惠寧軍,閆紅霞,葉義平,馬家富,周祥興

(梧州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 梧州 543000)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是臨床常見的創(chuàng)傷性疾病，常導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下發(fā)生截癱，同時帶來諸如肺炎、尿路感染、慢性腎炎和腎功能衰竭等嚴重并發(fā)癥，對患者身心造成巨大傷害[1-3]。據(jù)美國國家SCI統(tǒng)計中心統(tǒng)計，SCI美國發(fā)病率為53/100萬，并且每年預(yù)計增加1.7萬余人，不完全性截癱患者發(fā)生率為45%，且僅有0.4%的患者可以恢復(fù)正常[4]。SCI發(fā)生以后許多炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-10、IL-6及IL-4等呈高表達的趨勢，SCI發(fā)生以后損傷局部促進炎癥細胞釋放炎癥因子產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，促使損傷局部內(nèi)環(huán)境發(fā)生紊亂[5]，在SCI的神經(jīng)再生當中發(fā)生正面或者負面的影響。TNF-α通過趨化因子MIP-2的趨化作用激活中性粒細胞及單核細胞產(chǎn)生大量蛋白水解酶及氧自由基等破壞作用物質(zhì)，加重脊髓損傷的發(fā)生，在脊髓損傷炎癥的發(fā)生與表達中起重要作用[6-7]。本課題通過制作SCI大鼠模型，以PCR、WB技術(shù)檢測TNF-α、MIP-2基因及蛋白的表達，總結(jié)電針刺激對SCI大鼠的生物醫(yī)學(xué)作用，初步探討電針干預(yù)對SCI神經(jīng)修復(fù)的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗材料

1.1.1 實驗動物 本實驗經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(倫理批準號201712001)，實驗動物許可證號：SCXK桂2014-0002。實驗動物大鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)提供SPF級SD雌性大鼠共70只，體質(zhì)量180 g左右。

1.1.2 實驗材料 解剖剪-直(商品型號：S13005-14)、精細剪-尖頭(商品型號：S12012-12)、止血鉗-彎(商品型號：F23006-14)、不銹鋼微型血管夾(商品型號：R31005-10)、血管夾夾持器-配合不銹鋼微型血管夾(商品型號：R34001-14)、持針鉗-直(商品型號：F31031-15)、醫(yī)用縫針(商品型號：F33111-24)、縫線(商品型號：F34004-00)均選購于深圳瑞沃德生命科技有限公司；華佗牌電子針療儀(商品編號：30440175116)、華佗牌無菌針灸針(商品編號：30440175332)均由昆明康盛醫(yī)療器械有限公司提供。Brdu(antibody公司，貨號：66241-1-Ig)，注射用青霉素鈉(南京諾維贊，貨號：Q111-01)。

1.2 實驗大鼠分組

70只大鼠中64只隨機分為4組，即對照組、預(yù)標記組、損傷后標記組和足陽明胃經(jīng)電針干預(yù)組(以下簡稱電針組)，每組16只，剩余6只作為死亡大鼠備用。因為本課題組有檢測增殖細胞的必要，故需應(yīng)用Brdu腹腔注射作為增殖細胞的標記。①以標記損傷前保持分化增殖的細胞為目的，予對照組及預(yù)標記在操作前給予Brdu連續(xù)10 d腹腔注射，預(yù)標記組于第11天制作脊髓損傷模型，分別于第3天、10天、17天、24天取材，對照組于第11天行胸10節(jié)段椎板切除；②標記損傷后活化增殖的細胞為目的，給予電針組、損傷后標記組在制作脊髓損傷模型后連續(xù)10 d腹腔注射Brdu，電針組予足陽明胃經(jīng)足三里、伏兔穴電針干預(yù)，干預(yù)完畢后分別于損傷后3 d、10 d、17 d與24 d取材。

1.3 實驗大鼠造模

充分麻醉后行俯臥位，去毛消毒備皮，平剪剪開T9～11皮膚，切開約5 cm，逐步切開皮下筋膜、豎脊肌和脊間肌以充分暴露手術(shù)節(jié)段棘突、橫突、椎板和錐弓根等結(jié)構(gòu)，輕度彎曲脊柱，以T9～10椎間隙為突破口小心的咬掉T10椎板，慢慢咬至錐弓根直至椎體邊緣，術(shù)野中清晰的暴露硬脊膜包裹的脊髓，以微型血管夾夾閉脊髓，夾閉25 s以后松開，夾閉過程中如見大鼠尾巴左右擺動或者松開血管夾后見以肉眼可見淤血痕跡是為造模成功，具體實驗步驟見圖1所示。術(shù)后逐層縫合筋膜、肌肉和皮膚，為防感染術(shù)后3 d進行腹腔青霉素注射。

注：A實驗大鼠及器械；B暴露脊髓組織；C微型血管夾夾閉脊髓組織；D可見夾閉后的脊髓夾痕。

1.4 造模后大鼠的電針干預(yù)

足陽明胃經(jīng)電針干預(yù)組給予足三里及伏兔穴電針干預(yù)，穴位選取參考《實驗針灸學(xué)》[8]，針刺深度2 mm，電針選擇疏密波，刺激強度12～15 mV，留針時間30 min，每個周期連續(xù)干預(yù)5 d，周末2 d休息。對照組和預(yù)標記組、損傷后標記組不進行電針干預(yù)。

1.5 檢測方法

1.5.1 BBB評分 國際公認能精準的用于損傷后下肢運動功能評價[9]。

1.5.2 實時熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR) 將凍存脊髓組織用液氮浸潤研磨后，取100 μL樣本勻漿加入1 mL TRIzol提取總RNA，對RNA濃度進行測定，電泳檢測RNA純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。設(shè)計大鼠內(nèi)參GAPDH、TNF-α和MIP-2引物,詳見表1，按試劑盒操作說明配置體系后用ABI7500熒光定量PCR儀擴增。檢測結(jié)果采用2-△△Ct法進行處理，計算目的基因的相對內(nèi)參的表達量。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.3 Western blot(WB檢測) 將脊髓標本置于液氮并研磨提取組織蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，各標本蛋白樣品加上樣緩沖液；制備SDS-PAGE凝膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗共孵育(TNFα蛋白抗體稀釋比1∶400；MIP-2蛋白抗體稀釋比1∶200)、洗滌、二抗共孵育、顯影、凝膠成像儀成像、拍照記錄和灰度分析。以β-actin作為內(nèi)參計算相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組TNF-α、MIP-2基因mRNA表達量比較

TNF-α、MIP-2 mRNA在預(yù)標記組、損傷后標記組、電針組均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，不同時間點與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；第3天和第10天時，損傷后標記組mRNA表達高于預(yù)標記組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；17 d和24 d時，損傷后標記組mRNA表達略低于預(yù)標記組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與預(yù)標記組和損傷后標記組比較，電針組mRNA表達明顯降低，到24 d基本接近正常水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明在電針治療下，隨著損傷不同程度的修復(fù)，炎癥因子mRNA表達水平也逐漸恢復(fù)正常。詳見圖2～3、表2～3。

圖2 TNF-α擴增曲線圖

圖3 MIP-2擴增曲線圖

表2 不同時間點TNF-α mRNA表達量

表3 不同時間點MIP-2 mRNA表達量

2.2 各組TNF-α、MIP-2蛋白表達量比較

與對照組相比，TNF-α、MIP-2在預(yù)標記組、損傷后標記組和電針組均有一定程度的升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；損傷后標記組與預(yù)標記組比較，3 d和10 d時略高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；17 d和24 d時略低于預(yù)標記組，但是整體差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與預(yù)標記組和損傷后標記組相比，電針組整體明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。到24 d基本接近正常水平。說明在電針治療下，隨著損傷不同程度的修復(fù)，炎癥因子蛋白表達水平也逐漸恢復(fù)正常。詳見表4～5、圖4。

表4 不同時間點TNF-α蛋白表達量

表5 不同時間點MIP-2蛋白表達量

注：A為對照組；B為預(yù)標記組；C為損傷后標記組；D為電針組。

3 討論

SCI分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性脊髓損傷發(fā)生后，機體隨之出現(xiàn)包括缺血、缺氧、出血、水腫和炎癥等病理變化導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境發(fā)生紊亂[10-12]，局部組織缺血、缺氧導(dǎo)致血管活性物質(zhì)的釋放及脊髓血液灌流的改變被視為脊髓缺血而致再灌注損傷[13]。SCI發(fā)生后炎癥細胞產(chǎn)生的炎癥因子是繼發(fā)性SCI隨之發(fā)生的重要原因之一[14]。MIP-2通過與其受體CCR2結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子TNF-α刺激激活微型血管內(nèi)皮細胞的粘附因子的表達，從而激活單核細胞、中性粒細胞趨化因子產(chǎn)生，最終導(dǎo)致白細胞聚集、粘附加重損傷區(qū)域炎癥反應(yīng)，從而激活膠質(zhì)細胞，導(dǎo)致膠質(zhì)增生和膠質(zhì)瘢痕形成及繼發(fā)的毒性作用，最終導(dǎo)致脊髓組織炎性壞死[15-17]。潘宏等[18]在研究中指出電針刺激可能是通過參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的乙酰膽堿釋放的調(diào)控，激活細胞表面的a7亞單位的N型ACh受體(a7nAChR)，從而減少炎性TNF-α的釋放[19]。

脊髓損傷中醫(yī)古稱“體惰”，屬于“痿病”之范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》提出:“治痿獨取陽明”，并成為后世治痿準則，《素問·痿論》解釋了其機理：足陽明胃經(jīng)為五臟六腑之海，臟腑充盈，氣血運行通暢，則筋骨強、關(guān)節(jié)通利。所以《靈樞·根·結(jié)》有云：治療痿病，取之陽明?！白闳铩毖樽汴柮魑附?jīng)之合穴，是人體強壯大穴，針刺足三里可補益素體陽氣，增補氣血之虧損，具有調(diào)理脾胃、補益氣血和舒筋通絡(luò)之功，古人把“足三里”穴視為疾病治療要穴，《千金翼方·雜法第九》有言：凡一切疾病，皆可灸足三里；“伏兔”穴位于膝上6寸大腿外側(cè)，起于肉間，往下穿過皮膚筋膜后為股直肌，是為維持下肢功能主要肌肉，基于以上理論故針刺足陽明胃經(jīng)取“足三里”“伏兔”穴。針刺治療強調(diào)平衡氣血、調(diào)和陰陽，遵循的是補虛瀉實原則，故為治痿的主要方法，電針是在傳統(tǒng)中醫(yī)針刺的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種現(xiàn)代物理療法，通過電流波對針刺穴位進行刺激，電刺激通過膠原纖維實現(xiàn)信息及能量的傳輸，既保留了針刺作用又通過電信號傳導(dǎo)對患者的末梢直接發(fā)揮作用而促進神經(jīng)興奮，具有針刺刺激及電流刺激的雙重作用[20-22]。本研究為驗證電針刺激足陽明胃經(jīng)是否能對脊髓損傷局部組織驗證產(chǎn)生影響作用，通過采用造模穩(wěn)定的鉗夾法制作脊髓損傷大鼠模型并予電針干預(yù)足陽明胃經(jīng)穴位“足三里”“伏兔”穴。研究結(jié)果顯示實驗電針組MIP-2、TNF-α基因mRNA及蛋白的表達呈先上升后下降的趨勢，在第3、10、17天電針組對比未經(jīng)電針干預(yù)的對照組、預(yù)標記組和損傷后標記組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在電針干預(yù)進行到第24天時損傷區(qū)域MIP-2、TNF-α基因mRNA及蛋白的表達水平趨近對照組正常水平，結(jié)果顯示電針干預(yù)可以逐漸的減少MIP-2、TNF-α的表達水平，證明電針刺激可以通過減少損傷脊髓組織炎癥反應(yīng)，從而減少脊髓組織的壞死。

總之，本實驗研究通過SCI大鼠的TNF-α、MIP-2 mRNA及蛋白的表達證明電針可通過刺激足陽明胃經(jīng)之“足三里”“伏兔”穴減少TNF-α、MIP-2的釋放，促進SCI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。