方啟翔，羅 楠，陳 煒，張 盼，吳大鵬，曾 津

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061；2．昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科，云南昆明 654100)

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是一類具有免疫應(yīng)答無(wú)能和免疫抑制兩大特征的CD4+T細(xì)胞，可通過(guò)抑制效應(yīng)性T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及B細(xì)胞的免疫反應(yīng)下調(diào)機(jī)體對(duì)外來(lái)或自身抗原的應(yīng)答水平以維持機(jī)體免疫耐受[1]。Treg對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用具有兩面性，一方面對(duì)于維持宿主自我耐受很重要；另一方面在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中Treg對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的抑制被證明可抑制抗腫瘤免疫[2]。因此，在腫瘤的免疫治療中輔以針對(duì)Treg的治療方法或可達(dá)到增強(qiáng)療效的目的?，F(xiàn)有研究證實(shí)，在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌和卵巢癌等腫瘤中Treg數(shù)量升高往往標(biāo)志著預(yù)后不良[3]。有趣的是，也有研究發(fā)現(xiàn)Treg在腫瘤組織富集時(shí)可影響相關(guān)腫瘤進(jìn)程，進(jìn)而改善腫瘤患者預(yù)后[4]。目前認(rèn)為這一矛盾可能由于腫瘤類型的差異、瘤內(nèi)Treg細(xì)胞在表型和功能上存在異質(zhì)性、Treg的分布模式(癌巢或基質(zhì))以及Treg與腫瘤中某些免疫亞群浸潤(rùn)的模式[5]。

近年來(lái)隨著研究的深入,免疫治療在泌尿系腫瘤治療中的地位越來(lái)越高，Treg細(xì)胞與泌尿系腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系也受到關(guān)注?，F(xiàn)有研究多表明Treg細(xì)胞在腎癌、前列腺癌中的浸潤(rùn)預(yù)示著不良預(yù)后，而在膀胱癌則尚存爭(zhēng)議。本文基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Treg細(xì)胞在泌尿系腫瘤中的分布及預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，探討其在腫瘤預(yù)后、免疫治療中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料獲取我們從癌癥和腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)下載了腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)腫瘤樣本539例和正常樣品72例、膀胱癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)腫瘤樣本411例和正常樣品19例、前列腺癌(prostate adenocarcinoma，PRAD)腫瘤樣本489例和正常樣品51例患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息(表1)，本文下載的所有數(shù)據(jù)截止2020年11月15日。

1.2 免疫細(xì)胞矩陣的獲取在R語(yǔ)言中利用limma包進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，提取腫瘤組織及正常組織mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，應(yīng)用Perl語(yǔ)言整合CIBERSORT開(kāi)源代碼(參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]，運(yùn)用反卷積算法開(kāi)發(fā)，可基于標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)估算組織的細(xì)胞組成，量化細(xì)胞類型的豐度)來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤及癌旁組織中免疫細(xì)胞的豐度，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整理篩除，獲得樣本與免疫細(xì)胞的矩陣數(shù)據(jù)。并利用vioplot包對(duì)整理后的矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，繪制3種腫瘤與癌旁組織內(nèi)22種免疫細(xì)胞的小提琴圖。

1.3 Treg細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞的相關(guān)性為了探討Treg細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞的相關(guān)性，我們利用corrplot包對(duì)得到的腫瘤樣本免疫細(xì)胞矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 Treg細(xì)胞對(duì)腫瘤預(yù)后的影響利用Survival包完成Treg細(xì)胞豐度與患者預(yù)后的相關(guān)性計(jì)算并繪制生存曲線，而后對(duì)T分期與Treg細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5 Treg細(xì)胞與腫瘤中關(guān)鍵通路的相關(guān)性研究表明炎性環(huán)境與Treg細(xì)胞有關(guān)，而干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的水平可模擬炎性微環(huán)境[7]，因此我們進(jìn)一步研究3種腫瘤中Treg浸潤(rùn)程度是否與IFN-γ有關(guān)。我們通過(guò)ssGSEA自定義Hallmark(C2)基因集富集分析計(jì)算IFN-γ相關(guān)通路得分，并計(jì)算Treg與IFN-γ通路的相關(guān)性。另外，Treg細(xì)胞通過(guò)整合素αvβ8激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)，這一機(jī)制是Treg細(xì)胞抑制體內(nèi)CD4+T細(xì)胞增殖的重要機(jī)制[8]。我們通過(guò)ssGSEA使用GO(BP)進(jìn)行基因集富集分析獲得樣本整合素信號(hào)通路得分情況。

2 結(jié) 果

2.1 基線資料從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站下載腎透明細(xì)胞癌、膀胱癌、前列腺癌轉(zhuǎn)錄組及臨床資料(主要有性別、年齡、生存時(shí)間、生存狀態(tài)及TNM分期)，參見(jiàn)表1。

表1 TCGA中腎透明細(xì)胞癌、膀胱癌、前列腺癌患者的基線資料 [例(%)]

2.2 22種免疫細(xì)胞在腫瘤及癌旁組織中的分布與正常組織相比，腎透明細(xì)胞癌組織中的Treg細(xì)胞浸潤(rùn)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002，圖1A)。膀胱癌組織中的Treg細(xì)胞浸潤(rùn)水平與正常組織相比無(wú)顯著差異(P=0.28，圖1B)，前列腺癌組織中Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)水平高于正常組織(P=0.011，圖1C)。

圖1 腎透明細(xì)胞癌(A)、膀胱癌(B)、前列腺癌(C)中Treg的浸潤(rùn)水平

2.3 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性我們利用corrplot包對(duì)得到的腫瘤樣本免疫細(xì)胞矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析(P<0.05，圖2)。結(jié)果顯示：腎透明細(xì)胞癌組織中Treg與CD8+T細(xì)胞(r=0.25)、濾泡輔助性T細(xì)胞(r=0.25)呈弱的正相關(guān)，而與M2巨噬細(xì)胞(r=-0.30)、未活化肥大細(xì)胞(r=-0.23)、未活化CD4+記憶性T細(xì)胞(r=-0.28)呈弱的負(fù)相關(guān)。膀胱癌組織中Treg與幼稚B細(xì)胞(r=0.2)呈弱的正相關(guān)，而與活化CD4+記憶性T細(xì)胞(r=-0.27)呈弱的負(fù)相關(guān)。前列腺癌組織中Treg與CD8+T細(xì)胞(r=0.46)、記憶性B細(xì)胞(r=0.29)呈正相關(guān)，而與未活化肥大細(xì)胞(r=-0.29)、漿細(xì)胞(r=-0.24)呈弱的負(fù)相關(guān)。

圖2 腎透明細(xì)胞癌(A)、膀胱癌(B)、前列腺癌(C)中22種免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

2.4 Treg細(xì)胞對(duì)預(yù)后的影響及其與腫瘤T分期的相關(guān)性Treg在腎透明細(xì)胞癌中高密度浸潤(rùn)與低生存率存在顯著相關(guān)性(P=0.01，圖3A)，Treg的浸潤(rùn)與腫瘤組織大小相關(guān)(P=0.002，圖3D)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在膀胱癌中卻得到了相反的結(jié)果，Treg在膀胱癌中高密度浸潤(rùn)與高生存率存在顯著相關(guān)性(P=0.045，圖3B)，但其浸潤(rùn)密度與T分期無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.905，圖3E)。Treg的浸潤(rùn)程度似乎與前列腺癌患者的生存率和T分期無(wú)明顯相關(guān)性(圖3C、F)。

2.5 Treg細(xì)胞與腫瘤中的IFN-γ相關(guān)通路的相關(guān)性以及整合素信號(hào)通路得分我們研究了樣本中Treg的豐度分布、Treg細(xì)胞與IFN-γ相關(guān)通路的相關(guān)性以及各樣本中整合素信號(hào)通路激活的情況(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌、膀胱癌中Treg的豐度分布大致相同，前列腺癌樣品中Tregs豐度偏低。Treg與IFN-γ相關(guān)通路在腎透明細(xì)胞癌存在較弱正相關(guān)，膀胱癌、前列腺癌中存在著較弱負(fù)相關(guān)(|r|<0.2，P<0.05)，這一結(jié)果提示造成Treg在3種腫瘤中表現(xiàn)不一致可能與炎性微環(huán)境的差異有關(guān)。整合素信號(hào)通路得分情況在3種腫瘤中大致相似。

A：腎透明細(xì)胞癌；B：膀胱癌;C：前列腺癌。各圖左上：豐度；左下：與IFN-γ相關(guān)通路的相關(guān)性；右下：整合素信號(hào)通路表達(dá)。圖4 Treg細(xì)胞在腫瘤樣本中的豐度、Treg細(xì)胞與IFN-γ相關(guān)通路的相關(guān)性及腫瘤樣本中整合素信號(hào)通路表達(dá)

3 討 論

程序性死亡受體1(programmed death ligand-1，PD-1)是T細(xì)胞上的一種蛋白，可與腫瘤或正常細(xì)胞上的程序性死亡配體1(programmed cell death 1 ligand 1,PDL1)結(jié)合，導(dǎo)致T細(xì)胞功能下調(diào)，腫瘤可通過(guò)這一機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的清除[9-10]。免疫檢查點(diǎn)阻斷劑(immune checkpoint blockade,ICB)可通過(guò)阻止腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞間的相互作用，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫。但也帶來(lái)了新的問(wèn)題，有文獻(xiàn)報(bào)道ICB對(duì)PD-1的阻斷可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致抗腫瘤免疫的抑制，不僅降低了抗PD-1的作用，甚至引起腫瘤的超進(jìn)展(hyperprogressive disease,HPD)[11]。因此，對(duì)于特定腫瘤消耗腫瘤微環(huán)境中的Treg細(xì)胞對(duì)于改善免疫治療的療效至關(guān)重要。

有研究表明Treg在腎癌中的浸潤(rùn)不僅預(yù)示著不良結(jié)局，還與術(shù)后局部復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)[12]，前列腺癌患者接受的雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy，ADT)會(huì)造成Treg增加，降低ADT治療效果[13]。MALIN等[14]發(fā)現(xiàn)在體外Foxp3+Treg能夠抑制M2巨噬細(xì)胞以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2的產(chǎn)生，與膀胱癌良好預(yù)后相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)Treg在腎透明細(xì)胞癌組織中高浸潤(rùn)預(yù)示著不良預(yù)后，而在膀胱癌中高浸潤(rùn)則代表了預(yù)后良好，這一結(jié)果與上述報(bào)道一致。既往研究表明Treg受到炎性環(huán)境調(diào)控，為了明確Treg在腎透明細(xì)胞癌和膀胱癌中出現(xiàn)相反的預(yù)后結(jié)局是否與炎性環(huán)境相關(guān)，我們進(jìn)一步研究了腫瘤組織中IFN-γ與Treg的關(guān)系，結(jié)果顯示腎癌中IFN-γ與Treg正相關(guān)，而在膀胱癌中則是負(fù)相關(guān)。有研究表明炎性環(huán)境下DBC1基因可通過(guò)Caspase 8-p38信號(hào)通路介導(dǎo)Foxp3蛋白的減少及Treg功能的降低[15]，故我們認(rèn)為Treg在腎透明細(xì)胞癌和膀胱癌中的不同預(yù)后表現(xiàn)可能是由于所處的炎性環(huán)境不同，這也可能是造成膀胱癌中Treg細(xì)胞浸潤(rùn)水平與正常組織相比無(wú)顯著差異的原因。

現(xiàn)今，Treg在腫瘤中的作用仍然存在著爭(zhēng)議，這可能與炎性環(huán)境、Treg亞型、腫瘤分期有關(guān)，需要更多研究來(lái)揭示。我們基于TCGA評(píng)估了Treg在泌尿系腫瘤中的表現(xiàn)并對(duì)一些重要的通路進(jìn)行了分析。我們的研究尚存在一些局限性，現(xiàn)有研究多使用腫瘤患者的外周血細(xì)胞及腫瘤組織得到Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，我們采用算法估算可能存在一定誤差；我們從TCGA中獲得的樣本缺乏治療數(shù)據(jù)，不能排除不同治療方式引起的混雜。目前Treg在腫瘤中的作用機(jī)制正在日益清晰，并在聯(lián)合放療、化療、免疫治療中發(fā)揮重要作用[16]。深入挖掘其機(jī)制并將其作為腫瘤治療的一種手段是十分有意義的。

總之，利用生物信息學(xué)對(duì)Treg在腎透明細(xì)胞癌、膀胱癌、前列腺癌中的浸潤(rùn)情況和對(duì)其預(yù)后的影響進(jìn)行初步評(píng)估，提示Treg在腫瘤中的作用可能受到特定類型癌癥的影響，針對(duì)Treg的治療是一種有潛力的抗腫瘤方式。