于山東省龍山貢米基地。

1.2 儀器設(shè)備

杭州綠博儀器有限公司的LH-150 S型人工老化箱，邦西儀器科技上海有限公司的GZX-350 B型光照培養(yǎng)箱。美國Perkin Elmer公司的Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀，配備DTGS探測器，動態(tài)光譜使用的溫度控制儀型號為Eurotherm公司的SYD-TC-01型溫控儀，壓片使用YP-2壓片機。

1.3 谷子種子老化處理的設(shè)置

設(shè)置高溫(41 ℃)、高濕(相對濕度95%)的環(huán)境對谷子種子進行人工老化處理，處理時間分別為0、2、4、6、8、10 d，以0 d(未經(jīng)老化處理)為對照(ck)，然后按照所需處理時間取出處理種子，并置于真空干燥箱45 ℃條件干燥12 h備用。

1.4 谷子種子老化處理后的發(fā)芽試驗

選取不同老化時間干燥后的種子，用3%的次氯酸鈉(NaClO)進行消毒，之后用蒸餾水充分沖洗，再用濾紙吸干種子表皮的水分，均勻放入鋪有2層濾紙的發(fā)芽盒內(nèi)，每盒100粒，3次重復(fù)。將發(fā)芽盒放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)(溫度設(shè)置26 ℃)，光照時長12 h，并早晚噴灑蒸餾水以保證其正常萌發(fā)，每天記錄發(fā)芽數(shù)。培養(yǎng)7 d時完成發(fā)芽試驗，并測量幼苗長度。種子干燥待測。

1.5 谷子種子活力相關(guān)特性指標(biāo)的測定

發(fā)芽勢(%)=(4 d發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(7 d發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt；

活力指數(shù)=S×GI；

式中：Dt為發(fā)芽日數(shù)；Gt為與Dt對應(yīng)的發(fā)芽數(shù)；S為幼苗生長量(長度)；GI為發(fā)芽指數(shù)。

1.6 光譜測量與數(shù)據(jù)處理

利用溴化鉀(KBr)壓片法進行紅外光譜檢測，樣品與KBr比約為1∶15。紅外光譜儀實驗參數(shù)設(shè)置：分辨率為4 cm-1，波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為16次；動態(tài)光譜測溫范圍為50～120 ℃，每隔10 ℃測試一次動態(tài)紅外光譜，升溫速率每分鐘升溫2 ℃。

采用OMNIC 8.2軟件對實驗所得原始光譜數(shù)據(jù)進行基線校正、5點平滑、平均譜圖、縱坐標(biāo)歸一化和導(dǎo)數(shù)譜圖等預(yù)處理；運用Origin 9軟件對光譜數(shù)據(jù)處理、繪圖，以及利用其Peak Analyzer功能進行曲線擬合分析；利用Spectrum 10.03軟件對動態(tài)光譜數(shù)據(jù)進行基線修正處理，采用清華大學(xué)分析中心開發(fā)的TD 4.2軟件對動態(tài)光譜進行二維相關(guān)紅外光譜處理分析；用The Unscrambler X 10.4軟件以原始光譜數(shù)據(jù)進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工老化處理對谷子種子活力指標(biāo)的影響

由表1可以看出，2個品種谷子種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈先升后降的趨勢，這可能是由于短期的高溫高濕處理打破了貯藏種子的休眠期，獲得了更為有利的萌發(fā)條件，提高了種子活力；而隨老化時間延長，種子有毒有害物質(zhì)累積以及內(nèi)部保護酶活性減弱，導(dǎo)致種子加速劣變，說明在老化過程中，可能同時存在休眠解除和老化劣變兩種相反作用力，它們共同決定了種子活力的變化[15]。短期(2～4 d)老化處理可提高2個品種種子的各項活力指標(biāo)，在老化處理2 d時達到最高，但隨老化時間的增加，均有不同程度的降低，其中活力指數(shù)變化幅度明顯大于其他活力指標(biāo)，說明活力指數(shù)對種子老化反應(yīng)更敏感，能更好地反映種子活力變化[16]。濟谷1165號種子活力下降速率明顯低于濟谷25號，說明不同品種的谷子種子抗老化能力存在差異，濟谷1165號種子抗老化能力更強。

表1 人工老化處理對谷子種子活力指標(biāo)的影響

2.2 谷子種子的原始紅外光譜分析

濟谷25號和濟谷1165號種子在不同老化時間處理后萌發(fā)的原始紅外光譜如圖1所示，圖中各光譜均為10個樣本光譜的平均譜圖?？梢钥闯觯煌匣瘯r間處理的這2個品種種子的原始紅外光譜整體相似。表2列出了光譜的主要吸收峰及其歸屬，反映谷子種子的主要成分為淀粉、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。圖2為兩種谷子種子在老化處理后萌發(fā)種子的幾個特征吸收峰強度比，各峰強比均來自10個樣本光譜的平均譜圖。可以看出，兩種谷子種子A858/A1 022和A1 653/A1 022的比值均隨老化時間的增加而增加，表明其淀粉和蛋白質(zhì)的相對含量隨老化時間的增加而發(fā)生變化；A1 082/A1 022和A1 745/A1 022的比值均隨老化時間的增加而減小，表明其淀粉和脂肪的相對含量隨老化時間的增加而變化。

表2 谷子種子的主要特征峰及歸屬

2.3 谷子種子的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜分析

二階導(dǎo)數(shù)光譜可提高原始光譜分辨率，能夠顯示更多的信息，對兩種谷子種子樣品在光譜范圍1 800～800 cm-1進行二階導(dǎo)數(shù)處理，如圖3所示?？梢钥闯?，濟谷25號和濟谷1165號谷子種子在多糖區(qū)域(1 200～950 cm-1范圍)均出現(xiàn)7個峰，隨著老化時間的增加，1 053 cm-1和960 cm-1附近的吸收峰強度逐漸增強，1 126cm-1和1 020 cm-1附近的吸收峰強度逐漸減弱，且1 020 cm-1和1 158 cm-1處的峰向較低波數(shù)移動，1 080 cm-1處的峰向較高波數(shù)移動，表明不同老化時間處理的萌發(fā)種子的多糖結(jié)構(gòu)和含量可能發(fā)生了變化。1 800～1 600 cm-1區(qū)域主要是酰胺Ⅰ帶C=O伸縮振動和飽和脂肪酸酯C=O伸縮振動的貢獻，由該區(qū)域的二階導(dǎo)數(shù)光譜觀察到兩種谷子種子隨著老化時間的增加，1 662、1 633、1 604 cm-1附近的吸收峰強度逐漸減弱，且1 743 cm-1處的峰向較高波數(shù)藍移，表明不同老化時間處理的萌發(fā)種子的蛋白質(zhì)和脂肪結(jié)構(gòu)和含量可能發(fā)生了變化。

2.4 谷子種子的二維紅外光譜分析

二維相關(guān)紅外光譜能獲取微弱和重疊的特征光譜信息，進一步提高了紅外譜圖的分辨率[20]。以溫度作為外界微擾，得到樣品的二維相關(guān)紅外光譜.從二維相關(guān)光譜圖中可以看出，不同老化時間的2個品種萌發(fā)種子在1 340～820 cm-1(圖4)、1 800～1 350 cm-1(圖5)范圍內(nèi)自動峰的數(shù)目、強度和位置在老化過程中均存在明顯的差異。

圖4為不同老化時間處理后2個品種的萌發(fā)種子在1 340～820 cm-1范圍的二維相關(guān)紅外光譜，這個范圍主要為多糖振動區(qū)[20]，其自動峰的情況如表3所示。可以看出，濟谷25號種子(圖4 a)隨老化時間的增加，所有自動峰強度呈逐漸減弱的趨勢，其中979 cm-1處峰強先增強后減弱，而1 070 cm-1處峰強先減弱后增強，849 cm-1處自動峰在老化處理2 d后出現(xiàn)，同時1 269 cm-1和1 289 cm-1處自動峰分別在老化8 d和4 d后消失，但出現(xiàn)了1 279 cm-1和1 314 cm-1處的自動峰。濟谷1165號種子(圖4 b)隨老化時間的增加，所有自動峰強度呈先增強后減弱的趨勢，同時最弱自動峰向低波數(shù)移動，次強峰向高波數(shù)移動，978 cm-1處峰強先增強后減弱，1 070 cm-1處峰強先減弱后增強，1 291 cm-1處自動峰在老化6 d后消失，但在老化2 d后出現(xiàn)了1 049 cm-1附近自動峰。結(jié)果顯示，不同老化時間處理后2個品種的萌發(fā)種子最強自動峰的位置在老化2～4 d時從1 070 cm-1附近移動到979 cm-1附近，但隨著老化時間的增加，又移動到1 070 cm-1附近，這些變化可能與這2個品種的谷子種子在老化過程中糖類物質(zhì)的動員有關(guān)。

表3 不同老化時間的萌發(fā)種子1 340～820 cm-1范圍內(nèi)二維相關(guān)紅外光譜的自動峰

圖5為不同老化時間處理后2個品種的萌發(fā)種子在1 800～1 350 cm-1范圍的二維相關(guān)紅外光譜，這個范圍為蛋白質(zhì)、多糖和脂類振動區(qū)[20]，其自動峰的情況如表4所示?？梢钥闯觯瑵?5號種子(圖5 a)隨老化時間的增加，所有自動峰強度呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢，其中最強自動峰由1 639 cm-1處移動到1 641 cm-1處最后移動到1 639 cm-1附近，1 509 cm-1處自動峰在老化8 d后消失，同時在老化10 d后出現(xiàn)1 788 cm-1處自動峰，1 729、1 710 cm-1和1 529 cm-1處自動峰在老化4 d后出現(xiàn)，但老化6 d后消失。濟谷1165號種子(圖5 b)隨老化時間的增加，所有自動峰強度呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，同時最弱自動峰向高波數(shù)移動，次強峰向低波數(shù)移動，最強自動峰由1 639 cm-1附近變?yōu)? 648 cm-1附近，最后變?yōu)? 639 cm-1附近，1 758 cm-1和1 397 cm-1處自動峰在老化2～4 d后消失，但老化處理6 d后又出現(xiàn)。這些變化可能與這2個品種種子在老化過程中蛋白質(zhì)、多糖和脂類營養(yǎng)物質(zhì)的動員有關(guān)。

表4 不同老化時間的萌發(fā)種子1 800～1 350 cm-1范圍內(nèi)二維相關(guān)紅外光譜的自動峰

2.5 曲線擬合分析

曲線擬合基于Lorentzian-Gaussian函數(shù)對特定波數(shù)范圍的FT-IR光譜進行疊加峰分離擬合的分析方法，能簡單、快速地分離出光譜中重疊的子峰，并獲得子峰的面積比例，從而估算出子峰的化學(xué)成分的相對含量。當(dāng)擬合結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R2值大于0.999時，則結(jié)果有效可信[22]。淀粉是一種多糖，是谷子種子中主要存在的物質(zhì)。植物可以通過光合作用把CO2和H2O轉(zhuǎn)化成淀粉，貯存于器官組織中。在一定溫度和酶的作用下，水解為可溶性糖(葡萄糖、麥芽糖等)，為老化過程中種子的呼吸作用提供能量[23]，且一般認(rèn)為可溶性糖的含量隨老化時間的延長而升高，與種子活力呈負(fù)相關(guān)[24]。因此選取老化處理后的濟谷25號和濟谷1165號萌發(fā)種子在1 200～950 cm-1(多糖區(qū)域)范圍的原始紅外光譜進行曲線擬合分析，結(jié)果如圖6所示。同時，計算多糖特征峰(1 022、1 046 cm-1和1 157 cm-1)的峰面積所占的百分比(表5)，分析其多糖含量的變化趨勢和特點。

表5 不同老化時間的萌發(fā)種子特征峰峰面積的相對面積比

2.6 主成分分析

主成分分析(PCA)是將多個變量通過線性變換以選出較少個數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計分析方法。選取濟谷25號和濟谷1165號谷子種子在1 800～800 cm-1范圍的紅外光譜進行主成分分析，得到主成分得分圖與主要成分(PC-1、PC-2)載荷圖，如圖7所示。濟谷25號萌發(fā)種子(圖7 a1)中PC-1占總方差貢獻率的78%，PC-2占總方差貢獻率的16%，2個主成分累積貢獻率達94%；老化的濟谷1165號萌發(fā)種子(圖7 b1)中PC-1占總方差貢獻率的90%，PC-2占總方差貢獻率的6%，2個主成分累積貢獻率達96%。可以看出，6種不同老化時間的2個品種種子分別聚合在6個不同的區(qū)域，并且老化0～4 d和老化6～10 d的分別各自聚在一起，與人工老化處理對活力指標(biāo)的影響結(jié)果相一致，即短期老化處理(2～4 d)可以提高種子活力，老化6 d后種子活力明顯下降。同時，通過圖7 a2、圖7 a3、圖7 b2和圖7 b3的載荷圖，可以看出分別在1 066、1 602 cm-1和1 734 cm-1附近，979 cm-1和1 632 cm-1附近，1 066 cm-1和1 086 cm-1附近，977 cm-1和1 748 cm-1附近出現(xiàn)較強的吸收峰，主要對應(yīng)淀粉、蛋白質(zhì)和飽和脂肪酸的伸縮振動吸收峰。由此推斷老化種子中脂肪、蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)含量的差異是主成分判別的主要依據(jù)，同時在區(qū)分種子的不同老化時間中為主要貢獻因子。

3 結(jié) 論

采用高溫高濕法對種子進行人工老化處理，將傅里葉變換紅外光譜與統(tǒng)計分析方法相結(jié)合，分析研究濟谷25號和濟谷1165號谷子種子在不同老化時間處理后的萌發(fā)種子活力變化規(guī)律及貯藏物質(zhì)的情況。結(jié)果顯示，種子活力在老化過程中呈先增強后減弱的趨勢，短期(2～4 d)老化處理可以提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，但隨老化時間的延長，都有所下降，其中濟谷25號種子活力下降趨勢明顯，說明在同樣的老化條件下，不同谷子品種的抗老化能力存在一定差異，濟谷1165號谷子種子的抗劣變能力和貯藏性較好。紅外光譜顯示，谷子種子主要由淀粉、蛋白質(zhì)脂質(zhì)和組成，吸收峰強度比A858/A1 022和A1 653/A1 022的比值均隨老化時間的增加而增加，A1 082/A1 022和A1 745/A1 022的比值均隨老化時間的增加而減小，說明蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪的相對含量隨老化時間的增加而變化。在1 800～800 cm-1范圍的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜顯示，不同老化時間處理的萌發(fā)種子隨老化時間的增加，在1 662、1 633、1 604、1 126、1 053、1 020、960 cm-1處的峰強存在明顯差異，1 743、1 158、1 080、1 020 cm-1處的峰位發(fā)生變化，表明其多糖、脂肪和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及含量可能發(fā)生變化。不同老化時間處理的萌發(fā)種子在1 340～820 cm-1和1 800～1 350 cm-1范圍的二維相關(guān)紅外光譜自動峰數(shù)目、最強自動峰和弱自動峰的位置、強度隨老化時間的增加均發(fā)生明顯變化，這些變化可能與種子在老化過程中糖類、蛋白質(zhì)和脂類營養(yǎng)物質(zhì)的動員有關(guān)。通過對1 200～950 cm-1范圍進行曲線擬合分析并計算相應(yīng)的特征峰峰面積百分比，結(jié)果顯示多糖相對含量隨老化時間的延長總體上呈現(xiàn)增加趨勢。經(jīng)不同老化時間處理的萌發(fā)種子在1 800～800 cm-1范圍的主成分分析結(jié)果顯示，脂肪、蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)含量的差異是主成分判別的主要依據(jù)，老化0～4 d和老化6～10 d的樣品數(shù)據(jù)聚在兩側(cè)且分別各自聚在一起，與人工老化處理對活力指標(biāo)的影響結(jié)果相一致，可以識別不同老化時間的谷子種子。研究表明，紅外光譜結(jié)合統(tǒng)計分析方法是研究老化種子活力的一種快速、簡便的有效方法。