湛游洋, 李曉晶

(中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所 中國科學(xué)院高性能合成橡膠及其復(fù)合材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長春 130022)

0 引 言

自1983年Gd-DTPA成為第一個(gè)正式進(jìn)入臨床的磁共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)造影劑以來，人們對造影劑的需求量逐年增加[1-2]。目前，全球每年消耗的釓類造影劑已超過30噸，并且還在不斷地增長。由于造影劑的基本要求較多、體內(nèi)作用機(jī)制復(fù)雜，雖然處于研發(fā)狀態(tài)的種類及數(shù)量較多，但能夠在臨床上應(yīng)用的數(shù)量極為有限[3-6]。目前，在臨床應(yīng)用的MRI造影劑中，除了MultiHancey?和Evosit?具有一定的選擇性外，其他造影劑屬于細(xì)胞外液間隙造影劑，不具備靶向成像功能。此外，它們的弛豫效率集中在3～5 mmol-1·L·s-1，還有待于進(jìn)一步提高。因此，開發(fā)具有靶向成像功能、高效低毒的MRI造影劑是一個(gè)重要的研究方向[7-11]。

根據(jù)MRI造影劑的基本原理及SBM(Solomon-Bloembergen-Morgan)方程[12-13]，增大造影劑的分子尺寸從而延長旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間(τR)是提高弛豫效率的一個(gè)重要方法。聚氨基酸是一種常用的大分子藥物載體，具有與蛋白質(zhì)類似的酰胺結(jié)構(gòu)，毒性較低、生物相容性能極佳，并且可以在機(jī)體內(nèi)降解生成無毒的小分子氨基酸，最終被機(jī)體吸收、利用。聚氨基酸還可通過側(cè)鏈功能化來賦予其更多的性能[14-15]。因此，利用聚氨基酸為載體合成的大分子MRI造影劑既可以滿足高弛豫性能、靶向成像的要求，又可以最大程度地降低藥物毒性與用藥風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，甘氨酸還可通過作用于細(xì)胞膜上的甘氨酸受體(GlyR)防止枯否細(xì)胞過度激活，從而對多種原因引起的肝損害起明顯的抑制作用。

本文選擇天門冬氨酸和甘氨酸通過熱縮聚反應(yīng)制備了大分子聚氨基酸載體，利用乙二胺對聚氨基酸的側(cè)鏈進(jìn)行改性，與小分子的MRI造影劑Gd-DOTA連接，合成大分子造影劑AGN-DOTA-Gd。從弛豫性能、大鼠體內(nèi)成像效果和急性毒性等多個(gè)方面對合成的造影劑進(jìn)行了綜合評價(jià)。結(jié)果表明，AGN-DOTA-Gd是一種潛在的高效肝臟靶向大分子MRI造影劑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

采用Bruker Avance 600型核磁共振譜儀和Bruker Vertex70 型(德國Bruker公司)紅外光譜儀對樣品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，利用Thermo Fisher X Series Ⅱ型(美國Thermo Fisher公司)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)進(jìn)行配合物中釓含量的測試，采用Siemens 3.0T(德國Siemens公司)磁共振成像系統(tǒng)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)。

L-天門冬氨酸、L-甘氨酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)等均為市售分析純試劑。

實(shí)驗(yàn)大鼠購于吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，均為SPF級Wistar大鼠。

1.2 大分子造影劑AGN-DOTA-Gd的合成

將5.32 g L-天門冬氨酸、0.75 g甘氨酸、3mL 85%磷酸混合均勻，混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中反應(yīng)5 h(條件：165 ℃、3.19 kPa)。反應(yīng)產(chǎn)物溶解在60 mL DMF中，用去離子水沉淀，過濾并用大量去離子水洗滌，真空干燥，得到天門冬氨酸-甘氨酸共聚物(AG)。

將1.0 g AG溶解于12 mL DMF中，將乙二胺(12 mL)與DMF(12 mL)的混合液緩慢滴加到AG溶液中，4 ℃條件下磁力攪拌反應(yīng)2.5 h，之后升至室溫并繼續(xù)反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)物在120 mL乙醚-乙醇(V乙醚∶V乙醇=1∶2)混合溶液中沉淀,過濾，用丙酮洗滌，透析后凍干，得到胺化的天門冬氨酸-甘氨酸共聚物(AGN)。

將1.0 g DOTA溶于20 mL去離子水中，加入1.0 g sulfo-NHS和1.0 g EDC·HCl，調(diào)節(jié)pH為5.2，室溫下反應(yīng)1.5 h，得到DOTA活化酯。將1.0 g AGN溶于10 mL去離子水中，滴加到DOTA活化酯中，調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH為7.5～8.5，室溫下反應(yīng)24 h。用半透膜透析，凍干，得到天門冬氨酸-甘氨酸共聚物修飾的DOTA大分子載體(AGN-DOTA)。

按照Gd3+∶AGN-DOTA=1.2∶1(摩爾比)，將GdCl3溶液和AGN-DOTA溶液混合，在室溫下攪拌過夜，除去未反應(yīng)的Gd3+，用葡聚糖凝膠(Sephadex G-25)進(jìn)行純化，得到終產(chǎn)物大分子造影劑AGN-DOTA-Gd。

AG13C NMR譜(DMSO-d6,δ/ppm)：174.00和172.17為天冬酰胺環(huán)中的羰基碳峰，167.88為甘氨酸中的羰基碳峰，47.30和32.02為天冬酰胺環(huán)中的亞甲基碳峰，34.81為甘氨酸部分的羰基碳峰。

1.3 弛豫性能測試

將AGN-DOTA-Gd溶于20%重水中，配制成釓濃度為0.8 mmol·L-1的溶液，采用逐級稀釋法配制 0.4、0.2、0.1和0.05 mmol·L-1的溶液，采用反轉(zhuǎn)恢復(fù)法測其弛豫時(shí)間(T1)。

1.4 動(dòng)物體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)

大鼠體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)在Siemens 3.0 T磁共振成像系統(tǒng)上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)采用多片多回波法，實(shí)驗(yàn)參數(shù)：掃描視野FOV=75 mm2，重復(fù)時(shí)間TR=596 ms，回波時(shí)間TE=18 ms，片厚SD=1.5 mm，片數(shù)為16，像素大小=(0.2×0.2×1.5)mm3。

將10%的水合氯醛(劑量：0.5 mL/100 g體重)腹腔注射，大鼠麻醉后尾靜脈注射合成的造影劑AGN-DOTA-Gd，每10 min觀測一次，連續(xù)觀測90 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用3次實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差表示。

1.5 安全性評價(jià)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞，按每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的造影劑AGN-DOTA-Gd溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入0.5%的噻唑藍(lán)(MTT)溶液，再培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。每孔中加入0.15 mL DMSO，混勻，靜置，用酶標(biāo)儀測量OD490值。細(xì)胞存活率(CV)計(jì)算公式為：

CV(%)=(A實(shí)驗(yàn)/A對照)×100%

(1)

式中：A實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)組OD490值；A對照為對照組的OD490值。

1.5.2 大鼠臟器系數(shù)

將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組注射AGN-DOTA-Gd(0.1 mmol Gd3+·kg-1)，對照組注射相同劑量的生理鹽水。分別在給藥1、2、24、72和168 h后將其斷頭處死，取心、肝、脾、腎和肺等組織，用生理鹽水沖凈，濾紙吸干表面水分后精確稱重。臟器系數(shù)計(jì)算公式為：

臟器系數(shù)(%)=臟器質(zhì)量/大鼠體重×100%

(2)

1.5.3 組織生理切片

將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組注射AGN-DOTA-Gd(0.1mmol Gd3+·kg-1)，對照組注射相同劑量的生理鹽水。在給藥后第7天和第14天處死，取肝、脾、肺、腎和心放置于0.5%的甲醛溶液中固定，制作組織切片，用蘇木精-伊紅法(H&E)染色，用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 AGN-DOTA-Gd的合成與結(jié)構(gòu)表征

大分子造影劑AGN-DOTA-Gd的合成過程如圖1所示。天門冬氨酸和甘氨酸通過熱縮聚反應(yīng)得到氨基酸共聚物，共聚物中的琥珀酰亞胺部分發(fā)生開環(huán)，利用乙二胺作為間隔臂與DOTA進(jìn)行連接，最后與Gd3+絡(luò)合，經(jīng)過純化、凍干后，得到大分子配合物AGN-DOTA-Gd。

圖1 大分子造影劑AGN-DOTA-Gd合成路線示意圖

圖2 AG(a), AGN-DOTA(b)和AGN-DOTA-Gd(c)的紅外光譜圖

圖3 水質(zhì)子弛豫時(shí)間與不同濃度釓離子關(guān)系

2.2 體外弛豫性能測試

弛豫效率是評價(jià)MRI造影劑性能的一個(gè)重要指標(biāo)，通過測量弛豫時(shí)間(T1)計(jì)算順磁性造影劑弛豫效率(r1)，如式(3)所示。在臨床應(yīng)用中，正常部位與患病部位弛豫時(shí)間的差異形成了不同的成像信號，從而使患病部分得到區(qū)分。

(1/T1)obs=(1/T1)nh+r1[Gd]

(3)

式中：(1/T1)obs為觀測到有造影劑時(shí)溶液弛豫時(shí)間的倒數(shù)；(1/T1)nh為觀測到無造影劑時(shí)溶液弛豫時(shí)間的倒數(shù)；[Gd]為溶液中Gd3+的濃度。

根據(jù)式(3)計(jì)算得出，合成的順磁性大分子造影劑AGN-DOTA-Gd弛豫效率為10.82 mmol-1·L·s-1，明顯優(yōu)于臨床常用小分子造影劑Gd-DOTA(4.9 mmol-1·L·s-1)。這表明所合成的AGN-DOTA-Gd不僅可以滿足MRI造影劑高弛豫性能的基本要求，同時(shí)，可以減少患者的用藥量，降低藥物可能帶來的毒副作用。合成的AGN-DOTA-Gd表現(xiàn)出較高弛豫性能的原因可能包括：(1)小分子造影劑Gd-DOTA與聚氨基酸載體的共價(jià)結(jié)合延長了分子的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間，對提高弛豫效率起著關(guān)鍵作用；(2)連接聚氨基酸配體后，分子的疏水性能發(fā)生改變，可能影響配位水與自由水的交換速率，從而影響造影劑的弛豫效率[5, 16-19]。

2.3 動(dòng)物體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)

利用Wistar大鼠體內(nèi)的MRI實(shí)驗(yàn)評價(jià)了AGN-DOTA-Gd對于大鼠肝臟部位的信號增強(qiáng)作用。圖4為尾靜脈注射AGN-DOTA-Gd和Gd-DOTA后肝臟的成像增強(qiáng)效果隨時(shí)間的變化趨勢。由大鼠體內(nèi)的成像數(shù)據(jù)可知，AGN-DOTA-Gd對肝臟的成像增強(qiáng)效果明顯優(yōu)于Gd-DOTA，并且具有更長的成像窗口時(shí)間。AGN-DOTA-Gd對肝臟的最佳成像窗口時(shí)間為20～70 min，平均信號增加值約為Gd-DOTA的3.5倍。

合成的大分子造影劑AGN-DOTA-Gd對肝臟具有良好的成像增強(qiáng)效果，并且成像窗口時(shí)間較長，可能的原因有：(1)AGN-DOTA-Gd的分子量較高，分子尺寸大于Gd-DOTA，其穿過毛細(xì)血管壁時(shí)受到的阻礙更多，而且部分AGN-DOTA-Gd還可能與血清白蛋白結(jié)合，進(jìn)一步增大分子尺寸，延長循環(huán)時(shí)間;(2)共聚物載體中含有的天門冬氨酸和甘氨酸可以被肝臟蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)特異性識別，從而提高了對肝臟的選擇性;(3)AGN-DOTA-Gd可能在體內(nèi)發(fā)生降解，生成的小分子碎片可能擴(kuò)散到肝臟的間隙里，從而增強(qiáng)成像效果。此外，肝臟是血液的灌注器官，AGN-DOTA-Gd在血液中的T1效應(yīng)也可能影響肝臟的成像信號[13, 20-22]。

圖5為注射AGN-DOTA-Gd前(a)、30 min后(b)及60 min后(c)大鼠肝臟部位的T1加權(quán)像。由該圖可以直觀地看出，所合成的AGN為載體的大分子MRI造影劑具有優(yōu)異的肝臟成像效果。

圖5 尾靜脈注射AGN-DOTA-Gd前(a)、30 min后(b)和60 min后(c)大鼠肝臟部位T1加權(quán)像

2.4 安全性實(shí)驗(yàn)

通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)、大鼠臟器系數(shù)變化趨勢及組織生理切片等方法，對合成的大分子MRI造影劑AGN-DOTA-Gd進(jìn)行了安全性的初步評價(jià)。

2.4.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

圖6為AGN-DOTA-Gd和Gd-DOTA的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果。如圖所示，隨著Gd3+濃度的增加，Gd-DOTA組細(xì)胞存活率明顯下降。而AGN-DOTA-Gd組細(xì)胞存活率一直保持在較高水平，在釓離子濃度為750 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞的存活率仍大于70%。與臨床小分子造影劑Gd-DOTA相比，AGN-DOTA-Gd對細(xì)胞的損傷程度更小，具有優(yōu)異的生物相容性。

圖6 Gd-DOTA和AGN-DOTA-Gd的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 大鼠臟器系數(shù)分析

圖7為大鼠尾靜脈注射AGN-DOTA-Gd后，各器官臟器系數(shù)隨時(shí)間的變化趨勢。在給藥不同時(shí)間后，大鼠的心、肝、脾、肺、腎這五個(gè)重要器官的臟器系數(shù)均處于正常值范圍內(nèi)，說明合成的造影劑AGN-DOTA-Gd對大鼠的生長沒有明顯的影響，對各個(gè)主要器官?zèng)]有產(chǎn)生明顯的損傷，藥物的毒性較低，安全性較高。

圖7 臟器系數(shù)隨時(shí)間變化趨勢圖

2.4.3 組織生理切片

動(dòng)物組織的生理切片是一種常用的評價(jià)藥物毒性的方法，它可以在細(xì)胞層面上準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)藥物對機(jī)體的損傷。通過觀察給藥不同時(shí)間后大鼠的組織生理切片，研究合成的AGN-DOTA-Gd在動(dòng)物體內(nèi)的急性毒性。圖8為給藥7天后大鼠的心、肝、脾、肺和腎的生理切片。由圖中各細(xì)胞的形態(tài)可知，在注射臨床劑量的AGN-DOTA-Gd后，大鼠的各主要器官并未出現(xiàn)明顯異常。給藥后，心臟中心肌細(xì)胞生長正常，纖維排列有序。脾臟中細(xì)胞分布均勻，形貌完好，肺中肺泡均勻排列，無纖維化等情況發(fā)生。在主要代謝器官腎臟中，整體脈絡(luò)結(jié)構(gòu)清晰，腎小球等結(jié)構(gòu)正常。在主要成像器官肝臟中，肝細(xì)胞生長良好，分布緊密，細(xì)胞核等細(xì)胞器清晰可見。結(jié)合圖9可知，在給藥7天和14天后，肝細(xì)胞均未受到損傷。由此可以說明，合成的大分子MRI造影劑AGN-DOTA-Gd具有較低的毒性和較好的生物相容性。

圖8 尾靜脈注射AGN-DOTA-Gd后大鼠的組織生理切片

圖9 尾靜脈注射AGN-DOTA-Gd不同時(shí)間后大鼠肝臟的組織生理切片

3 結(jié) 論

合成了天門冬氨酸-甘氨酸共聚物為載體的大分子造影劑AGN-DOTA-Gd，體外弛豫性能測試表明，其弛豫性能明顯高于小分子造影劑Gd-DOTA。大鼠體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)說明AGN-DOTA-Gd具有良好的肝臟靶向成像效果，并且具有較長的成像窗口時(shí)間。初步的毒性評價(jià)證明其毒性較低，生物相容性優(yōu)異，具備進(jìn)一步開發(fā)的潛力。