劉錦容，詹 子，張?jiān)汽悾瑮罴覙s，謝麗平

（肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東 肇慶526238）

種蛋培養(yǎng)法是目前禽用疫苗抗原生產(chǎn)的主要方法，種蛋來源于種雞養(yǎng)殖場，在疫苗生產(chǎn)過程中需對其表面進(jìn)行消毒，以避免其表面微生物對抗原的污染。目前種蛋消毒方式主要為熏蒸消毒和浸泡消毒，熏蒸消毒主要是福爾馬林與高錳酸鉀配合使用，熏蒸消毒1h后要通風(fēng)24h，費(fèi)時費(fèi)力，殘留毒性不易去除，操作過程中危險性很大。另外福爾馬林與高錳酸鉀反應(yīng)劇烈，腐蝕性強(qiáng)，有很大的刺激性，對設(shè)備及種蛋的胚齡有一定的局限性。苯扎溴銨和碘制劑的浸泡消毒對潔凈的種蛋能達(dá)到較好的消毒效果，但對粘有糞便、血漬、墊料等污垢的種蛋易殘留病菌，消毒不徹底，浸泡時間過長還會破壞種蛋膠原質(zhì)層。近年來，過氧化氫協(xié)同殺菌效果的研究非?；钴S，研究結(jié)果顯示，過氧化氫與熱、紫外線、無機(jī)碘化物、超聲波、等離子體、金屬離子、表面活性劑、醇、季銨鹽和戊二醛等均有協(xié)同殺菌作用。但市面上多數(shù)過氧化氫產(chǎn)品在種蛋消毒效果上存在腐蝕性大的缺點(diǎn)，為達(dá)到高效環(huán)保的功效，自主研究了一款復(fù)方過氧化氫消毒劑，并在實(shí)驗(yàn)室殺菌試驗(yàn)和種蛋表面熏蒸消毒效果中驗(yàn)證其殺菌能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

自主研發(fā)復(fù)方過氧化氫消毒劑，組分含過氧化氫、過氧乙酸，水、還包括HEDP和苯扎溴銨。中和劑由50g/L硫代硫酸鈉、30g/L吐溫—80、3g/L卵磷脂、10g/L組氨酸組成的胰蛋白胨生理鹽水(TPS)溶液和CM Sephadex TM C—25分子篩柱。

試驗(yàn)菌包括大腸桿菌8099，金黃色葡萄球菌ATCC6538、銅綠假單胞桿菌ATCC15442、枯草桿菌黑色變種ATCC9372、蛋表面分離的白色念株菌和酵母菌。

試驗(yàn)蛋是來自種蛋場生產(chǎn)3d內(nèi)種蛋，熏蒸消毒設(shè)備為廣州東弘儀器開發(fā)有限公司空間滅菌系統(tǒng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同細(xì)菌殺滅試驗(yàn) 按規(guī)范要求，各菌取分純單個典型菌落，接種瓊脂培養(yǎng)基斜面，用24h培養(yǎng)的新鮮斜面培養(yǎng)物洗下后，再用胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)稀釋至試驗(yàn)所需含菌量的菌懸液。枯草桿菌黑色變種按規(guī)范規(guī)定的細(xì)菌芽孢制備程序制備成細(xì)菌芽孢懸液(操作步驟略)。然后參照2002版衛(wèi)生部《消毒劑技術(shù)規(guī)范》的試驗(yàn)測試方法要求在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行殺菌試驗(yàn)。

1.2.2 腐蝕性試驗(yàn) 設(shè)置復(fù)方過氧化氫，市場面過氧化氫產(chǎn)品以及注射用水對照組，按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB10124-88金屬材料實(shí)驗(yàn)室均勻腐蝕全浸試驗(yàn)方法，對不銹鋼腐蝕性進(jìn)行測定，記錄減輕情況。

1.2.3 種蛋表面消毒（1）分組 將試驗(yàn)試驗(yàn)組和對照組分為3組，每組150枚種蛋。試驗(yàn)組采用復(fù)方過氧化氫消毒按1：4稀釋后在孵化機(jī)內(nèi)霧化完后30min取出，霧化壓力0.3 MPa；用量為40mL/m3；對照組1采用20mg／m3濃度的臭氧，與試驗(yàn)組同等時間后取出；對照2組按照甲醛（40%）10mL／m3、高錳酸鉀5g／m3計(jì)算用量和注射用水10mL／m3，在孵化機(jī)內(nèi)進(jìn)行熏蒸，與試驗(yàn)組同等時間后取出；對照組3采用與試驗(yàn)組量相同的注射用水在孵化機(jī)內(nèi)霧化，與試驗(yàn)組同等時間后取出。（2）采樣 將置于蛋架上的150枚蛋全部取樣，消毒前用無菌棉拭沾取生理鹽水在蛋朝下表面2cm×2cm面積范圍內(nèi)反復(fù)涂擦3遍；消毒后用無菌棉拭沾取生理鹽水在蛋朝上表面2cm×2cm面積范圍內(nèi)反復(fù)涂擦3遍。（3）消毒效果觀察 將采樣后的棉拭子投入中和劑中，漩渦振蕩10～15s，取洗液用普通瓊脂法作傾注培養(yǎng)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)（37℃，24～48h），每組滅菌率取其平均數(shù)計(jì)算殺菌率。結(jié)果計(jì)算：殺菌率＝（消毒前菌數(shù)—消毒后菌數(shù)）/消毒前菌數(shù)100%

重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)6次，將以上結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果

從表1可以看出，復(fù)方過氧化氫消病毒對種蛋表面常見的細(xì)菌繁殖體、細(xì)菌芽孢、霉菌和霉菌孢子等微生物均能有效殺滅，最快殺滅時間達(dá)到1min。

表1 不同細(xì)菌完全殺滅時間

2.2 腐蝕性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，復(fù)方過氧化氫浸泡72h后不銹鋼片僅減輕0.001g，其減輕程度僅是市面上過氧化氫的0.33%。

表2 不銹鋼片浸泡后的重量變化

2.3 種蛋表面熏蒸消毒試驗(yàn)結(jié)果

從圖1可以看出，復(fù)方過氧化氫消毒液平均殺菌率達(dá)到99.90%，遠(yuǎn)高于臭氧消毒和甲醛熏蒸法（P＜0.01）。

圖1 不同消毒劑種蛋表面殺菌率

3 討論

過氧化氫是一種強(qiáng)氧化劑，其化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡瑯O易分解為氧氣和水，無殘留毒性，不會對環(huán)境造成二次污染，故被稱為最清潔的消毒劑。但過氧化氫屬于易制爆品，高濃度使用有爆炸風(fēng)險，同時對金屬腐蝕性較大。

過氧乙酸消毒劑是本領(lǐng)域常用的消毒劑，其具有廣譜性、殺毒作用強(qiáng)、消毒時間短、分解物無毒的優(yōu)點(diǎn)。中國專利申請CN201410311749.8公開了一種二元消毒劑，在其背景技術(shù)中指出，傳統(tǒng)的一元消毒劑采用8-羥基喹啉或尿素作為穩(wěn)定劑，但是該一元消毒劑儲存時間短且具有爆炸的風(fēng)險。

基于上述問題，中國專利申請CN201210209519.1公開了一種一元過氧乙酸消毒液及其制備方法，其采用基于多羥基多羧基多配位體結(jié)構(gòu)復(fù)合物的HWP綜合協(xié)作穩(wěn)定體系和特殊嵌段非離子表面活性劑作為穩(wěn)定組合物提高雙氧水和乙酸的混合后的過氧乙酸的儲存穩(wěn)定性，經(jīng)過測試表明，其儲存穩(wěn)定性優(yōu)，在8個月內(nèi)其儲存衰減不到4%。同時，其特殊嵌段非離子表面活性劑能夠降低消毒劑的表面張力，提高消毒劑的潤濕能力和滲透能力，使其殺菌效果更好。

本次實(shí)驗(yàn)制備的復(fù)方過氧化氫消毒劑中，苯扎溴銨是作為一種表面活性劑，除了能增加對細(xì)菌的通透性還能加強(qiáng)消毒劑的滲透性，同時也是一種廣譜殺菌劑，與過氧乙酸起到協(xié)同作用，特別對霉菌有較好的殺滅效果，HEDP在穩(wěn)定復(fù)合體系過程中，使過氧化氫和苯扎溴銨組合殺菌效果得到了顯著的提升。在殺菌試驗(yàn)中，以復(fù)方中過氧乙酸濃度100mg/L殺滅霉菌只需要2min；以復(fù)方中過氧乙酸濃度400mg/L殺滅枯草芽孢桿菌只需要10min，有效克服了臭氧和甲醛熏蒸無法完全殺滅該細(xì)菌的缺點(diǎn)。

在種蛋消毒應(yīng)用方面，目前種蛋消毒方式主要為熏蒸消毒和浸泡消毒，熏蒸消毒主要是福爾馬林與高錳酸鉀配合使用，熏蒸消毒1h后要通風(fēng)24h，費(fèi)時費(fèi)力，殘留毒性不易去除，操作過程中危險性很大。另外福爾馬林與高錳酸鉀反應(yīng)劇烈，腐蝕性強(qiáng)，有很大的刺激性，特別是對粘有糞便、血漬、墊料等污垢的種蛋易殘留病菌，消毒不徹底。

復(fù)方過氧化氫消毒劑應(yīng)用于種蛋表面消毒時，對種蛋表面的各種芽孢菌和霉菌、霉菌孢子等頑固微生物均有顯著作用效果，殺菌高效平均無菌率99.9%，相比傳統(tǒng)的甲醛熏蒸法具有優(yōu)越環(huán)保和安全性能，相對已有的過氧化氫消毒劑，消毒更加穩(wěn)定，而且大大減少了對設(shè)備的腐蝕，應(yīng)用性強(qiáng)。

通過對該復(fù)方過氧化氫消毒劑殺菌試驗(yàn)、種蛋表面熏蒸消毒試驗(yàn)表明，該消毒劑在較低濃度條件下可快速殺滅細(xì)菌繁殖體、芽孢和霉菌等，使用方便，性能穩(wěn)定，配方符合環(huán)保要求，且便于儲存和運(yùn)輸，具有較為廣闊的應(yīng)用前景。